《核酸分离纯化.PPT》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸分离纯化.PPT（64页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、2.2.基因组基因组DNADNA的分离与纯化的分离与纯化 第六章第六章 核酸的分离与纯化核酸的分离与纯化1.1.核酸分离纯化的原则核酸分离纯化的原则4.RNA4.RNA的分离与纯化的分离与纯化主要内容主要内容3.3.质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化1 核酸的分类、分布及意义核酸的分类、分布及意义概概 述述 核酸分离纯化的意义核酸分离纯化的意义 核酸的存在方式：核酸的存在方式：DNPDNP、RNPRNP 核酸的结构特征核酸的结构特征2Paper Towels核酸分离的技术路线核酸分离的技术路线1tissueSDSProtKPhenolChloroETOH pptSpin3第一节第一节
2、 核酸分离与纯化的原则核酸分离与纯化的原则 材料与方法的选择原则材料与方法的选择原则 技术路线的设计技术路线的设计 核酸的鉴定与保存核酸的鉴定与保存4 实验要求：实验要求： 1.1.质量高质量高: :完整性、产量、纯度和浓度符完整性、产量、纯度和浓度符合实验要求；合实验要求； 2. 2.方法好：简便快速、安全、经济；方法好：简便快速、安全、经济； 3. 3.标本易得标本易得: :血液、尿液、组织切块、培血液、尿液、组织切块、培养的细胞和细菌等。养的细胞和细菌等。一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择5 核酸完整性的保持：核酸完整性的保持： 1. 1.避免过酸和过碱环境，避免过酸和过碱环境，p
3、HpH在在4-104-10之间；之间； 2. 2.避免高温破坏，避免高温破坏，0-40-4 C C进行；进行； 3. 3.简化步骤，缩短时间，减少破坏；简化步骤，缩短时间，减少破坏； 4. 4.抑制抑制DNADNA酶和酶和RNARNA酶的活性酶的活性: :用用EDTAEDTA、柠、柠檬酸盐络合檬酸盐络合MgMg2+2+、CaCa2+2+等离子。等离子。6二、技术路线的设计二、技术路线的设计 核酸的释放：核酸的释放： 1.1.细胞破碎方法中机械剪切法不能用于细胞破碎方法中机械剪切法不能用于基因组基因组DNADNA的提取；的提取； 2. 2.非机械法常用化学试剂或酶细胞溶解非机械法常用化学试剂或酶
4、细胞溶解法。法。7 核酸的分离与纯化：核酸的分离与纯化： 1.1.除去蛋白质、多糖、脂除去蛋白质、多糖、脂类等大分子物质；类等大分子物质； 2. 2.除去非目的核酸组分：除去非目的核酸组分： 3. 3.除去实验溶液和试剂：除去实验溶液和试剂： 8 核酸的浓缩、沉淀与洗涤：核酸的浓缩、沉淀与洗涤： 1.1.浓缩：提高样品浓度；浓缩：提高样品浓度； 2. 2.沉淀：常用的浓缩方法，如醋酸沉淀：常用的浓缩方法，如醋酸钠、醋酸铵等钠、醋酸铵等 3. 3.洗涤：除去共沉淀的盐，常用洗涤：除去共沉淀的盐，常用70%-75%70%-75%的乙醇。的乙醇。 9三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存 浓度鉴定
5、：浓度鉴定： 1. 1. 紫外分光光度法：紫外分光光度法： 原理：紫外吸收特性原理：紫外吸收特性 粗略定量：粗略定量：1 OD1 OD相当于相当于 50 50 g/mlg/ml双链双链DNADNA， 38 38 g/mlg/ml单链单链DNADNA或单链或单链RNARNA，3333 g/mlg/ml单链寡聚核苷酸单链寡聚核苷酸； 准确定量：摩尔消光系数法计算准确定量：摩尔消光系数法计算 盐溶液的影响：测定盐溶液的影响：测定A A310310校正校正 适用浓度：大于适用浓度：大于 0.25 0.25 g/mlg/ml 10 2. 2. 荧光光度法：荧光光度法： 原理：荧光染料溴化乙锭（原理：荧光
6、染料溴化乙锭（ethidium bromide EBethidium bromide EB）嵌）嵌入碱基平面，在紫外光的激发下产生橙红色荧光入碱基平面，在紫外光的激发下产生橙红色荧光 粗略定量：与分子量标准物对比；粗略定量：与分子量标准物对比； 准确定量：荧光分光光度计，灵敏度达准确定量：荧光分光光度计，灵敏度达1-5ng/ml1-5ng/ml 其它荧光染料：其它荧光染料：SYBR goldSYBR gold，灵敏度达，灵敏度达20pg/ml20pg/ml； SYBR GreenISYBR GreenI等等 适用浓度：大于适用浓度：大于 0.25 0.25 g/mlg/ml 11 纯度鉴定：纯
7、度鉴定： 1. 1. 紫外分光光度法：紫外分光光度法： 原理：蛋白质和核酸紫外吸收特性的差异原理：蛋白质和核酸紫外吸收特性的差异 12 纯度鉴定：纯度鉴定： 1. 1. 紫外分光光度法：紫外分光光度法： 原理：蛋白质和核酸紫外吸收特性的差异原理：蛋白质和核酸紫外吸收特性的差异 纯纯DNADNA：A A260260/A/A280280=1.8=1.8，纯，纯RNARNA：A A260260/A/A280280=2.0=2.0； 比值降低：蛋白质污染（比值降低：蛋白质污染（280280）、酚污染（）、酚污染（270270） 比值升高：比值升高：DNADNA变性、变性、RNARNA污染污染 混合污染
8、：比值正常混合污染：比值正常 缓冲液的影响：在缓冲液的影响：在TETE缓冲液和水、缓冲液和水、TrisTris等缓冲液中的等缓冲液中的比值有变化，应注意校正。比值有变化，应注意校正。 13核酸的紫外吸收特性核酸的紫外吸收特性 220 240 260 280 300消光系数 A260 A280=1.6-1.8AGCTU核酸的最大吸收峰在=260nm蛋白质的最大吸收峰在=280nm酚的最大吸收峰在=270nm 纯度鉴定纯度鉴定1.1.紫外法：紫外法： 蛋白质和核酸紫外吸收特性的差异蛋白质和核酸紫外吸收特性的差异 14 2. 2. 荧光光度法：荧光光度法： 原理：凝胶电泳观察图谱原理：凝胶电泳观察图
9、谱 RNA RNA电泳图谱：原核生物电泳图谱：原核生物5S5S、16S16S、23S23S三条带；三条带；真核生物：真核生物：5S5S和和5.8S5.8S、18S18S、28S28S三条带；三条带； DNA DNA分子大，迁移率小分子大，迁移率小 15 完整性鉴定：完整性鉴定： 1. 1. 凝胶电泳法：凝胶电泳法： 根据电泳条带的数目、位置和形状判定根据电泳条带的数目、位置和形状判定 RNA RNA分子可以通过荧光强度积分来判定有无降解。分子可以通过荧光强度积分来判定有无降解。 2. 2.其它方法：逆转录法、核酸杂交、芯片检测等。其它方法：逆转录法、核酸杂交、芯片检测等。 16Sample W
10、ell 25 ng 1 kb ladder0.8% Agarose124681012kbAgarose Gel ElectrophoresisSybergold Detection Limit: 0.2-0.5 ng DNAEtBr Detection Limit: 5-10 ng DNA17Results of Southern BlotControl TissueCancer TissueBRCA3EcoRIEcoRI18 核酸的保存：核酸的保存： 1. DNA1. DNA的保存：的保存：-70-70 C C，TETE缓冲液中数年，加入氯缓冲液中数年，加入氯仿可防止污染仿可防止污染 原理：
11、原理： 2.RNA 2.RNA的保存：的保存： -70 -70 C C，醋酸钠溶液或焦碳酸二乙酯，醋酸钠溶液或焦碳酸二乙酯（DEPCDEPC）溶液中，较长期保存。）溶液中，较长期保存。19第二节第二节 基因组基因组DNADNA的分离与纯化的分离与纯化 基因组基因组DNADNA的特点：的特点： 1. 1. 分子大，容易断裂分子大，容易断裂 2. 2.容易污染其它来源的容易污染其它来源的DNADNA分离纯化方法：分离纯化方法：1.1.酚抽提法酚抽提法2.2.甲酰胺解聚法甲酰胺解聚法3.3.玻棒缠绕法玻棒缠绕法4.4.异丙醇沉淀法异丙醇沉淀法20基因组D NA分离纯化技术路线生物体组织生物体组织细胞
12、裂解细胞裂解酚抽提法酚抽提法玻棒缠绕法玻棒缠绕法甲酰胺解聚法甲酰胺解聚法DNA粗制品粗制品电泳分离特定电泳分离特定DNA片段片段21盐析法沉淀盐析法沉淀有机溶剂抽提法有机溶剂抽提法乙醇沉淀洗涤乙醇沉淀洗涤基因组基因组DNA纯品纯品凝胶中特定凝胶中特定DNA片段片段22酚抽提法酚抽提法tissueSDSProtKPhenolChloroETOH pptSpin23DNADNA样品的纯化：样品的纯化： 1. 1. 分子大，容易断裂分子大，容易断裂 2. 2.容易污染其它来源的容易污染其它来源的DNADNA纯化方法：纯化方法：1.1.透析透析2.2.层析层析3.3.选择性沉淀选择性沉淀4.4.凝胶电
13、泳凝胶电泳24Agarose Gel Electrophoresis_+3片段回收25回收方法：回收方法：1.DEAE1.DEAE纤维素膜插片电泳纤维素膜插片电泳2.2.转膜电泳法、透析袋电泳法转膜电泳法、透析袋电泳法3.3.凝胶洗脱法凝胶洗脱法4.4.冷冻挤压法冷冻挤压法5.5.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法6.6.回收试剂盒：以硅为基础回收试剂盒：以硅为基础+片段回收26（一）细菌的培养（一）细菌的培养1.菌种的选择菌种的选择:大肠埃希菌大肠埃希菌 2.培养基的选择培养基的选择:L-B培养基培养基 3.筛选标记的确定筛选标记的确定:抗生素抗生素 4.生长状态的确定生长
14、状态的确定:对数生长期，测定对数生长期，测定OD600达达0.4-0.6之间之间 第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取与纯的提取与纯一、概一、概 况况27（二）细菌的收获和裂解（二）细菌的收获和裂解1.细菌的收获：离心，小量制备用细菌的收获：离心，小量制备用1-1.2ml，大量制备用大量制备用100-150ml 2.细菌的裂解：可以用非离子型或离子型去污细菌的裂解：可以用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于个因素：质粒的大小、小择哪一种方法取决于个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒肠杆菌菌
15、株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。的技术。 28 大质粒大质粒(大于大于15kb)：容易受损，故应容易受损，故应采用温和裂解法。将细菌悬于蔗糖等渗溶采用温和裂解法。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和液中，然后用溶菌酶和EDTA处理，破坏处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污一类去污剂溶解球形体。剂溶解球形体。29 小质粒：小质粒：在加入在加入EDTAEDTA后，有时也加入溶后，有时也加入溶菌酶，让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱菌酶，让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线
16、状染色体故可使宿主的线状染色体DNADNA变性，但闭环质变性，但闭环质粒粒DNADNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒开。当条件恢复正常时，质粒DNADNA链迅速得到链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。30( (三三) )质粒质粒DNADNA的纯化的纯化原理：质粒原理：质粒DNADNA相对较小；共价闭合环状相对较小；共价闭合环状 方法：用氯化铯方法：用氯化铯- -溴化乙锭梯度平衡离心：溴化乙锭梯度平衡离心： ( ( 每个碱基对大约结合个溴化乙锭分子每个碱基对大约结合个溴化乙锭分子
17、) ) 。31 缺点：昂贵又费时缺点：昂贵又费时 替代方法：离子交换层析、凝胶过滤层析替代方法：离子交换层析、凝胶过滤层析度的质粒。另外，现在已可买到现成的纯化度的质粒。另外，现在已可买到现成的纯化KITKIT。32二、质粒二、质粒DNADNA的小量制备的小量制备基本步骤：基本步骤：1.1.细菌的收获和裂解细菌的收获和裂解收获收获2.2.碱裂解法碱裂解法3.3.煮沸裂解煮沸裂解4.4.质粒小量制备的问题与对策质粒小量制备的问题与对策33质粒的小量制备可采用下述的碱裂质粒的小量制备可采用下述的碱裂解法或煮沸法解法或煮沸法（一）细菌的收获和裂解（一）细菌的收获和裂解收获收获）将）将2ml2ml含相
18、应抗生素的含相应抗生素的- -加入到容量为加入到容量为15ml 15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于入一单菌落，于3030剧烈振摇下培养过夜。剧烈振摇下培养过夜。）将）将1.5ml1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于离心机于44以以12000g12000g离心离心3030秒，将剩余的培养秒，将剩余的培养物贮存于物贮存于44。34）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽
19、吸，并用吸头头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。过抽真空除去附于管壁的液滴。35）将细菌沉淀，所得重悬于）将细菌沉淀，所得重悬于100l100l用冰预冷的溶液用冰预冷的溶液中，剧烈振荡。中，剧烈振荡。溶液：溶液：50mmol/L50mmol/L葡萄糖；葡萄糖；25mmol/LTris-25mmol/LTris-HCl(pH8.0)HCl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)
20、溶液可成批配制，每瓶约溶液可成批配制，每瓶约100ml,100ml,在在10lbf/in2(6.895104Pa) 10lbf/in2(6.895104Pa) 高压下蒸气灭菌高压下蒸气灭菌1515分钟，分钟，贮存于贮存于44。须确使细菌沉淀在溶液中完全分散，。须确使细菌沉淀在溶液中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。迅速分散。一、碱裂解法一、碱裂解法 36）加）加200l200l新配制的溶液新配制的溶液。溶液溶液0.2mol/L NaOH0.2mol/L NaOH（临用前用（临用前用10mol/L10mol/L贮存液现
21、用现稀释）贮存液现用现稀释）1%SDS1%SDS盖紧管口，快速颠倒离心管次，以混合内容物。应确盖紧管口，快速颠倒离心管次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面保离心管的整个内表面均与溶液均与溶液接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。）加）加150l150l用冰预冷的溶液用冰预冷的溶液 溶液溶液5mol/5mol/乙酸钾乙酸钾 60ml 60ml冰乙酸冰乙酸 11.5ml 11.5ml37水水 28.5ml 28.5ml所配成的溶液对钾是所配成的溶液对钾是3mol/L3mol/L，对乙酸根是，对乙酸根是5mol/L5mol/L。盖紧管口，将管倒置后和地振荡盖紧
22、管口，将管倒置后和地振荡1010秒钟溶液秒钟溶液在粘稠在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，置于冰上分钟。的细菌裂解物中分散均匀，置于冰上分钟。）用微量离心机于）用微量离心机于412 000g412 000g离心离心5 5分种，将上清分种，将上清转移到另一离心管中。转移到另一离心管中。）加等量酚：氯仿，）加等量酚：氯仿， 振荡混匀，振荡混匀， 用微量离心机于用微量离心机于4 4 以以12000g12000g离心分钟，将上清转移到另一管中。离心分钟，将上清转移到另一管中。 有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐由
23、于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的受限制酶切反应的DNADNA。38）用倍休积的乙醇于室温沉淀双锭）用倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNADNA。振荡混。振荡混合，合， 于室温放置分钟。于室温放置分钟。）用微量离心机于）用微量离心机于44以以12 000g12 000g离心分钟。离心分钟。）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触
24、液面。当液体从管中吸出时，尽量连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。去附于管壁的液滴。）用）用1ml70%1ml70%乙醇于乙醇于44洗涤双链洗涤双链DNADNA沉淀，按步骤沉淀，按步骤398 8）所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥）所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥1010分钟。分钟。i.i.此法制备的高拷贝数质粒（如此法制备的高拷贝数质粒（如f3f3或或pUCpUC），其产），其产量一般约为：每毫升原细菌培养物量一般约为：每毫升原细菌培养物3 35g5g。iii
25、i如果要通过限制酶切割反应来分析如果要通过限制酶切割反应来分析DNADNA，可取，可取1l DNA1l DNA溶液加到另一含溶液加到另一含ll水的微量离心管内，水的微量离心管内，加加1l 101l 10限制酶缓冲液和单位所需限制酶，限制酶缓冲液和单位所需限制酶， 在在适宜温育适宜温育1 12 2小时。将剩余的小时。将剩余的DNADNA贮存于贮存于2020。iii.iii.此方法按适当比例放大可适用于此方法按适当比例放大可适用于100ml100ml细菌培养细菌培养物：物： 40）将细菌沉淀，所得重悬于）将细菌沉淀，所得重悬于350lSTET350lSTET中。中。STETSTET0.1mol/L
26、 NaCL0.1mol/L NaCL10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)5% Triton X-1005% Triton X-100）加）加25l25l新配制的溶菌酶溶液新配制的溶菌酶溶液10mg/ml,10mg/ml,用用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制配制 ，振荡，振荡3 3秒钟以混秒钟以混匀之。如果溶淮中匀之。如果溶淮中pHpH低于低于8.08.0，溶菌酶就不能有效，溶菌酶就不能有效发挥作用。发
27、挥作用。二、煮沸裂解二、煮沸裂解 41）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为4040秒。秒。）用微量离心机于室温以）用微量离心机于室温以12 000g12 000g离心离心1010分种。分种。）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。）在上清中加入）在上清中加入40l 5mol/L40l 5mol/L乙酸钠（乙酸钠（pH5.2pH5.2）和和420l420l异丙醇，振荡混匀，于室温放置异丙醇，振荡混匀，于室温放置5 5分钟。分钟。）用微量离心机于）用微量离心机于44以以12 000g12 000g离心离心5 5分种，回分种
28、，回收核酸沉淀。收核酸沉淀。42 ）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。滴。）加）加1ml 701ml 70乙醇，于乙醇，于44以
29、以12 000g12 000g离心分离心分钟。钟。431010）按步骤）按步骤8 8）所述再次轻轻地吸去上清，这一步）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（2 25 5）分钟。）分钟。1111）用）用50l50l含无含无DNADNA酶的胰酶的胰RNARNA酶（酶（20g/ml20g/ml）的）的TE(pH8.0)TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮存于溶解
30、核酸稍加振荡，贮存于-20-20。44两个问题：两个问题：）质粒质粒DNADNA不能被限制酶所切割：不能被限制酶所切割：因酚：氯仿残因酚：氯仿残留，可用离心柱层析注纯化留，可用离心柱层析注纯化DNADNA。质粒小量制备的问题与对策质粒小量制备的问题与对策45）无质粒无质粒DNADNA的现象：的现象：核酸沉淀颗核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。粒已同乙醇一起被弃去。46第四节第四节RNA RNA 的分离与纯化的分离与纯化 RNA RNA的特点：的特点： 1. 1. 分子小，种类多，变化大分子小，种类多，变化大 2. 2.容易受容易受RNaseRNase降解降解分离纯化方法：分离纯化方法：1.1.异
31、硫氰酸胍异硫氰酸胍- -酚氯仿一步法酚氯仿一步法2.2.单相裂解试剂法单相裂解试剂法3.3.硫氰酸胍硫氰酸胍-CsCl-CsCl超速离心法超速离心法4.4.盐酸胍有机溶剂法盐酸胍有机溶剂法47 该方法适用于：该方法适用于：. .培养的单层哺乳动物细胞培养的单层哺乳动物细胞. .悬浮培养的哺乳动物细胞悬浮培养的哺乳动物细胞. .易于分散成单个细胞的哺乳动物组织易于分散成单个细胞的哺乳动物组织不适用于：不适用于：不适用于从固体组织中提取不适用于从固体组织中提取RNARNA因因为用在为用在SDSSDS存在的条件下用蛋白酶存在的条件下用蛋白酶K K消化组织速度很消化组织速度很慢，导致内源性慢，导致内源
32、性RNARNA酶在被蛋白酶酶在被蛋白酶K K消化或被抑制剂消化或被抑制剂灭活前有时间发挥作用。灭活前有时间发挥作用。异硫氰酸胍法异硫氰酸胍法48用用异硫氰酸胍和有机溶剂提取异硫氰酸胍和有机溶剂提取收集细胞，离心收集细胞，离心5000r/min 5000r/min ，5 5分钟，弃分钟，弃上清，加入异硫氰酸胍变性沉淀蛋白和上清，加入异硫氰酸胍变性沉淀蛋白和DNA.DNA.（异硫氰酸胍（异硫氰酸胍4mol/L4mol/L；柠檬酸钠；柠檬酸钠25mmol/L25mmol/L，Sarkosy10.5%,-Sarkosy10.5%,-巯基乙醇巯基乙醇0.1mol/L0.1mol/L）有机溶剂：有机溶剂：
33、醋酸钠，水饱和酚和氯仿醋酸钠，水饱和酚和氯仿/ /异戊醇异戊醇异硫氰酸胍溶液：异硫氰酸胍溶液：49得率：得率：对大多数细胞株来说，对大多数细胞株来说， 一个直径一个直径90mm 90mm 培养基中培养的培养基中培养的RNARNA收率为收率为100-200g100-200g。 50. .最早采用的裂解缓冲液含有最早采用的裂解缓冲液含有0.015 0.015 （W/VW/V）的）的MacaloidMacaloid（硅藻土）（硅藻土），用于吸附并灭活，用于吸附并灭活RNARNA酶。酶。 现在现在氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物和和RNARNA酶的蛋白质抑制剂酶的蛋白质抑制剂更常用。更常用。技术要
34、点：技术要点：51. .结果分析结果分析：测定最终所得溶液的测定最终所得溶液的OD260OD260值可值可以确定以确定RNARNA的浓度。取的浓度。取10l10l乙醇乙醇/TE/TE混合液离心沉淀混合液离心沉淀RNARNA，以，以400l400l水重溶，水重溶， 测定测定OD260 OD260 值，值， OD260 OD2601 1的的RNARNA溶液每毫升约含溶液每毫升约含40g RNA40g RNA。如果需要，可用如果需要，可用oligo(dT)oligo(dT)纤维素层析法从所纤维素层析法从所制备的细胞总制备的细胞总RNARNA中纯化无寡脱氧核糖核苷酸污染的中纯化无寡脱氧核糖核苷酸污染的
35、mRNAmRNA或购买试剂盒进行或购买试剂盒进行mRNAmRNA的纯化。的纯化。521.1.释放的释放的RNARNA酶的活性酶的活性 2. 2.污染污染RNARNA酶酶RNA酶活性的控制酶活性的控制53 外源性外源性RNARNA酶的污染途径酶的污染途径（）玻璃制品、塑料制品和电泳槽（）玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无使用的塑料制品基本上无RNARNA酶，可以不经预处理直酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存接用于制备和贮存RNARNA。实验室用的普通玻璃器皿和。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有塑料制品经常有RNARNA酶法染，使用前必须于酶法染，使
36、用前必须于180 180 干干烤小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗烤小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。（塑料制品）。54另一种方法是用另一种方法是用0.1 0.1 焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPCDEPC）的）的水溶液浸泡用于制备水溶液浸泡用于制备RNARNA的烧杯，试管和其他用品。的烧杯，试管和其他用品。 灌满灌满DEPCDEPC的玻璃或塑料器皿在的玻璃或塑料器皿在3737放置小时，放置小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于然后用灭菌水淋洗数次，并于100100干烤干烤1515分钟，高分钟，高压压1515分钟。分钟。55（）研究人员造成的污染（）研究人员造成的污染 RNA
37、 RNA酶最主要的潜在污酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析RNARNA的材料和溶液时，主有涉及的材料和溶液时，主有涉及RNARNA的一切操作过程的一切操作过程中，都应戴一次性手套，勤换手套。中，都应戴一次性手套，勤换手套。56（）污染的溶液（）污染的溶液 用高压灭菌的水和用高压灭菌的水和RNARNA研究专用研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无将溶液装入无RNARNA酶的玻璃器皿。酶的玻璃器皿。57（二）（二）RNARNA酶的抑制剂酶的抑制剂 种广泛应用的
38、特异性种广泛应用的特异性RNARNA酶抑制剂。酶抑制剂。（）（）RNARNA酶的酶的蛋白质抑制剂蛋白质抑制剂：为血管生成素：为血管生成素的抑制剂，从人胎盘分离出来，可与多种的抑制剂，从人胎盘分离出来，可与多种RNARNA酶紧密结合形成非共价结合的等摩尔复合物，酶紧密结合形成非共价结合的等摩尔复合物，使使RNARNA酶失活。不同厂家的商品名不同。酶失活。不同厂家的商品名不同。58（）氧钒核糖核苷复合物：（）氧钒核糖核苷复合物： 这种由氧钒离子与这种由氧钒离子与核糖核苷形成的复合物，能与多种核糖核苷形成的复合物，能与多种RNARNA酶结合，强酶结合，强烈抑制烈抑制RNARNA酶的活性。其使用浓度都
39、是酶的活性。其使用浓度都是10mmol/L10mmol/L。59（）（）MacaloidMacaloid（硅藻上）：是一种粘土，很多（硅藻上）：是一种粘土，很多年前就发现它能吸附年前就发现它能吸附RNARNA酶，用缓冲液将其制成浆酶，用缓冲液将其制成浆液，以液，以0.0150.015（W/VW/V）的终浓度溶解细胞。）的终浓度溶解细胞。 这种这种粘土随同它所吸附的粘土随同它所吸附的RNARNA酶可在后续的酶可在后续的RNARNA纯化过纯化过程中（如酚抽提后）经离心去除。程中（如酚抽提后）经离心去除。60mRNAmRNA的分离的分离与与rRNArRNA和和tRNAtRNA不同的是，哺乳动物细胞的
40、绝大部不同的是，哺乳动物细胞的绝大部分分mRNAmRNA在其在其33端均有一端均有一poly(A)poly(A)尾，因此可以用尾，因此可以用oligo(dT)oligo(dT)纤维素亲和层析法从大量的细胞纤维素亲和层析法从大量的细胞RNARNA中分中分离离mRNAmRNA。在构建在构建cDNAcDNA文库时，文库时， 必须经上述纯化步骤制备必须经上述纯化步骤制备mRNAmRNA模模板。板。mRNA mRNA 的分离与纯化的分离与纯化 61 mRNA mRNA的特点：的特点： 1. 1. 种类多，变化快，功能重要种类多，变化快，功能重要 2. 2.用途广泛用途广泛分离纯化方法：分离纯化方法：1.1.寡聚（寡聚（dTdT）- -纤维素柱层析发纤维素柱层析发2.2.寡聚（寡聚（dTdT）- -纤维素液相结合离心法纤维素液相结合离心法3.3.寡聚（寡聚（dTdT）- -纤维素柱离心法纤维素柱离心法4.4.寡聚（寡聚（dTdT）- -生物素磁珠法生物素磁珠法62 mRNAtRNA 寡聚 T total RNArRNAmRNA的亲和层析分离的亲和层析分离63谢谢 谢谢 指指 导导64
