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1、第十章 微生物的实验实验一 显微镜的使用及细菌,放线菌和蓝细菌个体形态的观察(一)目的(1)掌握显微镜的结构,原理,学习显微镜的操作方法和保养.(2)观察细菌,放线菌和蓝细菌的个体形态,学会生物图的绘制.(二)实验器材(1)显微镜,目测微计,物测微计,擦镜纸,香柏油,二甲苯.(2)示范片 大肠杆菌 小球菌 蓝藻等（二）、实验内容 1. 1.显微镜的结构显微镜的结构 （ 1 1）. . 机械部分机械部分 （2 2）. .光学部分光学部分 （2 2）光学部分）光学部分a.a.目镜目镜b.b.物镜物镜: : 低倍物镜低倍物镜 高倍物镜高倍物镜 油镜油镜物镜的性能由数值孔径决定物镜的性能由数值孔径决定
2、 数值孔径数值孔径= =n*n*sinasina/2/2显微镜的性能还依赖于物镜的分辨力显微镜的性能还依赖于物镜的分辨力分辨力分辨力: :能分辨两点之间的最小距离的能力能分辨两点之间的最小距离的能力 增大数值孔径来增大数值孔径来提高分辨力提高分辨力. .物镜物镜 N.A.1.25,100*,”OI”,160/0.17,16mm- N.A.1.25N.A.1.25,100*,”OI”,160/0.17,16mm- N.A.1.25数值孔数值孔径径 100* 100*放大倍数放大倍数 ” ”OI”OI”油镜油镜 160 160镜筒长镜筒长 0.17 0.17要求盖要求盖玻片的厚度玻片的厚度 16
3、16mmmm焦距焦距C.C.聚光器聚光器d.d.反光镜反光镜f. f.滤光片滤光片 2.显微镜使用和保护(1)(1)低倍镜的使用法低倍镜的使用法(2)(2)高倍镜的使用法高倍镜的使用法(3)(3)油镜的使用法油镜的使用法3.目测微尺,物测微尺及其使用方法(1)(1)目测微尺目测微尺(2)(2)物测微尺物测微尺(3)(3)目测微尺的标定目测微尺的标定(4)(4)菌体大小的测量菌体大小的测量4.4.细菌细菌, ,放线菌和蓝细菌个体形态的观察放线菌和蓝细菌个体形态的观察(四)实验报告实验三 微生物直接计数法(一)目的（1）明确显微镜计数的原理（2）学习使用血球计数板进行微生物计数的方法（二）仪器与材
4、料显微镜血球计数板移液管酵母菌液（三）血球计数板的结构与计算方法（1）1625的计数板计算公式细胞数125小格内的细胞数400101000稀释倍数125（2）2516的计数板计算公式细胞数80小格内的细胞数4101000稀释倍数80四）操作步骤（1 1）稀释样品）稀释样品 使每格约使每格约5 5个细胞个细胞（2 2）取干净的血球计数板，用厚盖玻片盖住中央的计数室，）取干净的血球计数板，用厚盖玻片盖住中央的计数室，用移液管吸取少许充分摇匀的待测菌液于盖片的边缘，菌液则用移液管吸取少许充分摇匀的待测菌液于盖片的边缘，菌液则自行渗入计数室，自行渗入计数室，5 51010minmin即可计数即可计数（
5、3 3）将血球计数板置于载物台上，用低倍物镜找到小方格网）将血球计数板置于载物台上，用低倍物镜找到小方格网后换用高倍镜观察计数后换用高倍镜观察计数 每样品重复三次，取平均值，计算每每样品重复三次，取平均值，计算每1 1mlml菌液中所含的酵母菌液中所含的酵母菌数。菌数。（五）试验报告实验四 微生物的染色l目的 学习微生物涂片染色的操作技术,掌握微生物的普通染色法(单染色法)和革兰氏染色法l实验仪器和材料l实验步骤 单染色 革兰氏染色涂片干燥固定染色水洗吸干镜检 取大肠杆菌和枯草杆菌芽孢杆菌(均以无菌操作)分别做涂片,干燥,固定.方法同单染色法 用草酸铵结晶紫染色1min,水洗. 加革氏碘液媒染
6、色1min,水洗 斜置载玻片于一烧杯上,滴加95%酒精脱色,至流洗出的酒精不呈现紫色时,立即用水冲净酒精,脱色时间约20min,或视涂片厚薄而略有差异 用番红(或称沙黄)染液染色12min,水洗 吸干,置于显微镜下观察,阳性者为紫色,阴性者为红色v 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度.如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时,阴性菌可被误染为阳性菌v 菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反应实验五 培养基的制备及灭菌n一 目的 1玻璃仪器的洗涤和灭菌前的准备工作 2掌握培养基的配制方法 3会干热灭菌和高压蒸汽灭菌的操作方法n二 实验材
7、料n三 实验内容 1玻璃器皿的洗涤剂包装 A洗涤 培养皿、试管、锥形瓶等可用去污粉或肥皂，自来水冲净。移液管用洗液浸泡在水冲净。干燥。B包装 1）培养皿牛皮纸包装 2）吸管的吸端塞棉花约11.5cm，(防细菌吸入口中，避免细管吹入)，松紧适宜。用包装纸包移液管尖端。 3）试管和锥形瓶等的管口均堵棉塞，并用牛皮纸 包裹。2培养基的制备 A步骤 1）配制溶液 取一定容量的烧杯盛入定量无菌盐水，按培养基配方逐一称取各成分，加水溶解，可加热促进，不断搅拌以防原料在杯底烧焦。 2）调pH值 测定培养液的pH, 按要求以10%HCl or 10%NaOH 调至所需pH。 3）过滤 用纱布、滤纸、棉花均可，
8、若杂质少可省略4）分装 将培养基分装在试管或锥形瓶中（放置培养基玷污管口，避免浸湿棉塞引起杂菌污染），装入试管的量视1试管的大小定，一般斜面培养基时为其高度的1/41/35）斜面培养基的制作 将装有琼脂培养基的已灭菌的试管趁热取出，斜置于木棒上，使其斜面长度为试管的1/31/2，代培养基凝固后即成斜面B 营养琼脂培养基的制备1）培养基配方：牛肉膏0.75g，蛋白胨1.5g，氯化钠0.75g，琼脂3g，蒸馏水150ml，pH7.6 。0.1Mpa下灭菌20min.2）操作： a取300ml烧杯一个，装150ml蒸馏水。 b 在药物天平上一次称取配方中各成分，水中溶解，带待琼脂完全溶解后停止加热，
9、补充水分，用10%NaOH调pH =7.6，省略过滤，培养基分装五支试管中，余入250ml锥形瓶，塞上棉塞，包炸好待灭菌3无菌水制备1）取250ml锥形瓶装90ml蒸馏水，赛棉塞，包扎，待灭菌2）取5支18mm*18mm试管，分装9ml蒸馏水4灭菌 杀死全部微生物的营养细胞和它们的芽孢或孢子灭菌方法 过滤除菌，化学药品消毒，利用酚、甲醛等是细菌蛋白质变性灭菌；高温，紫外线等物理方法加热灭菌是主要的：干热灭菌，高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）。后者在121oC灭菌1530min,效果好。1）干热灭菌法：用于培养皿等玻璃仪器。包装好的上述物品放入恒温箱中，160oC维持2h，旋钮调至零，到50oC可取2）
10、高压蒸汽灭菌：微生物试验所需仪器培养基，皆可用高压灭菌锅灭菌2）灭菌操作过程 A 先加水，放物品，盖锅盖，对称的拧紧螺栓，防 漏气。 B 加热，并开排气阀，冒热气35min后关。到所需压力 计时，达灭菌时间后停止加热 C 压力为零开排气阀，取物 D 将灭菌后的培养基于37oC恒温箱24h，作无菌培养，若无菌生长，可保存备用。实验六 微生物的纯种分离、培养和接种技术n一 目的要求 掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的基本要求n二 仪器材料n三 操作方法及步骤 1 微生物的纯种分离及培养：稀释平板法和平板划线法 1）稀释平板法 a 取样 用无菌锥形瓶取定量的会活性污泥 b 稀释水样 将一瓶90毫
11、升和5管9毫升的无菌水按10-1 至10-6依次编号。无菌条件下用10ml移液管取10ml水样于第一瓶90ml无菌水中，摇匀即得10-1浓度的菌液。移液管吹洗3次用1ml无菌移液管取1ml 10-1浓度的菌液于9ml无菌水中摇匀。同法，依次稀释至10-6C 平板制作 将10套无菌培养皿编号10-4 105 10-6按次序分别取0.5ml菌液于相应培养皿（吸前移液管吹使其混匀）。同时加热琼脂培养基，熔化，冷至45oC时，注1015ml入培养皿。立即盖盖，混匀，冷却后即成平板。将培养基倒置于30恒温箱中培养，48h后观察结果（2）平板划线分离法 a制作: 将熔化冰冷至50oC的营养琼脂培养基 10
12、15ml 导入无菌培养皿，凝固成平板 b划线：以无菌操作，接种环挑污泥于在平板上划线，盖盖，倒置于30oC恒温箱培养48h后观察结果2其他接种方法的操作1）斜面接种技术A 贴标签 B 点燃酒精灯 C 将一支斜面菌种和一支待接种的斜面培养基放左手，拇指压住两试管，中指于其间，斜面向上，管口齐平。D接种环灭菌E 将棉花拔出，试管口微绕火焰。用接种环迅速移菌种于另一试管底部，再接种环上有底部向上画曲线。接种环灭菌。2）液体接种 由斜面基接种到液体培养基。用接种环将菌种全送入液体培养基，塞棉花，转动使其混匀。3）液体培养基中的菌种被接入液体培养基 用无菌移液管自菌种管吸取菌液接种到另一液体培养基中赛好
13、棉塞即可4）穿刺接种将斜面培养基接种到固体或半固体深层培养基 自中心刺入，直到管底，但不穿透，并沿穿刺途径拔出，易于观察。实验七纯培养菌中的菌体、菌落形态观察n一目的 观察菌形态及菌落特征，通过革氏染色了解活性污泥有哪些微生物组成。n二仪器材料n三试验内容与方法1菌落形态和菌体染色及其形态观察A接种斜面培养基 B菌落形态特征观察 酵母菌菌落圆形，大小接近细菌，光滑，质地软，多为白色和红色。放线菌洛硬度大，干致密，与基质结合紧。酶菌菌落呈绒状或棉状，能扩散生长，疏松。在液体培养基上观察混浊度，有无沉淀，液体表面生膜与否，膜的形状等；在斜面培养基上，观察菌落生长旺盛程度，形状，颜色，及光泽等在穿刺
14、接种时看菌落在基质表面的情况，菌落的延伸及是否液化培养基和液化情况。观察时绘出菌落形态特征图3）微生物个体形态观察观察的各种微生物菌落形态后，革氏染色，镜检，绘其形态图。2细菌，放线菌，酵母菌及霉菌菌落特征比较四 实验报告五思考题实验八 水中大肠菌群的检测l目的 学习水中大肠菌群的检测原理和方法l仪器和材料 样品 培养基 染料 其他l原理l操作方法与步骤 多管发酵法 滤膜法大肠菌系以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌,在世界范围内370c生长时,能于48h内发酵乳糖使产酸产气.主要包括埃希氏菌属,肠杆菌属,克雷伯氏菌属等.由于其在水体中存在的数目与肠道致病菌呈一定的正相关,
15、抵抗力也略强,且易于检验等特点,在水质检测 中常将其作为水体受粪便污染的指标,如我国生活饮用水卫生标准中即规定1L水样中大肠菌群数不超过3个.大肠菌群也称为粪便污染指示菌.苏检验方法有我管发酵法及滤膜法两种.多管发酵法可适用于多种水样,实验周期较长;滤膜法则适用于杂技较少的水样,特别适用于自来水厂作为常规监测之用.v 取水样 自来水样的采集 河湖、井水、海水水样的采集 水样的处置v 初步发酵实验v复发酵实验v准备工作 滤膜灭菌 滤膜过滤器安装v 过滤水样v 观察结果 挑取符合大肠菌群菌落特征的菌落进行革兰氏染色，镜检。 将镜检验员革兰氏服性、无芽孢杆菌的菌落再接种一支乳 糖蛋白胨发酵管，经370c培养24h，产酸又产气者即为大肠菌群阳性 计算1L水样中的大肠菌群数= (个/L) 实验九 水中细菌总数的测定l目的 学习水中细菌总数的测定方法 了解平板菌落计数的原则l仪器及材料l原理l操作步骤本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中的细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌都能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数公仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基v 水样的采取v 细菌总数的测定 自来水 池水、河水或湖水等 菌落计数方法
