动物细胞的融合与单克隆抗体课件

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1、 2002年月日， 两场筹备了10年的“太空婚礼”首次在神舟四号飞船上举行，植物细胞“新人”黄花烟草和革新一号烟草叶肉细胞原生质体，动物细胞“新人”是小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，两批新人同时在 “产房”电融合仪内孕育新生命。一段时间后，我国首批”太空娃娃”终于顺利诞生。对照实验结果表明，细胞融合率大大提高。STS“太空婚礼”动物细胞的融合与单克隆抗体神舟放飞强国梦神舟放飞强国梦动物细胞的融合与单克隆抗体“太空婚礼”科研项目一：“太空婚礼”科研项目二： 挑战自我植物体细胞杂交技术动物细胞融合技术动物细胞的融合与单克隆抗体温故而知新： 哪种植物细胞工程技术可以突破不同生物之间的生殖隔离，克服远缘杂

2、交不亲和的障碍，培育出新的作物类型？植物体细胞杂交技术你能回忆出植物体细胞杂交的过程吗？动物细胞的融合与单克隆抗体植物细胞A植物细胞B去掉细胞壁去掉细胞壁原生质体A原生质体B原生质体融合杂合的原生质体再生出细胞壁杂种细胞脱分化再分化愈伤组织杂种植株温故知新:植物体细胞杂交过程植物体细胞杂交过程动物细胞的融合与单克隆抗体植物细胞A植物细胞B去掉细胞壁去掉细胞壁原生质体A原生质体B原生质体融合杂合的原生质体再生出细胞壁杂种细胞细胞分裂分化发育愈伤组织杂种植株思考：1、动物细胞融合的概念是什么？ 2、动植物细胞在结构上有何区别？这对它们杂交或融合过程有什么影响？ 3、植物体细胞杂交诱导原生质体融合常

3、用的方法有哪些？那动物细胞融合呢？4、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？是什么原理？5、动物细胞融合有什么意义？主要应用在哪些方面？一、动物细胞融合一、动物细胞融合动物细胞的融合与单克隆抗体动物细胞A动物细胞B诱导、融合杂合的细胞有丝分裂2个完整的杂交细胞AB讨论：6、植物体细胞杂交可得到杂种、植物体细胞杂交可得到杂种植株，动物细胞融合后能象电影植株，动物细胞融合后能象电影上一样形成杂种动物个体吗上一样形成杂种动物个体吗?为什么？为什么？植物细胞A植物细胞B去掉细胞壁去掉细胞壁原生质体A原生质体B原生质体融合杂合的原生质体再生出细胞壁杂种细胞细胞分裂分化发育愈伤组织杂种植株动物

4、细胞的融合与单克隆抗体 1970 1970年，有两位科学家年，有两位科学家做了一个著名的实验：做了一个著名的实验：人人鼠细胞融合的实验，鼠细胞融合的实验，以证明细胞膜上的蛋白以证明细胞膜上的蛋白质分子是运动的。质分子是运动的。 人人鼠细胞是怎样实现鼠细胞是怎样实现融合的？动物细胞融合有什融合的？动物细胞融合有什么实践意义呢？么实践意义呢？动物细胞的融合与单克隆抗体一、一、动物细胞融合动物细胞融合1.1.细胞融合：细胞融合： 是指两个或两个以上的细胞融合为一个细胞的是指两个或两个以上的细胞融合为一个细胞的过程。过程。自然发生：自然发生： 受精卵受精卵人工诱导：人工诱导： 利用诱导剂诱导动物细胞融

5、合利用诱导剂诱导动物细胞融合 诱导因素：聚乙二醇、诱导因素：聚乙二醇、灭活的病毒灭活的病毒或电激等。或电激等。 动物细胞的融合与单克隆抗体鼠细胞人细胞人工诱导动物细胞融合杂交细胞动物细胞的融合与单克隆抗体仙台病毒仙台病毒紫外线紫外线灭活灭活丧失感染活性（不感染细胞）丧失感染活性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）保留融合活性（诱导细胞融合）什么是什么是病毒的灭活？病毒的灭活？ 灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。力，但是并不破坏病毒的抗原结构。灭活病毒诱导细胞融合的原理灭活病毒诱导细胞融合的原理 病毒表面含有的糖

6、蛋白和一些酶能够与细胞膜病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。细胞发生融合。动物细胞的融合与单克隆抗体 因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合 动物细胞的融合与单克隆抗体灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞膜

7、连接细胞融合，形成杂交细胞细胞融合，形成杂交细胞（细胞膜具有一定的流动性）（细胞膜具有一定的流动性）动物细胞的融合与单克隆抗体正在融合的正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞淋巴细胞与骨髓瘤细胞 正在融合的鸡正在融合的鸡血细胞血细胞动物细胞融合的原理：动物细胞融合的原理：细胞膜的流动性细胞膜的流动性动物细胞的融合与单克隆抗体 把两个不同的动物把两个不同的动物细胞放在一起，用灭活细胞放在一起，用灭活的病毒处理细胞，它们的病毒处理细胞，它们先发生质融合，再出现先发生质融合，再出现核融合，进而形成杂交核融合，进而形成杂交细胞。细胞。 融合后的杂交细胞融合后的杂交细胞经过有丝分裂后仍能形经过有丝分裂后仍能形成

8、两个完整的杂交细胞成两个完整的杂交细胞动物细胞的融合与单克隆抗体细胞膜的流胞膜的流动性性灭活病毒、活病毒、PEG、电激激等等融合后的融合后的细胞胞进行有行有丝分裂，分裂，形成完整的形成完整的杂交交细胞胞诱导的手段？诱导的手段？融合后细胞的类型？融合后细胞的类型？ABAB杂种细胞遗传物质杂种细胞遗传物质有什么特点？有什么特点？三种三种AA、ABAB、BB（A、B）含两种生物的含两种生物的遗传物物质动物细胞融合过程原理？原理？动物细胞的融合与单克隆抗体物理法的融合效率较高,且对细胞（原生质体）的伤害小,易操作、控制和观察。太空中处于失重状态，不同种细胞（原生质体）更容易亲近；为什么在太空中细胞（原

9、生质体）融合率会大大上升？为什么选用物理法诱导？动物细胞的融合与单克隆抗体2 2、动物细胞融合的应用、动物细胞融合的应用1.1.突破有性杂交方法的局限突破有性杂交方法的局限, ,使远缘杂交成为使远缘杂交成为可能。可能。2.2.成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。新品种培育等的重要手段。鼠鼠鸡、鼠鸡、鼠兔、鼠兔、鼠猴、人猴、人鼠、人鼠、人兔、兔、人人鸡、人鸡、人蛙、酵母菌蛙、酵母菌鸡鸡 、人、人胡萝卜等胡萝卜等3、重要用途：、重要用途：制备单克隆抗体制备单克隆抗体。动物细胞的融合与单克隆抗体获得杂种植株获得杂种植株物理、化学方法物理

10、、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒物理（离心、振物理（离心、振荡、电激）荡、电激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）直接诱直接诱导细胞融合导细胞融合去壁去壁原生质体原生质体融合融合诱诱导新壁导新壁杂种植株杂种植株细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性结果结果诱导方法诱导方法步骤步骤融合的原理融合的原理动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交比较项目比较项目植物、动物细胞融合的比较植物、动物细胞融合的比较获得杂交细胞获得杂交细胞小小结1动物细胞的融合与单克隆抗体【例例1】能使动物细胞融合的特有的诱导因子是能使动物细胞融合的特有的诱导因子是 （ ）A.离心离

11、心 B.灭活的病毒灭活的病毒 C.电刺激电刺激 D.振动振动【例例2】融合后的杂交细胞的遗传物质有何特点（融合后的杂交细胞的遗传物质有何特点（ ）A.具有原来两个或多个细胞的遗传信息具有原来两个或多个细胞的遗传信息 B.能无限增殖能无限增殖 C.可形成新个体可形成新个体 D.培养过程会贴壁培养过程会贴壁【例例3】动物细胞融合的作用中最重要的是（动物细胞融合的作用中最重要的是（ ）A.克服远源杂交不亲和克服远源杂交不亲和 B.制备单克隆抗体制备单克隆抗体 C.培育新物种培育新物种 D.生产杂种细胞生产杂种细胞 BBA动物细胞的融合与单克隆抗体使用相应的抗体检测乙肝病毒使用相应的抗体检测乙肝病毒抗

12、原抗原二、单克隆抗体的制备二、单克隆抗体的制备 医院一般怎样检测人体内是否存在乙肝病毒？医院一般怎样检测人体内是否存在乙肝病毒？乙肝病毒模式图乙肝病毒模式图乙肝病毒模式图乙肝病毒模式图 凡能够引起机体产生特异性凡能够引起机体产生特异性免疫应答的物质叫做抗原免疫应答的物质叫做抗原。1 1、什么是抗原？什么是抗原？ 例如花粉、病菌、病毒等。有时自身的组例如花粉、病菌、病毒等。有时自身的组织或细胞也会成为抗原，如癌细胞等。织或细胞也会成为抗原，如癌细胞等。动物细胞的融合与单克隆抗体抗原决定簇：抗原决定簇：抗原表面具有的某抗原表面具有的某些些特定的化学基团特定的化学基团，能决定抗原特异性能决定抗原特异

13、性，是免疫细胞识别抗是免疫细胞识别抗原的重要依据。原的重要依据。各种抗原的决定簇各种抗原的决定簇数目不同，同一抗数目不同，同一抗原的决定簇可能有原的决定簇可能有多种。多种。动物细胞的融合与单克隆抗体 2 2、什么是抗体？由何种细胞产生？主要分布在哪什么是抗体？由何种细胞产生？主要分布在哪里里?起何作用？起何作用？ 当机体受到抗原刺激剂后由效应当机体受到抗原刺激剂后由效应B B细胞（浆细细胞（浆细胞）产生的，并且能与该抗原发生胞）产生的，并且能与该抗原发生特异性结合特异性结合的具的具有免疫功能的球蛋白有免疫功能的球蛋白抗体。抗体。 抗体分布于血清中，也分布于组织液及外分泌抗体分布于血清中，也分布

14、于组织液及外分泌液中。液中。动物细胞的融合与单克隆抗体抗体与相应抗原特异性结合抗体与相应抗原特异性结合动物细胞的融合与单克隆抗体 抗体由何种细胞产生？主要分布在哪里抗体由何种细胞产生？主要分布在哪里?动物细胞的融合与单克隆抗体3、抗体的传统生产方法、抗体的传统生产方法：从从血血清清中中分分离离抗抗体体多多种种浆浆细细胞胞动动物物体体内内多多种种抗抗体体抗抗原原 动物细胞的融合与单克隆抗体动物细胞的融合与单克隆抗体血清抗体（也称多克隆抗体）血清抗体（也称多克隆抗体） 由由血清血清中提取的抗体是由不同淋巴细胞产生的中提取的抗体是由不同淋巴细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上，称为多种抗体的混

15、合物，可达百万种以上，称为多克隆多克隆抗体。抗体。特点：特点： 产量低、纯度低、特异性差、反应不够灵敏。产量低、纯度低、特异性差、反应不够灵敏。抗原不纯抗原不纯抗体不纯抗体不纯 抗原抗原 动物体内动物体内刺激刺激效应效应B B 抗体抗体动物细胞的融合与单克隆抗体 每一个每一个B B淋巴细胞只分泌一种淋巴细胞只分泌一种化学性质单一，化学性质单一，特异性强的抗体特异性强的抗体。 如果利用单个如果利用单个B B淋巴细胞进行无性繁殖（克隆）淋巴细胞进行无性繁殖（克隆），形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出，形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学化学性质单一性质单一、特异性强特异性强的抗体的抗体单

16、克隆抗体单克隆抗体。问题：问题： 怎样获得化学性质单一、特异性强的抗体呢？怎样获得化学性质单一、特异性强的抗体呢？动物细胞的融合与单克隆抗体在体外培养的条件下，一个在体外培养的条件下，一个B B淋巴细胞淋巴细胞能无限增殖形成细胞群吗？能无限增殖形成细胞群吗？什么样的细胞能够在体外无限增殖呢？什么样的细胞能够在体外无限增殖呢？ 肿瘤细胞！肿瘤细胞！动物细胞的融合与单克隆抗体 抗体抗体 抗原抗原 应答应答 抗体的不纯性抗体的不纯性 动物细胞受到抗原刺激动物细胞受到抗原刺激, ,引起免疫反应产生的球蛋白引起免疫反应产生的球蛋白. .不是自己的而又能引起免疫应答反应的物质就是抗原不是自己的而又能引起免

17、疫应答反应的物质就是抗原. .一种抗原有多种不同的决定簇一种抗原有多种不同的决定簇, ,刺激的是多种刺激的是多种B B细胞细胞, ,作用于作用于不同的不同的B B细胞后细胞后, ,会产生多种抗体会产生多种抗体, , 这是多克隆的这是多克隆的, , 故不纯故不纯! ! 4.4.制制制制备单备单克隆抗体的思路克隆抗体的思路克隆抗体的思路克隆抗体的思路 抗原抗原 B B细胞细胞浆细胞浆细胞 抗体抗体 刺激刺激动物细胞的融合与单克隆抗体怎么才能得到纯的抗体怎么才能得到纯的抗体? ?光纯还不行光纯还不行, ,还要大量还要大量. .怎么办怎么办? ?但，有但，有问题问题: :找，什么细胞能无限繁殖呢找，什

18、么细胞能无限繁殖呢? ?思路就出来了思路就出来了: :要想获单一的纯抗体要想获单一的纯抗体, ,就必须从一个就必须从一个B B细胞出发细胞出发. .让让B B细胞大量繁殖细胞大量繁殖( (克隆克隆) )就可以产生大量抗体了就可以产生大量抗体了. .B B细胞是不能无限繁殖的细胞是不能无限繁殖的. .怎么办怎么办? ?癌癌! ! 只有癌细胞只有癌细胞. . 但它不能产生抗体但它不能产生抗体. .癌细胞能无限繁殖癌细胞能无限繁殖, ,但不能产生抗体但不能产生抗体.B.B细胞能产生抗体细胞能产生抗体, ,但不能大但不能大量繁殖量繁殖. .融合呀融合呀! !只要将两个细胞融合即可互补只要将两个细胞融合

19、即可互补. .动物细胞的融合与单克隆抗体 5.5.技技技技术术思路的重点思路的重点思路的重点思路的重点杂交瘤细胞杂交瘤细胞 HAT筛选筛选McAbMcAb大量培养大量培养PEGPEG诱导细胞融合诱导细胞融合免免免免 疫疫疫疫B 脾脾矿物油矿物油矿物油矿物油骨髓瘤骨髓瘤瘤瘤 问题问题: : 在培养体系中在培养体系中, , 有有5 5种细胞种细胞. B. B细胞、瘤细胞细胞、瘤细胞, ,和杂交细胞。和杂交细胞。 我们还是拿不到我们还是拿不到McAb,McAb,怎么办怎么办? ? 筛选！筛出杂交瘤细胞。怎么筛筛选！筛出杂交瘤细胞。怎么筛? ? 又是一个思路问题。又是一个思路问题。 关关键键一一步步动

20、物细胞的融合与单克隆抗体动物细胞的融合与单克隆抗体如何诱导融合？如何诱导融合？ 加入聚乙二醇加入聚乙二醇（PEG）如何得到如何得到B B淋巴细胞？淋巴细胞？6.6.制备制备单克隆抗体的单克隆抗体的过程过程动物细胞的融合与单克隆抗体细胞两两融合后，有哪细胞两两融合后，有哪些类型？些类型？B-B B-B B-B-瘤瘤( (杂交瘤细胞杂交瘤细胞) ) 瘤瘤- -瘤瘤 如何筛选出杂交瘤细胞？如何筛选出杂交瘤细胞？ 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两

21、次筛选的原理和方法是不性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。相同的。 首先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞首先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞动物细胞的融合与单克隆抗体细胞合成细胞合成DNADNA有有D D和和S S两条途径，其中两条途径，其中D D途径能被氨途径能被氨基嘌呤阻断。基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种人淋巴细胞中有这两种DNADNA的合成途径，但一般的合成途径，但一般不分裂增殖。不分裂增殖。 鼠骨髓瘤细胞中只有鼠骨髓瘤细胞中只有D D途径，没有途径，没有S S途径，可是能途径，可是能不断分裂增殖。不断分裂增殖。 你想到筛选杂交瘤细胞的方案了么？你想到筛选杂交瘤细胞的方案了么？

22、 小资料：小资料：动物细胞的融合与单克隆抗体 在培养液中加入氨基蝶呤，收集增殖细胞！在培养液中加入氨基蝶呤，收集增殖细胞！ 加入氨基嘌呤后，使加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，仅有合成途径阻断，仅有 D 合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞因为可以利用淋巴细胞中的胞因为可以利用淋巴细胞中的 S 途径合成途径合成DNA而而增殖。增殖。动物细胞的融合与单克隆抗体动物细胞的融合与单克隆抗体 通常通常采用有限稀释克隆细胞的方法采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂

23、交瘤，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养，使细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养，使每孔细胞不超过一个，每孔细胞不超过一个，再由这些单细胞克隆生长，再由这些单细胞克隆生长，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。最终选出最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。再筛选出再筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞能分泌所需抗体的杂交瘤细胞动物细胞的融合与单克隆抗体阳性孔阳性孔方法方法方法方法抗原抗原抗原抗原- - -

24、-抗体杂交法抗体杂交法抗体杂交法抗体杂交法 在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。方法是不相同的。动物细胞的融合与单克隆抗体如何得到大量的单克隆抗体？如何得到大量的单克隆抗体？ 体内培养体内培养体外培养体外培养单克隆抗体单克隆抗体 化学性质单一、特异性强化学性质单一、特异性强动物细胞的融合与单克隆抗体动物细胞的融合与单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体筛筛筛筛选选选选杂交细胞杂交细胞杂交细胞杂交细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞体外或体内体外或体内体外或体内体外或体内细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养筛选筛选筛选筛

25、选骨髓瘤骨髓瘤骨髓瘤骨髓瘤细胞细胞细胞细胞诱导细胞融合诱导细胞融合诱导细胞融合诱导细胞融合特异性杂交瘤细胞特异性杂交瘤细胞特异性杂交瘤细胞特异性杂交瘤细胞杂交瘤细胞系杂交瘤细胞系杂交瘤细胞系杂交瘤细胞系提取提取提取提取经过免疫的经过免疫的经过免疫的经过免疫的B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞动物动物动物动物细胞细胞细胞细胞融合融合融合融合技术技术技术技术动物动物动物动物细胞细胞细胞细胞培养培养培养培养技术技术技术技术单单克克隆隆抗抗体体的的制制备备过过程程：特点：既能产生专一特点：既能产生专一特点：既能产生专一特点：既能产生专一抗体又能大量繁殖抗体又能大量繁殖抗体又能大量繁殖抗体又

26、能大量繁殖特点：特异性强灵敏特点：特异性强灵敏特点：特异性强灵敏特点：特异性强灵敏度高可大量制备度高可大量制备度高可大量制备度高可大量制备注射抗原注射抗原注射抗原注射抗原免疫免疫免疫免疫动物细胞的融合与单克隆抗体7 7、单抗隆抗体的应用、单抗隆抗体的应用作为诊断试剂作为诊断试剂定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病 用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，纯度高、纯度高、纯度高、纯度高、特异性强特异性强特异性强特异性强，具有，具有，具有，具有准确、高效、

27、简易、快速准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速的优点。的优点。的优点。的优点。用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾病和运载药物 利用同位素标记单抗，在特定组织成像利用同位素标记单抗，在特定组织成像利用同位素标记单抗，在特定组织成像利用同位素标记单抗，在特定组织成像 制成制成制成制成生物导弹生物导弹生物导弹生物导弹，将药物定向带到癌细胞所在的位置，将药物定向带到癌细胞所在的位置，将药物定向带到癌细胞所在的位置，将药物定向带到癌细胞所在的位置，在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。在原位杀死癌细胞，疗效

28、高、副作用小。单克隆抗体的优点：单克隆抗体的优点： 特异性强，灵敏度高，并可以大量制备。特异性强，灵敏度高，并可以大量制备。动物细胞的融合与单克隆抗体动物细胞的融合与单克隆抗体 动物细胞的融合与单克隆抗体用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾病和运载药物 特异性强、灵敏度高特异性强、灵敏度高 生物导弹生物导弹单克隆抗体抗癌药物单克隆抗体抗癌药物 疗效高、毒副作用小疗效高、毒副作用小 结合同位素的单抗结合同位素的单抗-生物导弹生物导弹动物细胞的融合与单克隆抗体结合同位素的单抗结合同位素的单抗-生物导弹生物导弹单抗单抗放射放射性同性同位素位素动物细胞的融合与单克隆抗体项目项目项目项目动物细胞融合动物细胞

29、融合动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交植物体细胞杂交植物体细胞杂交原理原理原理原理细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性和细胞膜的流动性和细胞膜的流动性和细胞膜的流动性和植物细胞的全能性植物细胞的全能性植物细胞的全能性植物细胞的全能性融合前提融合前提融合前提融合前提 分散成单个细胞分散成单个细胞分散成单个细胞分散成单个细胞去除细胞壁去除细胞壁去除细胞壁去除细胞壁诱导方法诱导方法诱导方法诱导方法 聚乙二醇、离心、振动、聚乙二醇、离心、振动、聚乙二醇、离心、振动、聚乙二醇、离心、振动、电激、电激、电激、电激、灭活病毒灭活病毒灭活病毒灭活病毒聚乙二醇

30、、离心、聚乙二醇、离心、聚乙二醇、离心、聚乙二醇、离心、振动、电激、振动、电激、振动、电激、振动、电激、结果结果结果结果获得杂种细胞或细胞产物获得杂种细胞或细胞产物获得杂种细胞或细胞产物获得杂种细胞或细胞产物 获得杂种植株获得杂种植株获得杂种植株获得杂种植株用途用途用途用途制备单克隆抗体制备单克隆抗体制备单克隆抗体制备单克隆抗体培育作物新品种培育作物新品种培育作物新品种培育作物新品种意义意义意义意义使远缘杂交成为可能使远缘杂交成为可能使远缘杂交成为可能使远缘杂交成为可能克服远缘杂交障碍克服远缘杂交障碍克服远缘杂交障碍克服远缘杂交障碍动物细胞的融合与单克隆抗体对比对比比较项目比较项目植物体细胞杂

31、交植物体细胞杂交单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备原理原理融合前处理融合前处理促融方法促融方法用途用途过过程程第一步第一步第二步第二步第三步第三步第四步第四步细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞膜的流动性、细胞细胞膜的流动性、细胞增殖增殖酶解法去壁酶解法去壁小鼠要免疫处理小鼠要免疫处理物理法化学法物理法化学法物理、化学、生物法物理、化学、生物法原生质体的制备原生质体的制备融合亲本细胞的准备融合亲本细胞的准备原生质体的融合原生质体的融合与筛选与筛选动物细胞融合与动物细胞融合与两次筛选两次筛选杂种细胞的形成与培养杂种细胞的形成与培养对产生特定抗体的杂交瘤细胞培养对产生特定抗体

32、的杂交瘤细胞培养杂种植株的鉴定杂种植株的鉴定单克隆抗体的分离提纯单克隆抗体的分离提纯单抗有助于疾病的诊断、治疗单抗有助于疾病的诊断、治疗 获得具优良性状的杂种植株获得具优良性状的杂种植株动物细胞的融合与单克隆抗体动物细胞工程小结动物细胞工程小结动物细胞培养：动物细胞培养：原理、营养、条件、过程、细胞原理、营养、条件、过程、细胞生长特点、结果、应用生长特点、结果、应用动物细胞融合：动物细胞融合：原理、诱导方法、过程、应用原理、诱导方法、过程、应用单克隆抗体的制备：单克隆抗体的制备：原理、过程、特点、应用原理、过程、特点、应用核移植与克隆动物：核移植与克隆动物：供体、受体、核移植方法、供体、受体、

33、核移植方法、克隆动物的方法、克隆动物的遗传特性、应用克隆动物的方法、克隆动物的遗传特性、应用 动、植物细胞工程的比较：动、植物细胞工程的比较：植物组培技术与动物植物组培技术与动物细胞培养技术、植物体细胞杂交技术与动物细胞细胞培养技术、植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术融合技术动物细胞的融合与单克隆抗体图中图中B为为_过程，过程，常用常用_作为诱导剂作为诱导剂，该细胞继承，该细胞继承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,又能又能_ 。B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC 1.下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，

34、设计的生下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的抗体实验方案产破伤风杆菌的抗体实验方案该实验方案的该实验方案的目是目是 ；AA是从小鼠的脾脏中取是从小鼠的脾脏中取得得_,_,该细胞能够该细胞能够产生产生 ；制备单克隆抗体制备单克隆抗体B B细胞细胞专一抗体专一抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌专一抗体分泌专一抗体无限增殖无限增殖动物细胞的融合与单克隆抗体单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备1 1 1 1、怎样获得能分泌专一抗体的、怎样获得能分泌专一抗体的、怎样获得能分泌专一抗体的、怎样获得能分泌专一抗体的B B B B淋巴细胞？

35、淋巴细胞？淋巴细胞？淋巴细胞？2 2 2 2、从何处获得较多的、从何处获得较多的、从何处获得较多的、从何处获得较多的B B B B淋巴细胞？淋巴细胞？淋巴细胞？淋巴细胞？3 3 3 3、用什么方法可以使、用什么方法可以使、用什么方法可以使、用什么方法可以使B B B B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？4 4 4 4、怎样筛选出杂交瘤细胞？、怎样筛选出杂交瘤细胞？、怎样筛选出杂交瘤细胞？、怎样筛选出杂交瘤细胞？5 5 5 5、筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体都一样吗？、筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体都一样吗？、筛选出的杂交瘤细胞产

36、生的抗体都一样吗？、筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体都一样吗？6 6 6 6、怎样获得只产生特异性抗体的杂交瘤细胞？、怎样获得只产生特异性抗体的杂交瘤细胞？、怎样获得只产生特异性抗体的杂交瘤细胞？、怎样获得只产生特异性抗体的杂交瘤细胞？7 7 7 7、怎样获得大量的单一抗体？、怎样获得大量的单一抗体？、怎样获得大量的单一抗体？、怎样获得大量的单一抗体？反复注射特定的抗原，免疫小鼠。反复注射特定的抗原，免疫小鼠。反复注射特定的抗原，免疫小鼠。反复注射特定的抗原，免疫小鼠。小鼠的脾脏小鼠的脾脏小鼠的脾脏小鼠的脾脏PEGPEG、灭活的病毒等、灭活的病毒等、灭活的病毒等、灭活的病毒等利用利用利用利用HAT

37、HAT选择培养基培养，筛选选择培养基培养，筛选选择培养基培养，筛选选择培养基培养，筛选否否否否用多孔细胞培养板培养，稀释度要用多孔细胞培养板培养，稀释度要用多孔细胞培养板培养，稀释度要用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。保证每个孔内不多于一个细胞。保证每个孔内不多于一个细胞。保证每个孔内不多于一个细胞。 抗原抗体杂交法检测抗原抗体杂交法检测抗原抗体杂交法检测抗原抗体杂交法检测呈阳性反应呈阳性反应呈阳性反应呈阳性反应体内或体外大量培养特异的杂交体内或体外大量培养特异的杂交体内或体外大量培养特异的杂交体内或体外大量培养特异的杂交瘤细胞，从中提取单一抗体。瘤细胞，从中提取单一抗

38、体。瘤细胞，从中提取单一抗体。瘤细胞，从中提取单一抗体。动物细胞的融合与单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体筛筛筛筛选选选选杂交细胞杂交细胞杂交细胞杂交细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞体外或体内体外或体内体外或体内体外或体内细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养筛选筛选筛选筛选骨髓瘤骨髓瘤骨髓瘤骨髓瘤细胞细胞细胞细胞诱导细胞融合诱导细胞融合诱导细胞融合诱导细胞融合特异性杂交瘤细胞特异性杂交瘤细胞特异性杂交瘤细胞特异性杂交瘤细胞杂交瘤细胞系杂交瘤细胞系杂交瘤细胞系杂交瘤细胞系提取提取提取提取经过免疫的经过免疫的经过免疫的经过免疫的B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞

39、动物动物动物动物细胞细胞细胞细胞融合融合融合融合技术技术技术技术动物动物动物动物细胞细胞细胞细胞培养培养培养培养技术技术技术技术单单克克隆隆抗抗体体的的制制备备过过程程：特点：既能产生专一特点：既能产生专一特点：既能产生专一特点：既能产生专一抗体又能大量繁殖抗体又能大量繁殖抗体又能大量繁殖抗体又能大量繁殖特点：特异性强灵敏特点：特异性强灵敏特点：特异性强灵敏特点：特异性强灵敏度高可大量制备度高可大量制备度高可大量制备度高可大量制备注射抗原注射抗原注射抗原注射抗原免疫免疫免疫免疫动物细胞的融合与单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞诱导诱导融合融合选择选择培养培

40、养杂交瘤杂交瘤细胞细胞克隆化克隆化培养培养抗体抗体检测检测产生所需产生所需抗体的杂抗体的杂交瘤细胞交瘤细胞体外培养体外培养小鼠腹腔内增殖小鼠腹腔内增殖单克隆抗体单克隆抗体多种杂多种杂交细胞交细胞1、该过程中用到了两种技程中用到了两种技术小小结2单克隆抗体的制备过程：单克隆抗体的制备过程：动物物细胞培养技胞培养技术动物物细胞融合技胞融合技术2、单克隆抗体的制克隆抗体的制备过程的三个程的三个“一一”：一种一种诱导细胞融合的新方法，产生了诱导细胞融合的新方法，产生了一种一种新细胞，得到了新细胞，得到了一种一种优势优势抗体。抗体。灭活病毒诱导融合灭活病毒诱导融合杂交瘤细胞杂交瘤细胞单克隆抗体单克隆抗体

41、优势：特异性强、灵敏度高，优势：特异性强、灵敏度高，可大量制备可大量制备动物细胞的融合与单克隆抗体两个过程两个过程动物细胞培养过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程三个三个“一一”一个诱导细胞融合的新方法一个诱导细胞融合的新方法 灭活病毒灭活病毒一个新细胞杂交瘤细胞一个新细胞杂交瘤细胞一个优势单克隆抗体特异性一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势强、灵敏度高的优势动物细胞的融合与单克隆抗体1975197519751975年年年年KohlerKohlerKohlerKohler和和和和MilsteinMilsteinMilsteinMilstein的单克隆抗体技术在生产和

42、使用的单克隆抗体技术在生产和使用的单克隆抗体技术在生产和使用的单克隆抗体技术在生产和使用抗体方面开创了新纪元，图抗体方面开创了新纪元，图抗体方面开创了新纪元，图抗体方面开创了新纪元，图10101010示单克隆抗体制备流程阶段示单克隆抗体制备流程阶段示单克隆抗体制备流程阶段示单克隆抗体制备流程阶段示意图。请据图回答下列问题：图示意图。请据图回答下列问题：图示意图。请据图回答下列问题：图示意图。请据图回答下列问题：图10101010（1 1 1 1）该技术是在动物细胞培养技术和）该技术是在动物细胞培养技术和）该技术是在动物细胞培养技术和）该技术是在动物细胞培养技术和 技术的基技术的基技术的基技术的

43、基础上发展起来的。础上发展起来的。础上发展起来的。础上发展起来的。（2 2 2 2）图）图）图）图10101010中细胞中细胞中细胞中细胞A A A A体外培养不具有体外培养不具有体外培养不具有体外培养不具有分裂能力，但能分泌分裂能力，但能分泌分裂能力，但能分泌分裂能力，但能分泌 ，细胞细胞细胞细胞B B B B体外培养能够体外培养能够体外培养能够体外培养能够 。（3 3 3 3）动物细胞融合常用的方）动物细胞融合常用的方）动物细胞融合常用的方）动物细胞融合常用的方法是法是法是法是 。图10（1 1）动物细胞融合（）动物细胞融合（）动物细胞融合（）动物细胞融合（2 2）分泌特异性抗体）分泌特异

44、性抗体）分泌特异性抗体）分泌特异性抗体 、无限增殖、无限增殖、无限增殖、无限增殖（3 3）PEGPEG（灭活的病毒、电刺激）（灭活的病毒、电刺激）（灭活的病毒、电刺激）（灭活的病毒、电刺激）动物细胞的融合与单克隆抗体（4 4 4 4）细胞融合是随机的过程，在）细胞融合是随机的过程，在）细胞融合是随机的过程，在）细胞融合是随机的过程，在HATHATHATHAT培养基中培养，要筛培养基中培养，要筛培养基中培养，要筛培养基中培养，要筛选出选出选出选出 细胞。在细胞培养过程中，为了促进细胞细胞。在细胞培养过程中，为了促进细胞细胞。在细胞培养过程中，为了促进细胞细胞。在细胞培养过程中，为了促进细胞摄取葡

45、萄糖，常向培养液中加入摄取葡萄糖，常向培养液中加入摄取葡萄糖，常向培养液中加入摄取葡萄糖，常向培养液中加入 （激素）。（激素）。（激素）。（激素）。 （5 5 5 5）培养）培养）培养）培养2 2 2 2周后，即测定培养细胞周后，即测定培养细胞周后，即测定培养细胞周后，即测定培养细胞的特征，筛选出的特征，筛选出的特征，筛选出的特征，筛选出 细细细细胞置于不同孔内（如图所示）培养。胞置于不同孔内（如图所示）培养。胞置于不同孔内（如图所示）培养。胞置于不同孔内（如图所示）培养。此操作前要将培养细胞稀释到此操作前要将培养细胞稀释到此操作前要将培养细胞稀释到此操作前要将培养细胞稀释到7 7 7 710

46、101010个细胞个细胞个细胞个细胞/ml/ml/ml/ml，每孔滴入，每孔滴入，每孔滴入，每孔滴入0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml细胞稀释液，其目的是细胞稀释液，其目的是细胞稀释液，其目的是细胞稀释液，其目的是 。（6 6 6 6）要获得大量的单克隆抗体，）要获得大量的单克隆抗体，）要获得大量的单克隆抗体，）要获得大量的单克隆抗体，可对获得的杂交瘤细胞进行可对获得的杂交瘤细胞进行可对获得的杂交瘤细胞进行可对获得的杂交瘤细胞进行 培养。培养。培养。培养。（4 4）杂交瘤、胰岛素（）杂交瘤、胰岛素（）杂交瘤、胰岛素（）杂交瘤、胰岛素（5 5）特异性分泌抗）特异性分泌抗）特异性分泌抗）特异

47、性分泌抗X X蛋白抗体的、保证每个蛋白抗体的、保证每个蛋白抗体的、保证每个蛋白抗体的、保证每个孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单一细胞培养以保孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单一细胞培养以保孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单一细胞培养以保孔内不多于一个细胞，达到单克隆培养的目的（单一细胞培养以保证抗体的纯度）、（证抗体的纯度）、（证抗体的纯度）、（证抗体的纯度）、（6 6）体外或体内）体外或体内）体外或体内）体外或体内动物细胞的融合与单克隆抗体 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程动物细胞的融合与单克隆抗体8.8.已知细胞合成已知细胞合成DNADNA有有 D D

48、和和 S S 两条途径，其两条途径，其中中D D途径能被氨基嘌呤阻断。途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有人淋巴细胞中有这两种这两种DNADNA的合成途径，但一般的合成途径，但一般DNADNA不分裂增殖。不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：二醇促融，获得杂种细胞。请回答： 试管中除融合的杂种细胞外，还有试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融种融合细胞合细胞 2 动物细胞的融合与单克隆抗体设计一方法（不考虑机械方法），从培养设计一方法

49、（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，并说原理。液中分离出杂种细胞，并说原理。 培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞。培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞。 加入氨基嘌呤后，使加入氨基嘌呤后，使 D D 合成途径阻断，合成途径阻断，仅有仅有 D D 合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞因为可以利用淋巴细细胞融合后的杂种细胞因为可以利用淋巴细胞中的胞中的 S S 途径合成途径合成DNADNA而增殖。而增殖。动物细胞的融合与单克隆抗体（1 1）融合后的杂种细胞容易成活

50、吗？）融合后的杂种细胞容易成活吗？（2 2）制备单克隆抗体的过程应用了哪些细胞工程）制备单克隆抗体的过程应用了哪些细胞工程技术手段？技术手段？ （3 3）在整个制备的过程中要经过几次筛选？在整个制备的过程中要经过几次筛选？思考思考：细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活细胞融合技术、细胞培养技术细胞融合技术、细胞培养技术 .筛选得到杂交瘤细胞，筛选得到杂交瘤细胞， .筛选先在多孔培养板上，在每孔只有筛选先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交一个杂交 瘤细胞瘤细胞下培养筛选出特异抗体的细胞群下培养筛选出特异抗体的细胞群动物细胞的融合与单克隆抗体怎样

51、筛选出怎样筛选出B B淋巴细胞和骨髓瘤细胞间融合所形淋巴细胞和骨髓瘤细胞间融合所形成的能产生特定抗体的杂交瘤细胞？成的能产生特定抗体的杂交瘤细胞？ 用抗体检测和克隆化培养得到能分泌所需抗体用抗体检测和克隆化培养得到能分泌所需抗体的杂种细胞的杂种细胞专一抗体检测专一抗体检测。 18.18.如何利用杂交瘤细胞来大量生产单克隆抗体？如何利用杂交瘤细胞来大量生产单克隆抗体？ 将杂交瘤细胞在将杂交瘤细胞在体外大规模培养体外大规模培养，从细胞培，从细胞培养液中就能提取大量的单克隆抗体；养液中就能提取大量的单克隆抗体； 把杂交瘤细胞注射到把杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖小鼠腹腔内增殖，再从小，再从小鼠腹腔中

52、提取单克隆抗体。鼠腹腔中提取单克隆抗体。动物细胞的融合与单克隆抗体如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？ 融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细

53、胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用抗体的细胞，通常用抗体的细胞，通常用抗体的细胞，通常用“ “有限稀释法有限稀释法有限稀释法有限稀释法” ”来选择。来选择。来选择。来选择。 将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试

54、验法），那些液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。 阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行性孔的细胞继续进

55、行有限稀释，一般需进行性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3 3 3 34 4 4 4次，直至次，直至次，直至次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。瘤细胞的克隆化培养。瘤细胞的克隆化培养。瘤细胞的克隆化培养。动物细胞的融合与单克隆抗体第二次筛选的原理和方法：第二次筛选的原理和方法：第二次筛选的原理和方法：第二次筛选的原理和方法： 在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，在实际免疫过程中，由于采用连续

56、注射抗原的方法，在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B B淋巴淋巴淋巴淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B B淋巴细胞的特异淋巴细胞的特异淋巴细胞的特异淋巴细胞的特异性是不同的，经性是不同的，经性是不同的，经性是不同的，经HATHAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性

57、也存培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。 通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多通常采用有限稀释

58、克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上几个杂交瘤细胞（理论上几个杂交瘤细胞（理论上几个杂交瘤细胞（理论上30%30%的孔中细胞数为的孔中细胞数为的孔中细胞数为的孔中细胞数为0 0时，才能时，才能时，才能时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，保证有些孔中是单个细胞），

59、再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。 动物细胞的融合与单克隆抗体思考与探究1.1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？什么不同？植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融然后再融合；动物细胞融合

60、是两个体细胞直接融合。合。 诱导融合方法不同：动物细胞诱导融合所用的方诱导融合方法不同：动物细胞诱导融合所用的方法比植物体细胞杂交多一类灭活的病毒诱导；结法比植物体细胞杂交多一类灭活的病毒诱导；结果不同：植物体细胞杂交培养成了杂种植株，而果不同：植物体细胞杂交培养成了杂种植株，而动物细胞融合只培养出了杂交细胞。动物细胞融合只培养出了杂交细胞。 动物细胞的融合与单克隆抗体2.2.制备单克隆抗体时，为什么要选用制备单克隆抗体时，为什么要选用B B淋巴细淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应

61、的B B淋巴细淋巴细胞，胞，B B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种原。动物在免疫反应的过程中，每一种B B淋巴细胞能淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的必须使能分泌该单一抗体的B B淋巴细胞大量增殖。淋巴细胞大量增殖。B B淋淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不

62、能产生抗体。限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种因此，把一种B B淋巴细胞淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性兼有两个亲本细胞的特性在体外培养条件下能不在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。 动物细胞的融合与单克隆抗体知识拓展知识拓展3 3.为什么不只用两个而要用多个细胞进行动物细胞为什么不只用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？间的融合？就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还

63、是生物的方法，其融合率都不可能是的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%100%。仅。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种

64、类可多达百万种以上，但是每一个种类可多达百万种以上，但是每一个B B淋巴细胞只分泌一淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B B淋巴细胞）和淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。 动物细胞的融合与单克隆抗体知识拓展知识拓展4 4.如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培

65、养？如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用的细胞，通常用“有限稀释法有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原（常用酶

66、联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行需进行3 34 4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。动物细胞的融合与单克隆抗体知识拓展知识拓展6 6.单倍体的诱导方法及应用价值单倍体的诱导方法及应用价值 单倍体（单倍体（haploid）是指具有配子染色体数目的个体。单）是指具有

67、配子染色体数目的个体。单倍体可以自发产生，也可以诱发产生。动物中（除蜜蜂、倍体可以自发产生，也可以诱发产生。动物中（除蜜蜂、白蚁等外）的单倍体，由于生理上不正常，在胚胎发育时白蚁等外）的单倍体，由于生理上不正常，在胚胎发育时期就会死亡。植物上自发产生单倍体的植物很多，如番茄、期就会死亡。植物上自发产生单倍体的植物很多，如番茄、棉花、咖啡、甜菜、大麦、小麦、油菜等，共有约棉花、咖啡、甜菜、大麦、小麦、油菜等，共有约10个科个科26个属个属36个种的植物可以自发产生单倍体。个种的植物可以自发产生单倍体。除了自发产生单倍体外，人工诱导产生单倍体的方法有：除了自发产生单倍体外，人工诱导产生单倍体的方法

68、有：（1）种间和属间杂交。由于远缘杂交，虽然不能受精，）种间和属间杂交。由于远缘杂交，虽然不能受精，但在远缘物种的花粉诱导下，卵细胞可以在未受精情况下但在远缘物种的花粉诱导下，卵细胞可以在未受精情况下发育成胚，这种情况在马铃薯、大麦、小麦、玉米中都可发育成胚，这种情况在马铃薯、大麦、小麦、玉米中都可以发生；以发生；（2）物理和化学诱变。花粉经射线照射或化学药品处理）物理和化学诱变。花粉经射线照射或化学药品处理失去受精能力，但仍可以刺激卵细胞发育成胚；失去受精能力，但仍可以刺激卵细胞发育成胚；（3）双生苗筛选。有些植物可以产生多胚种子，即）双生苗筛选。有些植物可以产生多胚种子，即23个胚共处于一

69、个种皮中，这样的种子可以形成单倍体植株；个胚共处于一个种皮中，这样的种子可以形成单倍体植株；（4）花药或花粉培养。单倍体具有很好的应用价值：在）花药或花粉培养。单倍体具有很好的应用价值：在植物育种上，单倍体经过加倍可以使后代迅速纯合，缩短植物育种上，单倍体经过加倍可以使后代迅速纯合，缩短育种年限；由于单倍体经加倍后，在理论上各基因位点应育种年限；由于单倍体经加倍后，在理论上各基因位点应处于纯合状态，对后代进行选择时，选择到的个体代表着处于纯合状态，对后代进行选择时，选择到的个体代表着真实的变异，避免了杂交育种中杂交优势对选择个体的干真实的变异，避免了杂交育种中杂交优势对选择个体的干扰，提高了选择效率；用单倍体作为转基因的受体，获得扰，提高了选择效率；用单倍体作为转基因的受体，获得的转基因材料经加倍后基因即可纯合，避免了体细胞作为的转基因材料经加倍后基因即可纯合，避免了体细胞作为受体，会由于后代分离需要多代选择的麻烦。目前以油菜受体，会由于后代分离需要多代选择的麻烦。目前以油菜小孢子作为转基因受体已得到转基因植株。小孢子作为转基因受体已得到转基因植株。 动物细胞的融合与单克隆抗体