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1、常规组织病理技术常规组织病理技术1常规石蜡切片制作程序组织固定取材固定脱水透明浸腊包埋切片染色封片观察2 一一 固固定定1.1.组织固定的意义组织固定的意义防止组织细胞自溶和腐败防止组织细胞自溶和腐败保持组织细胞正常生活时的形态结构保持组织细胞正常生活时的形态结构沉淀和凝固各种物质沉淀和凝固各种物质, ,硬化组织便于制片和染色后硬化组织便于制片和染色后的观察的观察32.2.固定的注意事项固定的注意事项一般应在离体一般应在离体3030分钟内固定分钟内固定, ,越及时越好越及时越好, ,并将组并将组织上的血液织上的血液, ,分泌物冲洗干净分泌物冲洗干净固定剂的量一般不少于组织块总体积的固定剂的量一
2、般不少于组织块总体积的4 4倍以上倍以上固定的时间应视组织的不同和大小决定固定的时间应视组织的不同和大小决定, ,一般小组一般小组织织4-64-6小时小时, ,大组织大组织18-2418-24小时或更长小时或更长有特殊要求的须用特殊的固定剂有特殊要求的须用特殊的固定剂不同组织在固定时应注意特殊的处理方法不同组织在固定时应注意特殊的处理方法43.3.常用的固定剂常用的固定剂甲醛甲醛(10%(10%福尔马林福尔马林) ) 甲醛甲醛 100ml 100ml 水水 900ml900ml中性甲醛中性甲醛 甲醛甲醛 100 ml100 ml Na Na2 2HPOHPO4 4 6.5g 6.5g NaH
3、NaH2 2POPO4 4 H H2 2O 4gO 4g 蒸馏水至蒸馏水至 900 ml900 ml 乙醇乙醇- -甲醛甲醛(AF(AF液液) ) 甲醛甲醛 100 ml100 ml 95% 95%乙醇乙醇 850 ml850 ml 冰醋酸冰醋酸 50 ml50 ml5 其他其他 4%4%多聚甲醛多聚甲醛 : :多聚甲醛多聚甲醛4g, 4g, 加蒸馏水加蒸馏水50ml,50ml,加热至加热至6060度度, ,搅拌加入搅拌加入1mol/L NaoH1mol/L NaoH数滴数滴, ,直至溶液变清直至溶液变清, ,冷却后用冷却后用0.1mol/L PBS( PH7.4 )0.1mol/L PBS(
4、 PH7.4 )加至加至100ml.100ml. Carnoy Carnoy氏液氏液( (糖原糖原,DNA,RNA,DNA,RNA,尼氏小体固定用尼氏小体固定用, ,小组小组织织20-4020-40分钟分钟, ,不超过不超过3-43-4小时小时) ) 冰醋酸冰醋酸 10 ml10 ml 氯仿氯仿 30 ml30 ml 无水乙醇无水乙醇 60 ml60 ml6 二二 取取材材1.1.外科的活体组织取材外科的活体组织取材 临床手术取材临床手术取材( (大标本大标本) ) 注意肿瘤的部位注意肿瘤的部位 形状形状 大小大小 颜色及周边组织的关系颜色及周边组织的关系 , ,有无完整包膜有无完整包膜, ,
5、测量体积测量体积, ,包括长度包括长度 宽度宽度 高度高度. .手术手术大标本必须进行预取材大标本必须进行预取材 预固定预固定. . 活体小组织活体小组织( (小标本小标本) ) 组织标本体积小组织标本体积小, ,在取材时应特别小心在取材时应特别小心, ,用伊红让标本用伊红让标本着色着色, ,并用插镜纸包裹并用插镜纸包裹, ,以防丢失以防丢失, ,应标明粒数应标明粒数. .多瓶组多瓶组织应将附号标清楚织应将附号标清楚. .7 2. 2. 动物标本取材动物标本取材: : 动物致死法动物致死法 麻醉法麻醉法, ,空气栓塞法空气栓塞法, ,断头法断头法, ,击头法击头法, ,股动脉放血股动脉放血法等
6、法等, ,要求动作迅速要求动作迅速, ,及时解剖及时解剖, ,取材与固定取材与固定 动物取材注意事项动物取材注意事项: :准备好锋利的刀剪准备好锋利的刀剪, ,固定液固定液, ,取材应新鲜取材应新鲜, ,最好是心脏还在跳动时取材最好是心脏还在跳动时取材, ,并立即并立即投入固定液投入固定液. .组织块厚度不超过组织块厚度不超过3mm(3mm(应将组织上的应将组织上的血液血液, ,渗物渗物, ,粘液粪便等用生理盐水冲洗干净粘液粪便等用生理盐水冲洗干净, ,选好选好组织块的切面组织块的切面, ,切除不需要的部分切除不需要的部分, ,再固定再固定),),应尽应尽可能维持组织原形可能维持组织原形, ,
7、对神经肌肉皮肤组织对神经肌肉皮肤组织, ,可将其可将其两端固定在木板或硬纸板上两端固定在木板或硬纸板上, ,然后再固定然后再固定. .8 三三 脱脱水水脱水的目的脱水的目的: :组织最终将包埋在石蜡中组织最终将包埋在石蜡中, ,才能进行才能进行切片切片, ,为达到这一目的为达到这一目的, ,首先须将组织内的水分置换出首先须将组织内的水分置换出来来, ,以利于透明剂渗入以利于透明剂渗入, ,这一过程为脱水这一过程为脱水.( .(一般情况下一般情况下, ,应将大小标本分别脱水应将大小标本分别脱水. .标本脱水从低浓度开始标本脱水从低浓度开始, ,一般一般人标本从人标本从70%70%或或75%75%
8、乙醇乙醇, ,动物标本从动物标本从50%50%乙醇开始乙醇开始) ) 脱水方法及注意事项脱水方法及注意事项: : 常用试剂为乙醇常用试剂为乙醇, ,某些情况下用丙酮某些情况下用丙酮. . 快速石蜡切片常用丙酮为脱水剂快速石蜡切片常用丙酮为脱水剂, ,尸体解剖标本一般尸体解剖标本一般在无水乙醇后加丙酮在无水乙醇后加丙酮因为脱水剂的新旧影响脱水时间因为脱水剂的新旧影响脱水时间, ,必须灵活掌握必须灵活掌握, ,根根据本实验室情况据本实验室情况, ,定时更换脱水剂定时更换脱水剂. .9 四四 透透明明透明的目的透明的目的: :因为大多数脱水剂不能和石蜡相混因为大多数脱水剂不能和石蜡相混合合, ,组织
9、内的水份脱干净后组织内的水份脱干净后, ,必须通过透明剂的作用必须通过透明剂的作用, ,才能便于浸蜡包埋才能便于浸蜡包埋. . 常用透明剂种类及注意事项常用透明剂种类及注意事项: : 二甲苯二甲苯甲苯甲苯松节油松节油苯苯透明要注意的关键是时间透明要注意的关键是时间, ,透明时间不够透明时间不够, ,石蜡不石蜡不能完全进入组织能完全进入组织, ,影响到包埋影响到包埋 切片切片 . .但是如果透明但是如果透明过度过度, ,组织发硬发脆影响切片质量组织发硬发脆影响切片质量. .特别是肝脾等组特别是肝脾等组织织. .10 五五 浸浸 蜡蜡目的和注意事项目的和注意事项组织经过透明后要浸入石蜡组织经过透明
10、后要浸入石蜡( (火棉胶火棉胶 碳蜡碳蜡 明胶明胶) )内内, ,目的是去除组织中的透明剂目的是去除组织中的透明剂( (二甲苯二甲苯) )而代之以而代之以石蜡石蜡, ,并渗入组织内部并渗入组织内部, ,把软组织变为有适当的硬度把软组织变为有适当的硬度, ,以利切片以利切片. . 一般浸蜡须经过一般浸蜡须经过2 2到到3 3次次, ,石蜡的溶点为石蜡的溶点为56-5856-58度左度左右右, ,目前常用的脱水机上是两个蜡缸目前常用的脱水机上是两个蜡缸. .浸蜡时要注意浸蜡时要注意掌握好石蜡的温度和浸蜡的时间掌握好石蜡的温度和浸蜡的时间11 六六包包 埋埋注意事项注意事项: : 控制好包埋用石蜡的
11、温度和组织块控制好包埋用石蜡的温度和组织块的温度的温度, ,注意组织块包埋的方向注意组织块包埋的方向, ,切面朝下切面朝下, ,组织应组织应尽量平整尽量平整. .蜡块冷却后将组织外围的石蜡进行修整蜡块冷却后将组织外围的石蜡进行修整, ,以便利于连续切片以便利于连续切片. . 七七 切切 片片1.1.准备工作准备工作: : 清洗干净的玻片清洗干净的玻片恒温烤片箱恒温烤片箱毛笔毛笔 眼科弯镊眼科弯镊染片架染片架锋利的切片刀锋利的切片刀制备好制备好的蛋白甘油的蛋白甘油石蜡块预先冷却石蜡块预先冷却12 2. 2.注意事项注意事项: : 熟练掌握切片机的性能熟练掌握切片机的性能 展片箱的水温控制在展片箱
12、的水温控制在4545度左右度左右 固定好蜡块和切片刀固定好蜡块和切片刀 切片附贴好后切片附贴好后, ,放入放入65-7065-70度烤箱中烤片度烤箱中烤片 20-3020-30分钟分钟13 八八 染染色色目的目的: :将组织切片浸入染色剂内将组织切片浸入染色剂内, ,使组织或细胞等使组织或细胞等成分染上不同的颜色成分染上不同的颜色 产生不同的折射产生不同的折射 , ,以便在光以便在光学显微镜下观察学显微镜下观察. . 方法方法: :苏木素苏木素- - 伊红染色称常规染色伊红染色称常规染色, ,又称又称HEHE染色染色. . 其他染色方法称特殊染色其他染色方法称特殊染色( (特染特染). ).
13、步骤步骤: : 1. 1.将切好的组织切片经烤片后入二甲苯将切好的组织切片经烤片后入二甲苯脱蜡脱蜡各约各约5 5分钟左右分钟左右, ,然后入无水乙醇洗去二甲苯然后入无水乙醇洗去二甲苯, ,约约1-1-2 2分钟分钟, ,依次入依次入95%95%乙醇乙醇,80%,80%乙醇乙醇 70%70%乙醇至自来水乙醇至自来水, ,蒸馏水蒸馏水. . 14 2. 2. 将切片浸入配置好的苏木素液内将切片浸入配置好的苏木素液内5-105-10分钟左右分钟左右, ,自来水洗自来水洗1 1分钟分钟,75%,75%盐酸乙醇分化约盐酸乙醇分化约3030秒秒, ,返蓝返蓝1-21-2分钟分钟 自来水洗自来水洗5-105
14、-10分钟分钟 3.95%3.95%乙醇乙醇1 1分钟后入酸化的伊红分钟后入酸化的伊红1010秒至秒至1 1分钟分钟, ,入入95%95%乙醇乙醇各各1 1分钟分钟 无水乙醇无水乙醇各各1 1分钟分钟 , ,电电吹风吹干吹风吹干. .15 染色结果染色结果: :胞核呈蓝色胞核呈蓝色, ,胞浆淡红色胞浆淡红色, ,结缔组织鲜红色结缔组织鲜红色, ,红细胞红细胞橙红色橙红色. . 染色液配置染色液配置: :苏木素是世界上唯一较好的常规细胞核染色剂苏木素是世界上唯一较好的常规细胞核染色剂, ,配置方法很多配置方法很多, ,各有特点各有特点, ,常用的有常用的有:Harris:Harris苏木素苏木素
15、EhrlichEhrlich苏苏木素木素MayerMayer苏木素等苏木素等. . 在日常工作中在日常工作中, ,我教研室用我教研室用GillGill改良苏木素改良苏木素: :苏木素苏木素2g2g溶于无溶于无水乙醇水乙醇250 ml250 ml中中, ,再将硫酸铝再将硫酸铝17.6g17.6g溶于蒸馏水溶于蒸馏水750 ml750 ml中中, ,两两液溶解后将其混匀液溶解后将其混匀, ,加入碘酸钠加入碘酸钠0.2g,0.2g,最后加入冰醋酸最后加入冰醋酸20 ml20 ml 特点特点: :配置简单配置简单, ,色泽鲜艳色泽鲜艳, ,染液耐用染液耐用. . .16 伊红伊红Y Y染料是胞浆较理想
16、的染色剂染料是胞浆较理想的染色剂. . 介绍一种沉淀酸化伊红介绍一种沉淀酸化伊红Y Y乙醇液乙醇液: :伊红伊红Y20gY20g与蒸馏与蒸馏水水500 ml500 ml充分溶解后加浓盐酸充分溶解后加浓盐酸10 ml10 ml搅拌放置过夜搅拌放置过夜析出沉淀析出沉淀, ,过滤后弃去滤液过滤后弃去滤液, ,蒸馏水洗涤沉淀蒸馏水洗涤沉淀, ,反复反复三次三次, ,将沉淀物连同滤纸一起放到恒温箱中干燥将沉淀物连同滤纸一起放到恒温箱中干燥, ,用用95%95%乙醇乙醇1000 ml1000 ml配成饱和液备用配成饱和液备用. . 用时取饱和液一份加用时取饱和液一份加95%95%乙醇乙醇1-21-2份即成
17、工作液份即成工作液17染色注意事项染色注意事项: :1.1.切片脱蜡必须干净彻底切片脱蜡必须干净彻底2.2.按操作步骤进行操作应严格掌握盐酸分化的时间按操作步骤进行操作应严格掌握盐酸分化的时间 分化后的切片应立即入自来水洗分化后的切片应立即入自来水洗3.3.注意染色液的情况注意染色液的情况, ,掌握染色时间掌握染色时间4.4.按配方配置染色液按配方配置染色液. .染色液配置的好坏是染色是否染色液配置的好坏是染色是否成功的关键之一成功的关键之一九九 封封片片国产中性树胶国产中性树胶 封片封片, ,注意树胶量适中注意树胶量适中, ,掌握封片手法掌握封片手法, , 防止气泡防止气泡. .181920212223242526272829
