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1、鱼中结晶紫的检测方案鱼中结晶紫的检测方案工分专工分专122张启阳张启阳、尹彬竹、向乾元、魏俊、尹彬竹、向乾元、魏俊前言前言 结晶紫属于三苯甲烷类染料，化学性质，暗绿色闪光粉末或粒子。溶于冷水和热水，呈紫色，极易溶于乙醇。于浓硫酸中呈红黄色，稀释后呈暗绿光黄色，然后转变成蓝和紫色，结晶紫这种化合物对鱼类的水霉病、寄生虫病等有很好的疗效，长期以来许多国家曾将其作为水产养殖业的杀菌剂。它们在鱼体内可分别代谢为和无色结晶紫，由于其母体化合物和代谢物均具有潜在的致癌、致畸、致突变等副作用，20世纪90年代 以来许多国家都将其列为水产养殖的禁用药物。但 是由于其抗菌效果好、价格便宜，不少业户仍在违规使用，
2、因此结晶紫残留监控就显得格外重要。 实验材料与方法试验结果结果讨论结晶紫结晶紫的的检测检测方案方案123样品样品的的提取提取的的保存保存试剂和溶液试剂和溶液 鲈鱼，鲈鱼，从从超市超市里里购买购买鲈鱼鲈鱼活样品，取其肌肉，各自用均质机活样品，取其肌肉，各自用均质机混均，每个样品各混均，每个样品各400 g400 g，于，于-20 -20 冰箱保存备用。冰箱保存备用。 样品样品与方法与方法 结晶紫标准品：结晶紫标准品： 纯度纯度 93.9 %；结晶紫快速检测前处理试；结晶紫快速检测前处理试 剂盒，由中国检验检疫剂盒，由中国检验检疫科学研究院北京陆桥商检新科学研究院北京陆桥商检新 技术公司生产。酸性
3、氧化铝固相萃取柱（技术公司生产。酸性氧化铝固相萃取柱（500 mg， 3 mL），），PRS固相萃取柱（固相萃取柱（500 mg，3 mL），乙腈为），乙腈为 色谱纯，无水乙酸铵、冰乙酸、色谱纯，无水乙酸铵、冰乙酸、对对-甲苯磺酸、乙酸甲苯磺酸、乙酸 钠、硼氢化钾均为分析纯，实验用水为去离子水。钠、硼氢化钾均为分析纯，实验用水为去离子水。 孔雀石绿乙腈孔雀石绿乙腈 溶液溶液; 结晶紫标准储备液：结晶紫标准储备液：100 g/mL结晶紫乙腈溶液结晶紫乙腈溶液; 、结晶紫混合标准中间溶液：、结晶紫混合标准中间溶液：10 g/mL; 乙酸钠缓冲液：乙酸钠缓冲液：0.06 mol/L乙酸钠乙酸钠+0.
4、005 mol/L 对甲苯磺酸，对甲苯磺酸，pH4.5; 乙乙酸铵缓冲溶液：酸铵缓冲溶液：0.125 mol/L，pH 4.5; 硼氢化钾溶液：硼氢化钾溶液：0.07 mol/L，现配现用，现配现用; 洗脱洗脱液：乙酸乙酯液：乙酸乙酯 甲醇甲醇 氨水体积比氨水体积比10 9 1样品预处理样品预处理 提取提取：准确称取：准确称取 5.00 g已搅碎的样品于已搅碎的样品于 50 mL 离心管中，加入结离心管中，加入结晶紫快速检测前处理晶紫快速检测前处理 试剂盒中提取剂试剂盒中提取剂 1（20mL，由有机化学试剂，由有机化学试剂组成的组成的 混合液体试剂）和提取剂混合液体试剂）和提取剂 2（由无机化
5、学组成的混（由无机化学组成的混 合粉末试合粉末试剂），剂），8 000 r/min的速度均质的速度均质 30 s，振荡，振荡 2 min，4 500 r/min 离离心心 5 min，取上清液，取上清液 10.0 mL 于于 鸡心瓶中，鸡心瓶中，45 水浴旋转蒸发至水浴旋转蒸发至近干，用近干，用 2.5 mL 乙腈溶解残渣。乙腈溶解残渣。净化净化: 将将 PRS 柱安装在固相萃取装置上，上端串联酸性氧化铝柱，柱安装在固相萃取装置上，上端串联酸性氧化铝柱，用用 5 mL 乙腈活化，转移提取液到柱上，再用乙腈活化，转移提取液到柱上，再用 2.5 mL 乙腈洗涤瓶一乙腈洗涤瓶一次，过柱，重复操作一次
6、，去掉酸性氧化铝柱，用次，过柱，重复操作一次，去掉酸性氧化铝柱，用 5 mL 乙腈乙腈清洗清洗PRS柱，柱，氮氮吹吹PRS柱柱至至近近干干，在在不抽不抽真空真空清况下，加入清况下，加入 5 mL 洗脱洗脱液洗脱，收集全部洗脱液，液洗脱，收集全部洗脱液， 氮气吹至近干，加氮气吹至近干，加 0.4 mL 硼氢化钾溶硼氢化钾溶液，还原，静置液，还原，静置 20 min，用乙腈定溶至，用乙腈定溶至 1.0 mL，经聚四氟乙烯，经聚四氟乙烯膜膜 过滤后上机分析过滤后上机分析 实验实验方法方法的的选择选择 目前结晶紫检测方法主要有高效液相色谱法目前结晶紫检测方法主要有高效液相色谱法1-3和液质联用法和液质
7、联用法4-5。我国。我国 于于2006年发布有关的水产行业标准（年发布有关的水产行业标准（SN/T1768- 2006）6及国家标准（及国家标准（GB/T20361-2006）7。行业。行业 标准标准SN/T1768-2006前处理简单，但是满足不了检前处理简单，但是满足不了检 测限测限0.5 g/kg的要的要求。其他方法的前处理均需多次萃取，多次离心，操作烦琐，前处求。其他方法的前处理均需多次萃取，多次离心，操作烦琐，前处理时间长，有机理时间长，有机 溶剂用量大，实际检测工作中存在困难。本文综溶剂用量大，实际检测工作中存在困难。本文综合各个方法标准中快速和灵敏的优点，建立了同时检测，结晶紫以
8、合各个方法标准中快速和灵敏的优点，建立了同时检测，结晶紫以及代谢物无色结晶紫总量的及代谢物无色结晶紫总量的高效液相色谱法。 仪器：仪器：Agilent1200 型高效液相色谱仪、均质机、型高效液相色谱仪、均质机、 离心机、离心机、振荡器、旋转蒸发器、固相萃取装置、氮吹仪。振荡器、旋转蒸发器、固相萃取装置、氮吹仪。 色谱条件：色谱柱，色谱条件：色谱柱，Eclipse-C18 250 mm4.6 mm，粒度，粒度 5 m；流动相，乙腈；流动相，乙腈+乙酸铵缓冲液（乙酸铵缓冲液（pH 4.5）=80+20；流速；流速 1.5 mL/min；柱温；柱温 35 ；激发；激发 波长波长 265 nm, 发
9、射波长发射波长 360 nm；进样量；进样量 20 L仪器与色谱条件仪器与色谱条件 在临用前准确吸取一定量的混合标准中间溶在临用前准确吸取一定量的混合标准中间溶 液，加入液，加入 0.4 mL 硼氢化钾溶液，硼氢化钾溶液，用乙腈准确稀释至用乙腈准确稀释至 2.0mL，配制适当浓度的混合标准工作液。在上述，配制适当浓度的混合标准工作液。在上述 色谱条色谱条件下，分别测定结晶紫混合标准工作溶液及样品提取溶液中的结晶紫，件下，分别测定结晶紫混合标准工作溶液及样品提取溶液中的结晶紫， 外标法外标法定量。定量。 样品测定样品测定 准确度和精密度实验准确度和精密度实验 以本底无结晶紫、以本底无结晶紫、 隐
10、性结晶紫的鲈隐性结晶紫的鲈鱼鱼为样品，平行称取为样品，平行称取3份样品，份样品， 按按5 g/kg、10 g/kg、20 g/kg三个加标浓度进行加三个加标浓度进行加 标，按上述步骤进行前标，按上述步骤进行前处理和色谱测定，分别测定处理和色谱测定，分别测定 各次的峰面积，计算样品中结晶紫的含量，计各次的峰面积，计算样品中结晶紫的含量，计算回收率。算回收率。 另取另取 6 个平行样品，采用添加法分别添加等量结晶紫混合标准个平行样品，采用添加法分别添加等量结晶紫混合标准溶液，按上述步骤进行溶液，按上述步骤进行 前处理和色谱测定，分别测定各次的峰面积前处理和色谱测定，分别测定各次的峰面积,计算样计算
11、样 品中结晶紫的含量，计算相对标准偏差。品中结晶紫的含量，计算相对标准偏差。 计算计算 以标准工作液峰面积和浓度作工作曲线，根据以标准工作液峰面积和浓度作工作曲线，根据 样品提取液的峰面积，从工作曲样品提取液的峰面积，从工作曲线计算样品提取液中结晶紫的残留量，按式线计算样品提取液中结晶紫的残留量，按式计算样品中计算样品中 结晶紫残留量。计算结结晶紫残留量。计算结果需扣除空白值。果需扣除空白值。 X=(CxVx2)/m 式中：式中：X试样中的结晶紫的残留量，试样中的结晶紫的残留量，g/kg； C样品提取液中结晶紫的残留量，样品提取液中结晶紫的残留量，ng/mL； V最终定容体积，最终定容体积，m
12、L； m样品质量，样品质量，g。 实验结果 结晶紫标准色谱图 本实验选定色谱条件下、结晶紫的保留时间分别为为 7.9 min、8.5 min 左右，图 1 为标 准溶液浓度为 30 ng/ mL 的标准色谱图 以以 HPLC 测得的峰面积测得的峰面积 y为纵坐标，相应的浓为纵坐标，相应的浓 度度 x为横坐标绘制标准曲线，其线性关系为横坐标绘制标准曲线，其线性关系和相关系数见表和相关系数见表 1。结果表明，结晶紫在。结果表明，结晶紫在 1.0 ng/mL500 ng/mL 范围内线性良好，可以范围内线性良好，可以满足定量分析的需要。满足定量分析的需要。 关系数关系数表表 1 线性回归方程、相线性
13、回归方程、相、线性范围、线性范围 标准曲线 化合物化合物 线性回归方程线性回归方程 相关系数相关系数 线性范围线性范围结晶紫结晶紫 GV y=0.9834x-3.7908 0.9996 1.0500 回收率、精密度和灵敏度回收率、精密度和灵敏度 鲈鲈鱼鱼空白肌肉组织样品中分别添加空白肌肉组织样品中分别添加3个浓度个浓度 水平的结晶紫标准溶液，进行回水平的结晶紫标准溶液，进行回收率测定，回收率测定结果见表收率测定，回收率测定结果见表 2，加标样品图谱见图，加标样品图谱见图 2。 由表由表 2 可以看出可以看出，结晶紫加标浓度在结晶紫加标浓度在 5 g/kg20 g/kg 内，回收率为内，回收率为
14、 76.1 92.5 。 六个六个平行样品测定结果的相对标准偏差（平行样品测定结果的相对标准偏差（RSD） 分别为：结晶紫，分别为：结晶紫，4.5，重现性，重现性能满足要求。以信噪比能满足要求。以信噪比 S/N=3 计算，样品中结晶紫的检出限均为计算，样品中结晶紫的检出限均为 0.5 g/kg。 讨论 净化条件的选择净化条件的选择 样品经孔雀石绿快速前处理试剂盒提取后，如果不进一步净化，直接样品经孔雀石绿快速前处理试剂盒提取后，如果不进一步净化，直接上机用荧光检测器检测，干扰严重。目前文献资料中多采用氧化铝柱（酸上机用荧光检测器检测，干扰严重。目前文献资料中多采用氧化铝柱（酸性、性、 中性或碱
15、性）与中性或碱性）与 PRS 小柱串联来对样品进行净化小柱串联来对样品进行净化1,2,5,7。我们。我们分别采用正己烷，酸性氧化铝柱分别采用正己烷，酸性氧化铝柱 与与 PRS小柱串联，对样品进行了净化，小柱串联，对样品进行了净化，实验中发现，实验中发现， 用正己烷脱脂效果差，干扰严重，用酸性氧化铝和用正己烷脱脂效果差，干扰严重，用酸性氧化铝和 PRS 小小柱串联净化效果好，所以实验中采用酸性氧柱串联净化效果好，所以实验中采用酸性氧 化铝柱与化铝柱与 PRS 小柱串联进行小柱串联进行净化，过净化，过 0.45 m膜后膜后 上机检测。与文献相比，本实验经过一次萃取后上机检测。与文献相比，本实验经过
16、一次萃取后无无 需二氯甲烷反萃取，浓缩后直接用小柱进行净化，需二氯甲烷反萃取，浓缩后直接用小柱进行净化， 同样获得了较理想同样获得了较理想的实验结果。的实验结果。 流动相的选择流动相的选择 实验中分别采用（实验中分别采用（1）乙腈）乙腈+乙酸钠缓冲乙酸钠缓冲液液（pH 4.5）=80+20；（2）乙腈）乙腈+乙酸铵缓冲液（乙酸铵缓冲液（pH 4.5） =80+20 为流动相进行为流动相进行检测，实验结果表明检测，实验结果表明用流动相（用流动相（1）进行检测时基线噪音大，对检测结果有干）进行检测时基线噪音大，对检测结果有干 扰，扰，用流动相（用流动相（2）进行检测时基线噪音小，对）进行检测时基线
17、噪音小，对 检测基本无干扰。检测基本无干扰。 小结小结 样品经孔雀石绿快速前处理试剂盒提取，固相萃取柱净化，样品经孔雀石绿快速前处理试剂盒提取，固相萃取柱净化，硼氢化钾还原，高效液相色谱硼氢化钾还原，高效液相色谱-荧光检荧光检 测法进行检测，成功测法进行检测，成功地进行了水产品中结晶紫残留量的检测。试验结果表明：该地进行了水产品中结晶紫残留量的检测。试验结果表明：该方法主要方法主要 综合了各个方法标准中快速和灵敏这两个优点，并综合了各个方法标准中快速和灵敏这两个优点，并 对前处理过程进行了优化，相对于对前处理过程进行了优化，相对于SN/T1768-2006 及文献及文献1，2来说，检测限从来说
18、，检测限从2.0 g/kg提高到了提高到了 0.5 g/kg，而相对，而相对于于GB/T20361-2006及其它文献来及其它文献来 说，前处理大为简化，大说，前处理大为简化，大大缩短了检测时间，减少了有机溶剂用量，灵敏度与国标大缩短了检测时间，减少了有机溶剂用量，灵敏度与国标7及液质联用方及液质联用方 法法5相当（均为相当（均为0.5 g/kg），是水产品中结），是水产品中结晶紫及其代晶紫及其代 谢物隐色结晶紫残留总量快速而准确的检测方法。谢物隐色结晶紫残留总量快速而准确的检测方法。 参参 考考 文文 献献 1 任秀莲，魏琦峰，曲径，等任秀莲，魏琦峰，曲径，等. 反相高效液相色谱法测定水产品
19、中孔反相高效液相色谱法测定水产品中孔 雀石绿、结晶紫及其代谢物雀石绿、结晶紫及其代谢物J. 中国卫生检验杂志中国卫生检验杂志, 2006, l6(8):939-940. 2 林洪，付晓婷，邱绪建林洪，付晓婷，邱绪建, 等等. 液相色谱法测定鱼肌肉中孔雀石绿、液相色谱法测定鱼肌肉中孔雀石绿、 结结晶紫及其代谢物晶紫及其代谢物J.中国海洋大学学报中国海洋大学学报, 2006, 36(6):909-912. 3 朱宽正朱宽正, 王鹏王鹏, 林雁飞，等林雁飞，等. 液相色谱一串联质谱法同时测定水产液相色谱一串联质谱法同时测定水产 品品中孔雀石绿、结晶紫以及它们的隐色代谢物残留中孔雀石绿、结晶紫以及它们的隐色代谢物残留J. 色谱色谱, 2007, 25(1):66-69. 4贾东芬，张顺合，张维，等贾东芬，张顺合，张维，等. SN/T1768-2006, 水产品中孔雀石绿和水产品中孔雀石绿和 结晶紫及其代谢产物的快速测定方法结晶紫及其代谢产物的快速测定方法S. 北京：中国标准出版社，北京：中国标准出版社， 2006. 5 郑斌，赵红萍，冷凯良，等郑斌，赵红萍，冷凯良，等. GB/T20361-2006, 水产品中孔雀石绿水产品中孔雀石绿 和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法S. 北京：北京：Thank you !
