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1、参考书赵赵赵赵南南南南明明明明，周周周周海海海海梦梦梦梦. . . . 生生生生物物物物物物物物理理理理学学学学，高高高高等等等等教教教教育育育育出出出出版版版版社社社社，2000200020002000EmissionEmissionSpectroscopy,Spectroscopy,ChapterChapter11,11,ininK.E.K.E.vanvanHolde,Holde,W.C.W.C.JohnsonJohnsonandandP.S.P.S.HoHoeds.eds.PrinciplesPrinciples ofof PhysicalPhysical Biochemistry,Bi
2、ochemistry, Prentice-Prentice-Hall,1998Hall,1998 某某些些物物质质被被一一定定波波长长的的光光照照射射时时，会会在在一一定定时时间间内内发发射射出出波波长长比比入入射射光光长长的的光光，如如果果这这个个时时间间比比较较短短，这这种种光光就就称称为为荧荧光光。荧荧光光由由一一种种能能发发荧荧光光的的矿物矿物 萤石萤石( (fluospar) )而得名。而得名。我我们们这这里里要要介介绍绍的的荧荧光光，是是指指物物质质在在吸吸收收紫紫外外光光和和可可见见光光后后发发出出的的波波长长较较长长的的紫紫外外荧荧光光或或可可见见荧荧光。光。除除了了紫紫外外光
3、光和和可可见见光光可可能能激激发发荧荧光光外外，其其它它的的光光如如红红外外光光、X X射射线线也也可可能能激激发发出出荧荧光光，因因此此除除紫紫外外荧光或可见荧光外，还有红外荧光、荧光或可见荧光外，还有红外荧光、X X射线荧光等。射线荧光等。Indiscussingabsorptionwehavebeenconcerned entirely with the excitation of amoleculefromitsgroundstatetoahigherenergylevel and have given no consideration to thesubsequentfateofth
4、eexcitedmolecule.Inmanycasesthesequelisnotveryinteresting;the energy is transferred as heat to thesurroundings. In some cases light is emitted by the sampleeitherasfluorescenceorphosphorescence. We will discuss the general characteristics ofemissionandignoretheexceptions.荧光光谱的特点Barak and Webb demons
5、trated that as few as 30fluorescent dye molecules bound to low densitylipoproteinmoleculescanbedetectedoncellsurfacesbymicroscopy using a sensitive video camera. With evenmore sophisticated methods others have moved towarddetection of single fluorophore molecules in a laser-excitedflowstream.Because
6、thissensitivitycancombinewith ease of use and the potential for multiparameteranalysis,fluorescencehasbecomewidelyusedinbiologyandmedicine.Fluorescenceisasensitivetechniquefordetectingbiologicalmaterials荧光光谱灵敏度高的原因 荧荧荧荧光光光光辐辐辐辐射射射射的的的的波波波波长长长长比比比比激激激激发发发发光光光光波波波波长长长长长长长长，测测测测量量量量到到到到的的的的荧光频率与入射光的频率不
7、同；荧光频率与入射光的频率不同；荧光频率与入射光的频率不同；荧光频率与入射光的频率不同；荧荧荧荧光光光光在在在在各各各各个个个个方方方方向向向向上上上上都都都都有有有有发发发发射射射射，因因因因此此此此可可可可以以以以在在在在与与与与入射光成直角的方向上检测；入射光成直角的方向上检测；入射光成直角的方向上检测；入射光成直角的方向上检测； 这这这这样样样样，荧荧荧荧光光光光不不不不受受受受来来来来自自自自激激激激发发发发光光光光的的的的本本本本底底底底的的的的干干干干扰扰扰扰，灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度大大大大大大大大高高高高于于于于紫紫紫紫外外外外- - - -可可可可见见见见吸吸吸吸收收收收光
8、光光光谱谱谱谱，测测测测量量量量用用用用的的的的样品量很少，且测量方法简便。样品量很少，且测量方法简便。样品量很少，且测量方法简便。样品量很少，且测量方法简便。荧荧光光光光谱谱能能提提供供较较多多的的参参数数，例例如如激激发发谱谱、发发射射谱谱、峰峰位位、峰峰强度、荧光寿命、荧光偏振度等。强度、荧光寿命、荧光偏振度等。荧荧光光光光谱谱还还可可以以检检测测一一些些紫紫外外- -可可见见吸吸收收光光谱谱检检测测不不到到的的时时间间过过程程过过程程。紫紫外外和和可可见见荧荧光光涉涉及及的的是是电电子子能能级级之之间间的的跃跃迁迁，荧荧光光产产生生包包括括两两个个过过程程：吸吸收收以以及及随随之之而而
9、来来的的发发射射。每每个个过过程程发发生生的的时时间间与与跃跃迁迁频频率率的的倒倒数数是是同同一一时时间间量量级级( (大大约约1010-15-15秒秒) )，但但两两个个过过程程中中有有一一个个时时间间延延搁搁，大大约约为为1010-8-8秒秒，这这段段时时间间内内分分子子处处于于激激发发态态。激激发发态态的的寿寿命命取取决决于于辐辐射射与与非非辐辐射射之之间间的的竞竞争争。由由于于荧荧光光有有一一定定的的寿寿命命，因因此此可可以以检检测测一一些些时时间间过过程程与与其其寿寿命命相相当当的的过过程程。例例如如，生生色色团团及及其其环环境境的的变变化化过过程程在在紫紫外外可可见见吸吸收收的的1
10、010-15-15秒秒的的过过程程中中基基本本上上是是静静止止不不变变的的，因因此此无无法法用用紫紫外外可可见见吸收光谱检测，但可以用荧光光谱检测。吸收光谱检测，但可以用荧光光谱检测。荧光光谱第二个特点是荧光光谱第二个特点是信息量较大信息量较大基本原理Fluorescence FluorescenceFluorescence isis emissionemission fromfrom aa singletsinglet state,state,wheretheelectronspinsinthemoleculearepaired.wheretheelectronspinsinthemolec
11、ulearepaired. Fluorescence excitationbyabsorptionofenergyexcitationbyabsorptionofenergy losesenergyasheatbylosesenergyasheatbyinternal conversioninternal conversion thethemoleculemoleculehesitateshesitatesatatthethelowestlowestvibrationalvibrationallevellevelofofthethefirstfirstsinglet,singlet,becau
12、sebecauseaarelativelyrelativelylargelargeamountamountofofenergymustbelosttogotothegroundstate.energymustbelosttogotothegroundstate. duringthishesitationoneofthreethingsmayhappen:duringthishesitationoneofthreethingsmayhappen:themoleculemayfluorescethemoleculemayfluoresceitmayconverttothetriplet(itmay
13、converttothetriplet(intersystem crossingintersystem crossing) )ititmaymaygogototothethegroundgroundstatestatewithoutwithoutemittingemittingaaphotonphoton(a(anonradiativenonradiativetransition).transition).EMISSlONLlFETlMESEmissionlifetimesofabsorption,fluorescence,andphosphorescenceattheequilibriumi
14、nternucleardistanceofthegroundstate.仪器结构仪器结构FLUORESCENCEINSTRUMENTATlONDiagramofasimplefluorescenceinstrumentFilterFluorometersInstrumentsinwhichwavelengthselectionisaccomplished with filters are generally referred to asfluorometers,whereasmonochromator-basedinstruments capable of spectral scanning
15、are calledspectrofluorometers. The simplest, least expensive,fluorometers are single beam filter instruments withhalogenlampsources,phototubeorPMTdetectorsandsimpleoutputdevices.Ratiometricfluorometersarealsoavailable in which the ratio of the sample signal to areference signal is used in order to c
16、ompensate forfluctuationsinfinevoltage,drift,etc.Insomeinstruments,suchastheoneshowninfigure,thesampleandreferencelightpathsaretaken from the same source and alternatelymeasuredbythesamedetectorthroughtheuseof a mechanical cam. A similar configuration inwhichtwodetectorsareused,oneforthesamplebeaman
17、doneforthereferencebeam,willcorrectfor source output fluctuations only.Singledetector configurations are also possible tominimizeeffectsofdetectorvariability.Schematicdiagramofadouble-beam(ratiometric)filterfluorometer.Filterfluorometersaresuitableforquantitativeanalysisapplicationsinwhichspectralsc
18、anningandhighresolutionarenot required. Filters transmit more lightand cost less than monochromators,thereby providing better detection limitswithlessexpensiveinstrumentation.SpectrofluorometersSpectrofluorometersarealsoavailableinbothsinglebeamandratiometricconfigurations.Asinglebeaminstrument is s
19、hown in Figure 8. A ratiometricspectrofluorometcrconfigurationinwhichtwoseparatedetectorsareemployedisdepictedinFigure9.Thereference PMT monitors the excitation beam after ithas passed through the monochromator so thatcorrectionsarebasedonfluctuationsinthewavelength of interest only. The reference P
20、MT isplaced after the sample to monitor the transmittedbeam, thereby allowing absorption measurements tobemadeonthesample.Figure8Schematicdiagramofasingle-beamspectrofluorometer.FromPerkin-Elmer.Figure9.Schematicdiagramofaratiometricspectrofluorometer.Single photon counting instruments are used tome
21、asureverylowlightlevelsandaredesignedformaximumsignal-to-noiseperformance.Figure10.Depictionofsinglephotoncounting.ThesignalisdetectedbythePMT,emergingasapulsewhichisthenamplified.Ifthemagnitudeoftheamplified pulse exceeds a certain threshold, it is passed through thediscriminatorandcountedasasignal
22、.Smallerpulsesduetonoiseanddarkcurrent are much more likely to be rejected, thereby increasing signal-to-noise.Spectrofluorometersofferthemostflexibility for quantitative and qualitativeapplications.Manyinstrumentsaremodular so that monochromators can bereplaced with filters in the emission orexcita
23、tionbeamsifdesired.主要譜参量激发谱和发射谱激发谱和发射谱荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激激发发谱谱是是荧荧光光物物质质在在不不同同波波长长的的激激发发光光作作用用下下测测得得的的某某一一波波长长处处的的荧荧光光强强度度的的变变化化情情况况，也也就就是是不不同同波长的激发光的相对效率；波长的激发光的相对效率；发发射射谱谱则则是是某某一一固固定定波波长长的的激激发发光光作作用用下下荧荧光光强强度度在在不不同同波波长长处处的的分分布布情情况况，也也就就是是荧荧光光中中不不同同波波长长的光成分的相对强度。的光成分的相对强度。既既然然激激发发谱谱是是
24、表表示示某某种种荧荧光光物物质质在在不不同同波波长长的的激激发发光光作作用用下下所所测测得得的的同同一一波波长长下下荧荧光光强强度度的的变变化化，而而荧荧光光的的产产生生又又与与吸吸收收有有关关，因因此此激激发发谱谱和和吸吸收收谱极为相似，呈正相关关系。谱极为相似，呈正相关关系。激发谱和吸收谱的关系激发谱和吸收谱的关系由由于于激激发发态态和和基基态态有有相相似似的的振振动动能能级级分分布布，而而且且从从基基态态的的最最低低振振动动能能级级跃跃迁迁到到第第一一电电子子激激发发态态各各振振动动能能级级的的几几率率与与由由第第一一电电子子激激发发态态的的最最低低振振动动能能级级跃跃迁迁到到基基态态各
25、各振振动动能能级级的的几几率率也也相相近近，因因此此吸吸收收谱谱与与发发射射谱谱呈镜象对称关系。呈镜象对称关系。吸收谱与发射谱的关系吸收谱与发射谱的关系在在发发射射谱谱中中最最大大荧荧光光强强度度的的位位置置称称为为 maxmax，它它是是荧荧光光光光谱谱的的一一个个重重要要参参数数，对对环环境境的的极极性和荧光团的运动很敏感。性和荧光团的运动很敏感。荧光寿命荧光寿命(fluorescencelifetime)去去掉掉激激发发光光后后，分分子子的的荧荧光光强强度度降降到到去去掉掉激激发发光光时时荧荧光光强强度度I0的的1/e所所需需要要的的时时间间，称称为为荧荧光光寿寿命命，常常用用 表表示示
26、。如如荧荧光光强强度度的的衰衰减减符符合合指指数数衰衰减减的的规规律律:It I0e-kt其其中中I0是是激激发发时时最最大大荧荧光光强强度度，It是是时时间间t时时的的荧荧光光强强度度，k是是衰衰减减常常数数。假假定定在在时时间间 时时测测得得的的It为为I0的的1/e，则则 是我们定义的荧光寿命。是我们定义的荧光寿命。寿寿命命 是是衰衰减减常常数数k的的倒倒数数。事事实实上上，在在瞬瞬间间激激发发后后的的某某个个时时间间，荧荧光光强强度度达达到到最最大大值值，然然后后荧荧光光强强度度将将按按指指数数规规律律下下降降。从从最最大大荧荧光光强强度度值值后后任任一一强强度度值值下下降降到到其其1
27、/e所所需需的时间都应等于的时间都应等于 。如如果果激激发发态态分分子子只只以以发发射射荧荧光光的的方方式式丢丢失失能能量量，则则荧荧光光寿寿命命与与荧荧光光发发射射速速率率的的衰衰减减常常数数成成反反比比，荧荧光光发发射射速速率率即即为为单单位位时时间间中中发发射射的的光光子子数数，因因此此有有 F 1/KF。KF是发射速率衰减常数。是发射速率衰减常数。 F表表示示荧荧光光分分子子的的固固有有荧荧光光寿寿命命，kF表表示示荧荧光光发发射射速速率的衰减常数。率的衰减常数。处处于于激激发发态态的的分分子子，除除了了通通过过发发射射荧荧光光回回到到基基态态以以外外，还还会会通通过过一一些些其其它它
28、过过程程( (如如淬淬灭灭和和能能量量转转移移) )回回到到基基态态，其其结结果果是是加加快快了了激激发发态态分分子子回回到到基基态态的的过过程程( (或或称称退退激激过过程程) )，结果是荧光寿命降低。，结果是荧光寿命降低。寿寿命命 和和这这些些过过程程的的速速率率常常数数有有关关，总总的的退退激激过过程程的的速速率率常数常数k k可以用各种退激过程的速率常数之和来表示可以用各种退激过程的速率常数之和来表示: :k kF+ kiki表示各种非辐射过程的衰减速率常数。表示各种非辐射过程的衰减速率常数。则总的寿命则总的寿命 为为: 1/k 1/(kF+ ki)由由于于吸吸收收几几率率与与发发射射
29、几几率率有有关关， F与与摩摩尔尔消消光光系系数数 max(单单位位为为cm2mol-1或或(mol dm-3)-1cm-1)也也密密切切相相关。关。从下式可以得到从下式可以得到 F的粗略估计值的粗略估计值(单位为秒单位为秒)。1/ F104 max在在讨讨论论寿寿命命时时，必必须须注注意意不不要要把把寿寿命命与与跃跃迁迁时时间间混混淆淆起起来来。跃跃迁迁时时间间是是跃跃迁迁频频率率的的倒倒数数，而而寿寿命命是是指指分分子子在某种特定状态下存在的时间。在某种特定状态下存在的时间。通通过过量量测测寿寿命命，可可以以得得到到有有关关分分子子结结构构和和动动力力学学方方面面的信息。的信息。量子产率量
30、子产率(quantumyield)荧荧光光量量子子产产率率是是物物质质荧荧光光特特性性中中最最基基本本的的参参数数之之一一，它它表表示物质发射荧光的效率。示物质发射荧光的效率。荧荧光光量量子子产产率率通通常常用用 来来表表示示，定定义义为为发发射射量量子子数数和和吸吸收收量量子子数数之之比比，即即由由荧荧光光发发射射造造成成的的退退激激分分子子在在全全部部退退激激分分子中所占的比例，又称为荧光效率。子中所占的比例，又称为荧光效率。发射量子数发射量子数 吸收量子数吸收量子数 的的绝绝对对值值是是较较难难用用实实验验的的方方法法测测量量的的，因因为为必必须须事事先先知知道道仪仪器器的的修修正正因因
31、子子。实实际际测测量量中中大大多多采采用用相相对对法法，即即用用已已知量子产率的标准样品与待测样品进行比较。知量子产率的标准样品与待测样品进行比较。后后面面将将要要证证明明: :对对稀稀溶溶液液来来说说，荧荧光光强强度度F F与与吸吸收收度度A A成成正正比比: :F kI0A 这这里里k是是比比例例常常数数，I0是是吸吸收收前前的的光光强强度度， 是是荧荧光光量量子子产率。产率。若两种溶液测量条件完全相同，则它们的若两种溶液测量条件完全相同，则它们的k和和I0相同相同:F1/F2 A1 1/(A2 2) 1/ 2 F1A2/(F2A1)已知已知 2就可求出就可求出 1。Fluorophore
32、sarecomparedusingtheratiooftheirfluorescenceyields OftenOften fluorophoresfluorophores arearecomparedcomparedusingusingthetheratioratioofoftheirtheirfluorescenceyields.fluorescenceyields. AsAs wewe seesee inin FigureFigure11.13,11.13,thisthisrelativerelative fluorescencefluorescence yieldyield willw
33、illdependdependononthethewavelengthwavelength chosenchosen forforobservationobservation becausebecause ofofthetheshapesshapesofofthethefluorescencespectra.fluorescencespectra.Figure 11.13 The relative fluorescenceyield is defined for a single wavelengthand depends on the wavelength chosenforobservat
34、ion.由由于于各各种种竞竞争争性性过过程程而而使使荧荧光光量量子子产产率率减减小小的的现现象象称称为为淬淬灭灭( (quenching) )，如如温温度度淬淬灭灭、杂杂质质淬淬灭灭等等。量量子子产产率率对对于于生生色色团团周周围围的的环环境境以以及及各各种种淬淬灭灭过过程程很很敏敏感感。量量子子产产率率的的改改变变必必然然会会引引起起荧荧光光强强度度的的改改变变。因因此此，如如果果只只需需要要研研究究量量子子产产率率的的相相对对值值，则则只要量测荧光强度也就足够了。只要量测荧光强度也就足够了。荧光强度荧光强度荧荧光光强强度度F取取决决于于激激发发态态的的初初始始分分布布IA与与量量子子产产率
35、率 的的乘积。乘积。这这里里的的F指指的的是是向向各各个个方方向向上上发发射射的的荧荧光光强强度度的的总总和和，实实际际上上，谱谱仪仪收收集集的的只只是是其其中中的的一一小小部部分分。因因此此仪仪器器测测到的荧光强度到的荧光强度 IA Z，这里这里Z是仪器因子。是仪器因子。椐据椐据Beer-Lambert定律可以推得：定律可以推得：F=2.3I0 ( A)CL Z式中式中 ( A)为激发波长为激发波长 A处的消光系数，处的消光系数，为样品分为样品分子的浓度，子的浓度，I0为入射光强度，为入射光强度，I0为透过样品后的光强度，为透过样品后的光强度，L为光程（样品池光径）为光程（样品池光径）如果激
36、发光强保持不变，且如果激发光强保持不变，且 和和Z与激发波长无关，则与激发波长无关，则F ( A)很显然，荧光强度与样品在波度很显然，荧光强度与样品在波度 A处的消光系数有关，处的消光系数有关，而消光系数与激发波长是密切相关的，消光系数随波长而消光系数与激发波长是密切相关的，消光系数随波长的变化即吸收谱，因此荧光强度也随激发波长的变化而的变化即吸收谱，因此荧光强度也随激发波长的变化而变化。激发谱与吸收谱呈现正相关关系。变化。激发谱与吸收谱呈现正相关关系。当然，实际上仪器因子当然，实际上仪器因子Z与波长是有关的，这就使得激与波长是有关的，这就使得激发谱与吸收谱并不完全相似。发谱与吸收谱并不完全相
37、似。荧光偏振荧光偏振（偏振荧光，极化荧光）（偏振荧光，极化荧光）用平面极化光（偏振光）去激发一个荧光系统，用平面极化光（偏振光）去激发一个荧光系统，可以产生极化荧光。可以通过对极化荧光的分析可以产生极化荧光。可以通过对极化荧光的分析确定分子的大小、形状和流动性等性质。因此极确定分子的大小、形状和流动性等性质。因此极化荧光分析在生物研究中是一种有力的手段化荧光分析在生物研究中是一种有力的手段。荧荧光光偏偏振振是是指指物物质质在在受受激激发发时时发发射射的的荧荧光光常常为为偏偏振振光光这这样样一一种种性性质质。溶溶液液中中分分子子偶偶极极矩矩方方向向的的分分布布是是随随机机的的，为为什什么么用用偏
38、偏振振光光激激发发时时产产生生的的荧荧光光是是偏偏振振光光呢呢？从从经经典典物物理理的的观观点点来来看看，电电子子的的跃跃迁迁相相应应于于一一个个电电偶偶极极子子的的振振动动，其其振振动动方方向向和和电电场场变变化化方方向向一一致致时时被被激激发发发发的的几几率率最最大大，并并随随两两者者间间夹夹角角余余弦弦的的平平方方（COSCOS2 2 ）而而变变化化。电电偶偶极极子子发发射射的的荧荧光光在在与与电电偶偶极极子子方方向向垂垂直直的的方方向向上上最最强强（即即荧荧光光传传播播方方向向与与电电偶偶极极子子方方向向垂垂直直的的荧荧光光最最强强），在在与与电电偶偶极极子子平平行行的的方方向向上最弱
39、。上最弱。溶溶液液中中的的分分子子，其其分分布布是是随随机机的的，而而且且从从吸吸收收到到发发射射的的时时间间之之内内，分分子子本本身身已已经经产产生生了了转转动动，因因此此荧荧光光偏偏振振的的程程度度将将减减小小，所所以以荧荧光光偏偏振振又又常常称称为为荧荧光光消偏振或荧光去偏振。消偏振或荧光去偏振。在在分分子子朝朝向向无无规规律律但但分分子子不不能能自自由由运运动动的的溶溶液液中中，的的值值称称为为本本征征极极化化率率P0。如如果果分分子子在在激激发发态态的的寿寿命期间有一定的运动，则的值可能与命期间有一定的运动，则的值可能与P0不等。不等。T-format for polarizatio
40、nmeasurements.DET,detector;G,gain.Subscriptsrefertohorizontal (H), vertical (V),perpendicular( )andparallel( ).图图荧光偏振测量荧光偏振测量如如图图所所示示，假假设设沿沿z轴轴振振动动的的平平面面极极化化光光由由x轴轴入入射射原原点点，在在原原点点有有荧荧光光分分子子，受受其其激激发发后后此此分分子子发发射射极极化化荧荧光光，在在y轴轴收收集集极极化化荧荧光光，令令I I为为沿沿轴轴振振动动的的极极化化荧荧光光，令令I I 为为沿轴振动的极化荧光。沿轴振动的极化荧光。 如如图图所所示示
41、，假假设设沿沿z轴轴振振动动的的平平面面极极化化光光由由x轴轴入入射射原原点点，在在原原点点有有荧荧光光分分子子，受受其其激激发发后后此此分分子子发发射射极极化化荧荧光光，在在y轴轴收收集集极极化化荧荧光光，令令I为为沿沿轴轴振振动动的的极极化化荧荧光光，令令I 为为沿轴振动的极化荧光。沿轴振动的极化荧光。定义极化率定义极化率(或偏振度或偏振度)P P (I(II I )/(I)/(I+I+I ) ) (I(IVVVVI IVHVH)/(I)/(IVVVV+I+IVHVH) )下下标标中中的的前前、后后两两个个字字母母分分别别表表示示入入射射光光和和发发射射光光的的偏偏振振方方向向，V(ver
42、tical)表表示示垂垂直直，H(horizontal)表表示示水水平平，如如其其中中IVH是是指指入入射射光光偏偏振振方方向向为为垂垂直直而而发发射射光光为为水水平平时时测测得的荧光强度，其它如得的荧光强度，其它如IVV也依此类推也依此类推。由于单色器和光电倍增管等对垂直和水平两个偏振成由于单色器和光电倍增管等对垂直和水平两个偏振成分的敏感度可能不同，因而严格的测定需要引入校正分的敏感度可能不同，因而严格的测定需要引入校正因子因子G G，定义定义G G为水平偏振光激发样品时，仪器对垂直为水平偏振光激发样品时，仪器对垂直偏振光的透射效率与对水平偏振光透射效率之比，为偏振光的透射效率与对水平偏振
43、光透射效率之比，为G IHV/IHHIHV为为起起偏偏器器水水平平取取向向而而检检偏偏器器垂垂直直取取向向时时测测得得的的荧荧光光强强度度，IHH为为起起偏偏器器和和检检偏偏器器均均为为水水平平取取向向时时测测得得的的荧荧光光强强度度。仪仪器器不不同同，波波长长不不同同，值值都都可可能能不不同同，应分别测定。应分别测定。经校正后的荧光偏振度经校正后的荧光偏振度 (IVV GIVH)/(IVV+GIVH)定义定义不对称度不对称度(或荧光或荧光各向异性，各向异性，anisotropyfactor)A (I I )/(I+2I )(I+2I )表示发射光的全部，包括平行于入射光表示发射光的全部，包括
44、平行于入射光方向上的以及与入射光轴垂直的两个方向上的分方向上的以及与入射光轴垂直的两个方向上的分量。量。经校正后的不对称度经校正后的不对称度A (IVV GIVH)/(IVV+2GIVH)Additivitypropertiesofpolarizationthe average anisotropy measured for amixtureofcomponentsisjustthesumofthe individual anisotropies weighed bytheirfluorescenceyield F,(11.14)P P和和A A的的量量测测有有时时在在稳稳态态条条件件下下进进
45、行行，即即采采用用恒恒定定的的光光照照。但但有有时时也也用用毫毫微微秒秒量量级级的的偏偏振振光光脉脉冲冲来来测测量量I I和和I I 的的时时间间函函数数。这这种种技技术术常常能能测测到到一一些些其其他他的的运运动动，是是一一种种时间分辨的技术。时间分辨的技术。环境对荧光参数的影响环境对荧光参数的影响荧荧光光分分析析的的主主要要特特点点是是灵灵敏敏度度高高。一一般般来来说说，荧荧光光分分析析的的灵灵敏敏度度要要比比吸吸收收光光谱谱测测量量高高23个个数数量量级级。但但正正因因为为其其灵灵敏敏度度高高，因因此此也也容容易易受受到到各各种种因因素素的的干干扰扰。例例如如样样品品的的温温度度度度、p
46、H值值以以及及样样品品中中杂杂质质的的存存在在等等等等。有有时时，为为了了得得到到可可靠靠的的结结果果，实实验验设设计计和和操操作作中中需需要要考考虑虑和和设设法法减减少少这这些些因因素素的的影影响响；有有时时，也也可可巧巧妙妙地地利利用用荧荧光参数对环境困素的敏感性来达到我们的目的。光参数对环境困素的敏感性来达到我们的目的。下下面面，我我们们将将分分别别列列举举一一些些环环境境因因素素对对 max、 F和和 F等荧光参数的影响。等荧光参数的影响。Solventeffects SolventSolvent effectseffects willwill affectaffect thethe
47、positionposition ofof thethe fluorescencefluorescenceband.band.TheTheeffectseffectsofofaasolventsolventononfluorescencefluorescencecancanbebeveryverylarge,andmanystudiesofmacromoleculesusethisfact.large,andmanystudiesofmacromoleculesusethisfact. General General solvent solvent effectseffects dependd
48、ependononthethepolarizabilitypolarizabilityofofthethesolvent,solvent,andandincreasingincreasingthethedielectricdielectricconstantconstantusuallyusuallyshiftsshiftsthefluorescencetolongerwavelength.thefluorescencetolongerwavelength. Specific Specific solvent solvent effectseffects arearethetheresultr
49、esultofofchemicalchemicalreactionreactionofof thethe excitedexcited statestate withwith thethe solvent.solvent. ImportantImportant chemicalchemicalreactionsinclude:reactionsinclude:hydrogen-bondinghydrogen-bondingacid-basechemistryacid-basechemistrythethe formationformation ofof charge-transfercharg
50、e-transfer complexescomplexes wherewhere ananelectronelectronininthethefluorophorefluorophoreisistransferredtransferredtotoanotheranothergroupgrouponexcitation.onexcitation.Generalsolventeffects GeneralGeneral solventsolvent effectseffects involveinvolve thethe interactioninteraction ofof thetheperm
51、anentpermanentdipoledipolemomentmomentofofthethemoleculemoleculeininbothboththethegroundground andand excitedexcited statesstates withwith thethe reactivereactive fieldfieldinducedinthesurroundingsolvent.inducedinthesurroundingsolvent. Thereactivefieldhastwoparts:Thereactivefieldhastwoparts:theimmed
52、iatereactionoftheelectronsofthesolventmoleculestheimmediatereactionoftheelectronsofthesolventmoleculesthethe slowerslower reorientationreorientation reactionreaction ofof thethe solventsolvent moleculesmolecules asas aawholeduetotheirownpermanentdipolemoment.wholeduetotheirownpermanentdipolemoment.
53、溶剂影响的结果可以用溶剂影响的结果可以用Lippert方程来描述：方程来描述：常数常数其其中中， a与与 f分分别别为为荧荧光光分分子子的的吸吸收收波波数数与与发发射射波波数数， af反反映映了了吸吸收收光光与与发发射射光光能能量量的的差差别别； 为为溶溶剂剂的的介介电电常常数数；h为为普普朗朗克克常常数数；c为为光光速速，a为为荧荧光光分分子子在在溶溶剂剂中中的的半半径径， 与与 分分别别为为荧荧光光分子处于基态和激发态时的偶极矩。分子处于基态和激发态时的偶极矩。由由上上式式可可见见，介介电电常常数数增增加加会会使使能能量量差差增增大大，而而折折射射率率增增加加使使能能量量差差减减少少。由由
54、于于荧荧光光分分子子激激发发态态的的偶偶极极矩矩 一一般般要要大大于于基基态态偶偶极极矩矩 ，荧荧光光分分子子偶偶极极矩矩的的增增大大与与溶溶剂剂分分子子相相互互作作用用，使使溶溶剂剂分分子子的的电电子子分分布布和和偶偶极极子子取取向向发发生生变变化化。溶溶剂剂偶偶极极子子的的重重新新取取向向需需要要比比电电子子重重新新分分布布长长得得多多的的时时间间。介介电电常常数数 不不仅仅与与偶偶极极子子取取向向有有关关，也也与与电电子子取取向向有有关关，上上式式中中第第一一项项()/(2)是是电电子子和和偶偶极极子子重重新新取取向向的的结结果果；折折射射率率n n与与电电子子重重新新分分布布有有关关，
55、因因此此上上式式中中第第二二项项是是电电子子重重新新分布的结果。分布的结果。由由于于非非极极性性溶溶剂剂分分子子没没有有偶偶极极矩矩，因因此此没没有有在在激激发发态态荧荧光光分分子子的的作作用用下下偶偶极极子子重重新新取取向向的的问问题题， n2， af很很小小。而而在极性溶剂中在极性溶剂中 af 较大，产生红移。较大，产生红移。Specificsolventeffects TheyTheyoftenoftenaccompanyaccompanygeneralgeneralsolventsolventeffects,effects,becausebecausesolventssolventsw
56、ithwithaalargelargepolarizabilitypolarizabilityareareusuallyusuallycapablecapableofofhydrogenbonding.hydrogenbonding. SpecificSpecific solventsolvent effectseffects occuroccur whenwhen thethe solventsolventreactschemicallywiththefluorophore.reactschemicallywiththefluorophore. OnlyOnly aa smallsmall
57、concentrationconcentration ofof thethe chemicallychemically reactingreactingsolventisnecessarytobringtheeffecttocompletion.solventisnecessarytobringtheeffecttocompletion. TheThe newnew speciesspecies oftenoften hashas aa newnew characteristiccharacteristicfluorescentband.fluorescentband.TraceTrace a
58、mountsamounts ofof ethanolethanol addedadded toto aa cyclohexanecyclohexanebulkbulksolventsolventgivegiveriserisetotoaanewnewfluorescentfluorescentbandbandatataboutabout400400nm,nm,whichwhichisispresumablypresumablydueduetotothethe2-AN-2-AN-ethanolhydrogen-bondedcomplex.ethanolhydrogen-bondedcomplex
59、. Thehydrogenbondingreactionof2-ANwithethanolThefluorescenceof2-ANisshownincyclohexanetowhichethanolwasaddedat0%(),0.2%(.),0.4%(),0.7%(),l.7%(),and2.7%().环境因素对环境因素对 max的影响的影响一一般般来来说说，处处于于第第一一电电子子激激发发态态的的分分子子，其其电电荷荷分分布布与与它它处处于于基基态态时时是是不不同同的的。生生色色团团与与周周围围溶溶剂剂分分子子的的相相互互作作用用可可能能会会先先于于发发射射而而发发生生，这这种种相相互互
60、作作用用会会改改变变激激发发态态的的能能量量及及荧荧光光发发射射的的频频率率。引引起起每每个个电电子子能能级级中中最最低低振振动动能能级级之之间间的的吸吸收收和和发发射射跃跃迁迁（即即0-00-0跃跃迁迁）的的不不平平衡衡，并并会会破破坏坏镜象关系。镜象关系。同同一一种种荧荧光光物物质质在在不不同同极极性性的的环环境境中中，其其 max 可可能能会会有有所所差差别别。一一般般来来说说，激激发发态态的的极极性性比比基基态态要要强强，因因此此被被激激发发的的荧荧光光分分子子将将趋趋向向于于与与极极性性溶溶剂剂（或或极极性性环环境境）相相互互作作用用，使使溶溶剂剂分分子子的的电电子子分分布布会会发发
61、生生变变化化，偶偶极极子子重重新新取取向向，而而这这又又会会反反过过来来影影响响荧荧光光分分子子的的基基态态和和激激发发态态能能级级，减减少少激激发发态态的的能能量量，引引起起发发射射谱谱的的红红移移。例例如如，当当溶溶剂剂的的极极性性由由乙乙二二醇醇、甲甲醇醇、异异丙丙醇醇到到辛辛醇醇依依次次减减小小时时，ANS（1-1-氨氨基基- -8-8-萘萘磺磺酸酸酯酯，一一种种荧荧光光探探针针，常常用用于于与与蛋蛋白白质质非非共共价价结结合合）的的荧荧光光谱谱发发生生兰移，量子产率提高。兰移，量子产率提高。 环境环境(如溶剂如溶剂)的极性对的极性对 max的影响的影响上上面面提提到到的的“环环境境极
62、极性性加加强强， max红红移移”的的规规律律，并并不不是是绝绝对对的的。例例如如，如如果果在在激激发发态态的的寿寿命命之之内内，分分子子没没有有足足够够的的时时间间来来重重新新排排列列并并降降低低激激发发态态的的能能量量，则则可可能能发发生生 max兰兰 移移 的的 情情 况况 。 这这 种种 现现 象象 称称 为为“orientationconstraint”。因因此此在在利利用用 max作为环境极性的探针时要十分谨慎。作为环境极性的探针时要十分谨慎。pHpH值对值对 max的影响的影响如如果果荧荧光光物物质质为为弱弱酸酸或或弱弱碱碱，则则溶溶液液pHpH值值的的改改变变常常对对 maxm
63、ax有有影影响响。这这是是因因为为弱弱酸酸和和弱弱碱碱分分子子和和其其离离子子在在电电子子结结构构上上有有所所不不同同，因因而而荧荧光光 maxmax也也可可能能发发生生变变化化。例例如如，1-1-萘萘胺胺-5-5-磺磺酸酸在在不不同同pHpH值值时时，会会以以两两种种不不同同离离子子的的形形式式存存在在，这这两两种种离离子子的的荧荧光光波波长长是是不不同同的的。利利用用这这种种效效应应，可可以以将将其其荧荧光光波波长作为长作为pHpH值的指示剂。值的指示剂。溶液粘度对溶液粘度对 max的影响的影响溶溶液液粘粘度度有有时时也也会会对对 maxmax有有影影响响，例例如如荧荧光光探探针针TNST
64、NS在在蔗蔗糖糖水水溶溶液液中中的的 maxmax会会随随蔗蔗糖糖浓浓度度的的变变化化而而变变化化。当当蔗蔗糖糖浓浓度度由由10%10%增增加加到到60%60%，粘粘度度从从1.31.3分分泊泊增增加加到到5858分分泊泊， maxmax从从580 nm580 nm兰移到兰移到555 nm555 nm。共振能量转移对共振能量转移对 max的影响的影响如如果果两两种种生生色色团团荧荧光光频频率率接接近近，则则当当两两种种基基团团足足够够接接近近时时，用用一一种种生生色色团团能能吸吸收收的的光光激激发发使使之之处处于于激激发发态态后后，处处于于激激发发态态的的这这种种生生色色团团可可能能将将激激发
65、发能能转转移移到到另另一一种种生生色色团团，使使第第二二种种生生色色团团进进入入激激发发态态，产产生生第第二二种种生生色色团团特特有有的的荧荧光光，这这种种现现象象称称为为共共振振能能量量转转移移。显显然然，共共振振能能量量转转移移对对 maxmax可能造成影响。可能造成影响。环境对荧光量子产率环境对荧光量子产率 F和和荧光强度的影响荧光强度的影响由于稀溶液中荧光强度由于稀溶液中荧光强度F K I0 A F （这这里里I I0 0是激发光强度，是激发光强度，A A是光密度或吸收度，是光密度或吸收度， 0 0是荧光量子产率，是荧光量子产率，K K为常数）为常数） ，因此凡因此凡是会影响荧光量子产
66、率是会影响荧光量子产率 F F的环境因素也必的环境因素也必然会影响荧光强度。然会影响荧光强度。溶剂（或环境）极性的影响溶剂（或环境）极性的影响量量子子产产率率（荧荧光光强强度度）会会随随着着溶溶剂剂（或或环环境境）极极性性的的减减小小而而增增加加。这这一一点点前前面面已已经经提提到到过过。一一种种可可能能的的机机制制是是：在在非非极极性性的的溶溶剂剂中中系系间间交交连连（转转移移到到另另外外的的激激发发态态）的速率会减少。的速率会减少。光化分解光化分解荧荧光光物物质质因因吸吸收收光光能能而而造造成成某某一一键键断断裂裂的的现现象象称称为为光光化化分分解解（photodissociation），
67、光光化化分分解解会会造造成成荧荧光光逐逐渐渐减减弱弱。尤尤其其是是对对于于稀稀溶溶液液来来说说，光化分解就更为严重。光化分解就更为严重。温度对荧光强度的影响温度对荧光强度的影响一一般般来来说说，溶溶液液的的荧荧光光强强度度随随温温度度的的降降低低而而增增强强，温温度度的的升升高高与与荧荧光光强强度度的的减减弱弱在在一一定定范范围围内内是是线线性性关关系系。温温度度每每升升高高1 1 C C，荧荧光光减减弱弱的的百百分分数数称称为为温温度度系系数数。一一般般荧荧光光物物质质的的温温度度系系数数大大约约为为1%1%，但但有有些些荧荧光光物物质质可可大大到到5%5%。 温温度度升升高高，荧荧光光强强
68、度度减减弱弱的的原原因因主主要要是是溶溶液液的的粘粘度度减减小小，溶溶剂剂与与溶溶质质分分子子的的动动能能增增加加，使使得得荧荧光光分分子子的的其其它它分分子子之之间间的的碰碰撞撞几几率率增增加加，激激发发态态荧荧光光分分子子通通过过分分子子间间碰碰撞撞或或分分子子内内能能量量的的转转移移，将将自自己己的的能能量量转转移移出出去去。以以非非荧荧光光发发射射的的形形式式回回到到基基态态，这这就就造造成成荧荧光光淬淬灭灭、量量子子产产率率降降低低的的情情况况。如如果果溶溶液液中中有有淬淬灭灭剂剂存存在在，则则淬淬灭灭剂剂的的作作用用也会随温度升高而增大。也会随温度升高而增大。 为为减减少少温温度度
69、对对荧荧光光强强度度的的影影响响，可可采采用用恒恒温温样样品架维持样品温度的恒定。品架维持样品温度的恒定。样品浓度对荧光强度的影响样品浓度对荧光强度的影响在在样样品品浓浓度度较较低低时时，荧荧光光强强度度与与荧荧光光物物质质的的浓浓度度成成正正比比。但但到到了了一一定定浓浓度度以以后后，就就不再存在这种正比关系。这是因为：不再存在这种正比关系。这是因为：荧荧光光强强度度F K I0 (1 e l c)，这这里里K 是是仪仪器器常常数数， 是是量量子子产产率率，I0 是是激激发发光光强强度度， 是是克克分分子子消消光光系系数数，l是是样样品品池池光光径径，C是是样样品品浓浓度度。浓浓度度增增加加
70、到到一一定定程程度度后后，elc 接接近近0，浓浓度度继继续续增增加加，荧荧光光强强度度不不再再增增加加。只有样品浓度很稀时，只有样品浓度很稀时，F K I0 1 (1 l c) K I0 l CII. II. 荧荧光光浓浓度度过过大大时时，常常常常发发生生淬淬灭灭现现象象。这这样样就就使使荧荧光光强强度度反反而而大大大大低低于于接接近近饱饱和和时的荧光强度。时的荧光强度。对对于于浓浓度度淬淬灭灭产产生生的的原原因因最最简简单单的的解解释释是是：激激发发态态分分子子在在发发出出荧荧光光之之前前就就和和未未激激发发的的荧光物质分子碰撞而自淬灭。荧光物质分子碰撞而自淬灭。III. III. 浓度过
71、高，可能形成样品分子的二聚浓度过高，可能形成样品分子的二聚体或多聚体，因而降低荧光强度。体或多聚体，因而降低荧光强度。产产生生浓浓度度淬淬灭灭的的另另一一个个重重要要原原因因之之一一是是：当当溶溶液液较较浓浓时时，激激发发光光一一进进入入溶溶液液，就就被被靠靠近近光光源源一一侧侧的的样样品品池池壁壁的的荧荧光光分分子子大大量量吸吸收收，这这样样，越越进进入入溶溶液液，发发荧荧光光分分子子越越少少，因因而而大大量量的的激激发发光光在在到到达达池池中中心心之之前前就就被被吸吸收收了了。这这样样，样样品品池池中中心心区区域域内内能能被被激激发发的的荧荧光光分分子子数数量量就就很很有有限限了了。即即使
72、使是是样样品品池池中中心心区区域域内内能能被被激激发发的的荧荧光光分分子子，它它们们发发出出的的荧荧光光又又可可能能被被它它们们与与检检测测器器之之间间的的荧荧光光分分子子吸吸收收（如如果果物物质质本本身身的的吸吸收收光光谱谱和和发发射射光光谱谱有有重重叠叠的的话话），这这样样，大大部部分分荧荧光光分分子子发发射射的荧光在离开吸收池前就又被吸收。的荧光在离开吸收池前就又被吸收。解解决决浓浓度度淬淬灭灭的的办办法法之之一一，是是将将样样品品尽尽量量稀稀释释到到荧荧光光强强度度与与荧荧光光染染料料浓浓度度成成范范围围线线性性关关系系的的浓浓度度来测量。来测量。浓浓度度淬淬灭灭的的现现象象有有时时也
73、也可可以以加加以以利利用用，例例如如在在脂脂质质体体里里包包裹裹高高浓浓度度的的荧荧光光染染料料，由由于于浓浓度度淬淬灭灭，包包裹裹在在脂脂质质体体内内的的荧荧光光染染料料荧荧光光强强度度很很低低。一一旦旦荧荧光光染染料料从从脂脂质质体体内内泄泄漏漏出出来来，由由于于荧荧光光染染料料浓浓度下降，进入线性区，因此荧光强度大大增加。度下降，进入线性区，因此荧光强度大大增加。杂质对量子产率杂质对量子产率（荧光强度）的影响（荧光强度）的影响除除荧荧光光分分子子之之外外的的其其它它分分子子与与荧荧光光分分子子的的相相互互作作用用使使荧荧光光量量子子产产率率减减少少的的现现象象统统称为杂质淬灭。称为杂质淬
74、灭。会会引引起起荧荧光光淬淬来来的的物物质质称称为为淬淬灭灭剂剂。例例如如中中性性的的0.1 0.1 M M磷磷酸酸缓缓冲冲液液能能淬淬灭灭酪酪氨氨酸酸的荧光。的荧光。杂质淬灭的几种形式杂质淬灭的几种形式. . 碰碰撞撞淬淬灭灭：溶溶液液中中荧荧光光分分子子与与淬淬灭灭剂剂分分子子碰碰撞撞，荧荧光光分分子子损损失失能能量量而而导导致致量量子子产产率率减减少少，荧荧光强度降低。光强度降低。. . 组组成成化化合合物物导导致致荧荧光光淬淬灭灭：一一部部分分荧荧光光分分子子与与淬淬灭灭剂剂分分子子作作用用而而形形成成络络合合物物。这这种种络络合合物物本本身身可可能能不不发发荧荧光光，也也可可能能会会
75、具具有有吸吸收收激激发发光光能能或或荧荧光光物物质质所所发发射射的的荧荧光光光光能能的的能能力力，从从而而减减少少观观察到的荧光（内滤光效应）。察到的荧光（内滤光效应）。. . 含含溴溴、含含碘碘化化合合物物、硝硝基基化化合合物物、重重氮氮化化合合物物、羰羰基基化化合合物物、羧羧基基化化合合物物及及某某些些杂杂环环化化合合物物容容易易由由单单线线态态转转变变至至三三线线态态。转转入入三三线线态态的的分分子子在在常常温温下下不不发发光光，它它们们把把多多余余的的能能量量消消耗耗在在与与其其它它分分子子的的碰碰撞撞中中，引引起起荧荧光光淬淬灭灭。只只有有在在低低温温下下，由三线态返回基态而放出波长
76、的磷光。由三线态返回基态而放出波长的磷光。. . 发生电子转移反应的淬灭。发生电子转移反应的淬灭。 某某些些淬淬灭灭剂剂分分子子与与荧荧光光物物质质分分子子相相互互作作用用时时会会发发生生电电子子转转移移反反应应，即即氧氧化化 还还原原反反应应，从从而而引引起起荧荧光光淬淬灭灭。甲甲基基兰兰荧荧光光溶溶液液被被Fe 2淬淬灭灭就就是是一一个个例例子子。发发生生电电子子转转移移反反应应的的淬淬灭灭剂剂并并不不限限于于金金属属离离子子。I I 、BrBr 等等易易于于给给出出电电子子的的阴阴离离子子对对奎奎宁宁、罗罗丹丹明明及及荧荧光光素素钠钠等等有有机机荧荧光光物物质质也也会会发发生生淬灭作用。
77、淬灭作用。引引起起淬淬灭灭的的一一种种最最常常见见的的物物质质是是处处于于三三线线态态的的活活性性氧氧。产产生生淬淬灭灭的的原原因因主主要要是是由由于于处处于于三三线线态态的的活活性性氧氧分分子子与与单单线线态态的的荧荧光光分分子子相相互互作作用用时时会会形形成成单单线线态态的的氧氧分分子子和和三三线线态态的的荧荧光光分分子子。氧氧在在弱弱极极性性溶溶剂剂中中的的溶溶解解度度比比较较高高，例例如如氧氧在在乙乙烷烷中中的的溶溶解解度度约约为为在在水水中中的的几几倍倍。因因此此必必须须通通氮氮赶赶氧氧，克服这种淬灭。克服这种淬灭。. . 共振能量转移：（略）共振能量转移：（略）总总的的来来说说，为
78、为克克服服杂杂质质淬淬灭灭带带来来的的问问题题，对对所所使使用用的的溶溶剂剂或或缓缓冲冲液液，首首先先要要考考虑虑其其对所使用的荧光物质是否有直接作用。对所使用的荧光物质是否有直接作用。另另外外必必须须考考虑虑溶溶剂剂的的纯纯度度。如如洗洗液液中中的的重重铬铬酸酸钾钾，其其两两个个吸吸收收峰峰恰恰好好在在色色氨氨酸酸的的激激发发和和发发射射峰峰附附近近，会会吸吸收收色色氨氨酸酸的的激激发发能能及及其其发发射射的的荧荧光光（内内滤滤光光效效应应）因因此此荧荧光光器皿不能用洗液来洗。器皿不能用洗液来洗。pH值对量子产率和荧光强度的影响值对量子产率和荧光强度的影响如如荧荧光光物物质质为为弱弱酸酸或或
79、弱弱碱碱，则则溶溶液液pHpH值值的的改改变变常常对对荧荧光光强强度度有有较较大大影影响响。利利用用这这些些物物质质对对pHpH值值的的敏敏感感性性，可可以以将将它它们们用用作作pHpH指指示示剂剂，或或利利用用它它们们在在不不同同pHpH值值溶溶液液中中荧荧光光强强度度的的改改变变来来判判断断酸酸碱碱滴滴定定的的终终点点（特特别别是是在在有有色色或或混混浊浊的的溶溶液液中中）。pHpH值值对对量量子子产产率率和和荧荧光光强强度度的的影影响响的的另另一一个个例例子子是是，pH pH 10.910.9时时，色色氨氨酸酸量量子子产产率率最最高高，为为0.510.51； pH pH 在在4 48 8
80、之之间间，量量子子产产率率为为0.20.2；pHpH小于小于4 4时，量子产率只有时，量子产率只有0.0850.085。溶液粘度对荧光强度的影响溶液粘度对荧光强度的影响荧荧光光强强度度一一般般随随介介质质粘粘度度的的升升高高而而增增强强。因因为为介介质质粘粘度度增增加加，减减少少了了分分子子碰碰撞撞，从从而而减减少少了了能能量量损损失失。例例如如荧荧光光物物质质TNSTNS在在不不同同浓浓度度的的蔗蔗糖水溶液中，荧光强度随粘度增加而增加。糖水溶液中，荧光强度随粘度增加而增加。其它各种干扰因素其它各种干扰因素一些其它的干扰因素可能影响荧光强度：一些其它的干扰因素可能影响荧光强度：光光散散射射可可
81、能能影影响响荧荧光光强强度度。区区分分散散射射光光和和荧荧光光发发射射的的依依据据，是是散散射射光光与与激激发发光光波波长长相相同同，离离荧荧光光峰较远；峰较远；荧光污染荧光污染也是影响荧光强度的一种因素：也是影响荧光强度的一种因素：洗涤器皿的合成去污剂常能产生很强的荧光；洗涤器皿的合成去污剂常能产生很强的荧光；分液偏斗上涂的润滑油也有很强的荧光；分液偏斗上涂的润滑油也有很强的荧光；溶液中微生物的产生；溶液中微生物的产生；滤纸中的杂质；滤纸中的杂质；表面吸咐表面吸咐也会对稀溶液的荧光测定造成影响。也会对稀溶液的荧光测定造成影响。环境因素对荧光寿命的影响环境因素对荧光寿命的影响碰撞淬灭碰撞淬灭前
82、面曾提到碰撞淬灭会降低荧光强度，碰撞淬灭前面曾提到碰撞淬灭会降低荧光强度，碰撞淬灭也可能使荧光寿命缩短。例如前面提到的也可能使荧光寿命缩短。例如前面提到的0.1M0.1M磷磷酸缓冲液，能使酪氨酸的荧光寿命从酸缓冲液，能使酪氨酸的荧光寿命从3.4 ns3.4 ns缩短缩短到到2.6 ns2.6 ns。浓度与荧光寿命的关系浓度与荧光寿命的关系荧荧光光生生色色团团的的浓浓度度增增加加，荧荧光光量量子子产产率率下下降降，但但荧荧光光寿寿命命不不一一定定减减少少，一一些些荧荧光光染染料料的的荧荧光光寿寿命命反反而而随随浓浓度度的的增增加加而而延延长长。这这种种现现象象不不是是由由于于二二聚聚体体的的形形
83、成成，而而是是由由于于自自吸吸收收。特特别别是是当当吸吸收收光光谱谱与与荧荧光光光光谱谱有有较较大大重重叠叠时时，重重叠叠区区的的荧荧光光发发射射后后，再再一一次次被被吸吸收收，经经历历了了二二次次激激发或多次激发，测量到的表观寿命就会延长。发或多次激发，测量到的表观寿命就会延长。分子内环境与荧光寿命分子内环境与荧光寿命生生色色团团在在分分子子内内的的环环境境也也会会影影响响荧荧光光寿寿命命，正正是是由由于于这这个个原原因因，荧荧光光寿寿命命才才被被用用来来分分析析分分子子内内不不同同的的生生色色团团所所处处的的环环境境。当当然然，严严格格地地说，分子内环境和外环境是两个不同的概念。说，分子内
84、环境和外环境是两个不同的概念。除除上上述述可可能能影影响响荧荧光光寿寿命命的的因因素素之之外外，实实际际中中要要注注意意的的是是，不不同同测测量量方方法法测测出出的的寿寿命命也也会会有有一一定定差差别别。因因此此研研究究荧荧光光寿寿命命时时，相相同同方法和相同条件测量出来的寿命才有可比性方法和相同条件测量出来的寿命才有可比性环境对荧光偏振度的影响环境对荧光偏振度的影响温度对荧光偏振度温度对荧光偏振度P P的影响的影响 温温度度对对荧荧光光偏偏振振度度P P的的影影响响：一一般般来来说说，温温度度升高，荧光偏振度会下降。升高，荧光偏振度会下降。粘度对荧光偏振度的影响粘度对荧光偏振度的影响 随着粘
85、度的提高，荧光偏振度也会上升。随着粘度的提高，荧光偏振度也会上升。荧光光谱在生物学中的应用荧光光谱在生物学中的应用天然荧光生色团和荧光探针(Naturalfluorophoresandfluorescentprobes)Fluorescentmoleculesareoftenreferredtoasfluorophores.判断荧光生色团的标准 判判判判断断断断化化化化合合合合物物物物能能能能否否否否产产产产生生生生荧荧荧荧光光光光，可可可可以以以以从从从从以以以以下下下下几几几几个个个个方方方方面面面面来来来来分分分分析析析析： 碳碳碳碳原原原原子子子子骨骨骨骨架架架架：具具具具有有有有共共
86、共共轭轭轭轭双双双双键键键键体体体体系系系系的的的的分分分分子子子子容容容容易易易易产产产产生生生生荧荧荧荧光光光光。绝绝绝绝大大大大多多多多数数数数荧荧荧荧光光光光物物物物质质质质含含含含有有有有芳芳芳芳香香香香环环环环或或或或杂杂杂杂环环环环。任任任任何何何何有有有有利利利利于于于于 电电电电子共轭度的结构变化都将提高荧光效率。子共轭度的结构变化都将提高荧光效率。子共轭度的结构变化都将提高荧光效率。子共轭度的结构变化都将提高荧光效率。 分分分分子子子子的的的的几几几几何何何何排排排排布布布布：具具具具有有有有刚刚刚刚性性性性平平平平面面面面结结结结构构构构的的的的有有有有机机机机分分分分子
87、子子子容容容容易易易易发荧光。平面构型或分子刚性增加，荧光增强。发荧光。平面构型或分子刚性增加，荧光增强。发荧光。平面构型或分子刚性增加，荧光增强。发荧光。平面构型或分子刚性增加，荧光增强。 取代基的类型和位置。取代基的类型和位置。取代基的类型和位置。取代基的类型和位置。 环境、溶剂、温度、环境、溶剂、温度、环境、溶剂、温度、环境、溶剂、温度、pHpHpHpH等均会影响分子结构，从而影等均会影响分子结构，从而影等均会影响分子结构，从而影等均会影响分子结构，从而影响荧光。响荧光。响荧光。响荧光。生物化学中主要的荧光生色团生物化学中主要的荧光生色团可分为两类生物化学中主要的荧光生色团可分为两类:
88、:天然荧光生色团天然荧光生色团天然荧光生色团天然荧光生色团荧光指示剂（荧光探针）荧光指示剂（荧光探针）荧光指示剂（荧光探针）荧光指示剂（荧光探针）主要的天然荧光生色团蛋白质中的芳香族氨基酸蛋白质中的芳香族氨基酸核黄素、维生素核黄素、维生素A A、叶绿素等天然色素和、叶绿素等天然色素和NADHNADH等少数分子等少数分子核酸中核酸中tRNAtRNA中的中的Y Y碱基（二氢尿嘧啶）碱基（二氢尿嘧啶）蛋白质和核酸中的荧光生色团在蛋白质的荧光谱中，由色氨酸残基发出的在蛋白质的荧光谱中，由色氨酸残基发出的荧光占统治地位。这一方面是由于色氨酸的荧光占统治地位。这一方面是由于色氨酸的吸收度和量子产率较高，另
89、一方面是由于在吸收度和量子产率较高，另一方面是由于在色氨酸存在的条件下，酪氨酸吸收的能量常色氨酸存在的条件下，酪氨酸吸收的能量常常不是自己通过荧光发射释放出来，而是传常不是自己通过荧光发射释放出来，而是传递给色氨酸，由色氨酸发出荧光。递给色氨酸，由色氨酸发出荧光。荧光探针总的来说，天然的荧光生物分子种类很有限，而且总的来说，天然的荧光生物分子种类很有限，而且荧光强度较弱，为了研究多数的不发光的生物分子，荧光强度较弱，为了研究多数的不发光的生物分子，人们广泛利用一类能产生稳定荧光的分子，把这些人们广泛利用一类能产生稳定荧光的分子，把这些小分子和大分子结合起来，或者插入大分子中，根小分子和大分子结
90、合起来，或者插入大分子中，根据这些较小的荧光分子性质的改变，分析大分子的据这些较小的荧光分子性质的改变，分析大分子的结构，这类小分子称为荧光探针。结构，这类小分子称为荧光探针。对对对对于于于于作作作作为为为为荧荧荧荧光光光光探探探探针针针针的的的的分分分分子子子子有有有有以以以以下下下下几几几几个个个个基基基基本本本本要求：要求：要求：要求：l能产生稳定的，较强的荧光。能产生稳定的，较强的荧光。能产生稳定的，较强的荧光。能产生稳定的，较强的荧光。 l探探探探针针针针与与与与被被被被研研研研究究究究分分分分子子子子的的的的某某某某一一一一微微微微区区区区必必必必须须须须有有有有特特特特异异异异性
91、性性性的结合，而且结合得比较牢固。的结合，而且结合得比较牢固。的结合，而且结合得比较牢固。的结合，而且结合得比较牢固。l探针的荧光必须对环境条件较敏感。探针的荧光必须对环境条件较敏感。探针的荧光必须对环境条件较敏感。探针的荧光必须对环境条件较敏感。l结结结结合合合合的的的的探探探探针针针针不不不不应应应应影影影影响响响响被被被被研研研研究究究究的的的的大大大大分分分分子子子子的的的的结结结结构构构构和特性。和特性。和特性。和特性。TypicalfluorescentprobesStructuresofsomefluorescentprobes参考文献ALAN WAGGONER, Covalen
92、t Labelingof Proteins and Nucleic Acids withFluorophores,inMETHODSINENZYMOLOGY.VOL246,p362-373天然色素的内源荧光分析 维维维维生生生生素素素素大大大大多多多多含含含含有有有有芳芳芳芳香香香香环环环环结结结结构构构构，本本本本身身身身具具具具有有有有较较较较强强强强的的的的天天天天然然然然荧荧荧荧光光光光，因因因因此此此此可可可可以以以以利利利利用用用用内内内内源源源源荧荧荧荧光光光光检检检检测测测测维维维维生生生生素素素素。例例例例如如如如，可可可可用用用用345nm345nm345nm345nm激激
93、激激发发发发，490nm490nm490nm490nm处处处处测测测测量量量量，用用用用以以以以确确确确定定定定血血血血液液液液中中中中维维维维生生生生素素素素A A A A的的的的含含含含量量量量。核核核核黄黄黄黄素素素素即即即即维维维维生生生生素素素素B B B B2 2 2 2在在在在pH7.0pH7.0pH7.0pH7.0时时时时，用用用用激激激激发发发发波波波波长长长长370nm370nm370nm370nm（或或或或440nm440nm440nm440nm），发发发发射射射射波波波波长长长长为为为为565nm565nm565nm565nm检检检检测测测测，可可可可以以以以确确确确定
94、定定定组组组组织织织织中中中中核核核核黄黄黄黄素素素素的的的的总总总总量量量量。维维维维生生生生素素素素B B B B12121212在在在在pH7pH7pH7pH7的的的的溶溶溶溶液液液液中中中中，可可可可以以以以用用用用275nm275nm275nm275nm激激激激发发发发，305nm305nm305nm305nm处处处处检检检检测测测测。维维维维生生生生素素素素C C C C用用用用490nm490nm490nm490nm激激激激发发发发，可产生绿色荧光（可产生绿色荧光（可产生绿色荧光（可产生绿色荧光（530nm530nm530nm530nm）。）。）。）。植植物物、藻藻类类或或光光合
95、合细细菌菌中中含含有有各各种种色色素素和和辅辅助助色色素素分分子子，包包括括叶叶绿绿素素a a、b b、c c1 1、c c2 2，类类胡胡萝萝卜卜素素如如 - -胡胡萝萝卜卜素素、岩岩藻藻黄黄质质、多多甲甲藻藻黄黄素素，藻藻胆胆素素如如藻藻蓝蓝素素、藻藻红红素素等等，都都含含有有荧荧光光生生色色团团，它它们们的的荧荧光光激激发发谱谱和和荧荧光光发发射射谱谱都都可可用用来来鉴鉴定定色色素素的的存存在在及及含含量量，也也可可以以用用来来分分析析光光合合作作用用过程中能量的吸收与传递。过程中能量的吸收与传递。用荧光光谱测量光合效率光光合合系系统统中中色色素素内内源源荧荧光光是是研研究究光光合合作作
96、用用的的一一个个非非常常重重要要的的信信息息来来源源，荧荧光光光光谱谱仪仪因因而而也也就就成成了了植植物物生生理理学学家家的的“听听诊诊器器”，一一些些专专用用的的荧荧光光仪仪可可以以方方便便地地携携带带到到田田间间直直接接测量作物叶片的光合效率。测量作物叶片的光合效率。光光合合系系统统中中的的天天线线色色素素如如叶叶绿绿素素吸吸收收太太阳阳光光的的光光能能后后被被激激发发到到能能量量较较高高的的激激发发态态，然然后后会会以以各各种种形形式式耗耗散散其其吸吸收收的的能能量量，弛弛豫豫回回到到基基态态。这这些些能能量量耗耗散散的的形形式式包包括括将将能能量量传传递递到到光光合合反反应应中中心心，
97、进进而而进进行行光光化化学学反反应应，也也包包括括荧荧光光发发射射。如如果果反反应应中中心心的的光光化化学学反反应应由由于于某某种种原原因因受受阻阻，则则荧荧光光产产率率会会增增高高。换换句句话话说说，荧荧光光越越强强，光光化化学学速速率率越越低低，荧荧光光越越弱弱，光光合合效效率率越越高高。因因此此，可可以以利利用用荧荧光光强强度度的的变变化估算出光合效率的高低。化估算出光合效率的高低。ApplicationsofFluorescentProbesNucleicAcidDetectionPeptideandProteinDetection,AnalysisandSynthesisEnzyme
98、sandEnzymeSubstratesProbesforActin,TubulinandNucleotide-BindingProteinsProbesforOrganellesProbesforLipidsandMembranesFluorescentTracersofCellMorphologyandFluidFlowAssaysforCellViability,ProliferationandFunctionProbesforEndocytosis,ReceptorsandIonChannelsPhotoactivatable(Caged)ProbesProbesforSignalTr
99、ansductionProbesforReactiveOxygenSpecies,IncludingNitricOxideIndicatorsforCa(2+),Mg(2+),Zn(2+)andOtherMetalspHIndicatorsIndicatorsforNa(+),K(+),Cl(-)andOtherAnionsProbesforMembranePotentialFLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTElNS FluorescencehasprovedtobeaparticularlyFluorescencehasprovedtobeaparticularlyvalua
100、bletechniqueforstudyingproteins.valuabletechniqueforstudyingproteins. Usethefluorescenceofproteinstoillustrate:Usethefluorescenceofproteinstoillustrate:1.1.analyticaldetectionanalyticaldetection2.2.changesinquantumyieldchangesinquantumyield3.3.theeffectsofenergytransfertheeffectsofenergytransfer4.4.
101、changesinfluorescencepolarizationwithtimethatcanbechangesinfluorescencepolarizationwithtimethatcanbeusedtomonitorshapeusedtomonitorshape5.5.studythestoichiometryofcomplexformationstudythestoichiometryofcomplexformation6.6.observethepresenceofintermediatesobservethepresenceofintermediates7.7.determin
102、eequilibriumconstantsdetermineequilibriumconstants8.8.ascertainthemicroenvironmentofbindingsites.ascertainthemicroenvironmentofbindingsites.FLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTElNS1.AnalyticaldetectionANALYTlCALAPPLlCATIONS FluorescenceFluorescenceintensityintensityFFisisusefulusefultotobiochemistsbiochemistsi
103、ninobservingobservingthethepresencepresenceofofaamacromolecule.macromolecule.Forinstance,biopolymersemergingfromahighpressureliquidchromatograph(HPLC)might be monitored with a fluorescencedetector.WeseeinFigure11.6atheresultsfortheisolationoftheproteinmelittinfromhoneybeevenomonanHPLC.Melittinhasatr
104、yptophanresiduethatcanbeexcitedat280 nm to fluoresce over a range ofwavelengths that include 340 nm. Twoproteins are eluted from the HPLC thathave340nmfluorescence,oneat5.9minandoneat11.7min.Thefractionat11.7min has melittin activity (hemolysis of redblood cells). Monitoring the elution withnormalUV
105、absorbanceat214nm(Figure11.6b)revealsanumberofotherfractionsthatcontainbiologicalmolecules,butthesedonothavetobeconsideredbecausetheydonotfluoresce.Byusingfluorescenceforanalysis,identificationoftheproperfractionissimplified.Figure11.6Thefluorescence(a)andelectronicabsorption(b)fora melittin prepara
106、tion emergingfrom a high pressure liquidchromatograph.Themelittinelutesat11.7min.FLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTElNS2.ChangesinquantumyieldQuantumyieldisausefulquantity QuantumyieldisausefulquantityQuantumyieldisausefulquantity ChangesinthequantumyieldareoftenChangesinthequantumyieldareoftendiagnosticofch
107、angesinthemoleculardiagnosticofchangesinthemolecularenvironmentofachromophoreenvironmentofachromophore Forexample,thequantumyieldofafluorophoreForexample,thequantumyieldofafluorophorewilloftenincreasewhenthemoleculeistakenupwilloftenincreasewhenthemoleculeistakenupfromsolutionandboundtoamacromolecul
108、esuchfromsolutionandboundtoamacromoleculesuchasDNAoraprotein.asDNAoraprotein. MeasurementofthequantumyieldprovidesaMeasurementofthequantumyieldprovidesasimplewaytomeasurebinding.simplewaytomeasurebinding.利用蛋白质的天然荧光检测蛋白质的结构变化 氨氨氨氨基基基基酰酰酰酰化化化化酶酶酶酶在在在在十十十十二二二二烷烷烷烷基基基基硫硫硫硫酸酸酸酸锂锂锂锂作作作作用用用用下下下下内内内内源源源源荧荧荧
109、荧光光光光发发发发射射射射谱谱谱谱随随随随作作作作用用用用时时时时间间间间的的的的变变变变化化化化, , , ,随随随随作作作作用用用用时时时时间间间间的的的的增增增增加加加加，荧荧荧荧光光光光强强强强度度度度逐逐逐逐渐渐渐渐减减减减小小小小。表表表表明明明明随随随随作作作作用用用用时时时时间间间间的的的的增增增增加加加加，该该该该蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质逐逐逐逐渐渐渐渐变变变变性性性性，发发发发生生生生去去去去折折折折叠叠叠叠，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质内内内内部部部部的的的的荧荧荧荧光光光光生生生生色色色色团团团团逐逐逐逐渐渐渐渐暴暴暴暴露露露露在在在在极极极极性性性性水水水水环环环环境中。
110、境中。境中。境中。Changes in the fluorescence emission spectra ofaminoacylase during denaturation in 0.6 mM LDS.Repeated scan of the fluorescence emission spectrawithanexcitationwavelengthof295nmaftermixingtheenzymewithLDSsolution.Thefinalconcentrationof the enzyme was 0.37 M. Reaction times of theenzyme den
111、aturaion for curves from top to bottomwere0,1,3,5,8,10,15,20,25,30,40and50min,respectively.FLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTElNS3.Theeffectsofenergytransfer共振能量转移参考文献参考文献1.PAULR.SELVIN,FluorescenceResonance1.PAULR.SELVIN,FluorescenceResonanceEnergyTransfer,in“METHODSINENZYMOLOGY.”EnergyTransfer,in“METHODSIN
112、ENZYMOLOGY.”VOL246,p300-334VOL246,p300-3342,3,42,3,4见所提供的阅读文献见所提供的阅读文献Energy transfer UnderUnderfavorablefavorablecircumstancescircumstancesexcitationexcitationenergyenergycancanbebetransferredtransferredfromfromoneonefluorophoretoanother:fluorophoretoanother:Transitiondipoleinteractionbetweenthetwo
113、fluorophoresTransitiondipoleinteractionbetweenthetwofluorophoresAnappreciableoverlapofthefluorescencespectrumofthedonorAnappreciableoverlapofthefluorescencespectrumofthedonorwiththeabsorptionspectrumoftheacceptorwiththeabsorptionspectrumoftheacceptorTherequirementofdipole-dipoleinteractionbetweenthe
114、Therequirementofdipole-dipoleinteractionbetweenthefluorophoresleadstoastrongdependenceofenergytransferonfluorophoresleadstoastrongdependenceofenergytransferonthedistancebetweentheparticipatinggroupsthedistancebetweentheparticipatinggroups 如果两种不同的荧光生色团离得较近，且其中一种生色团的荧光发射如果两种不同的荧光生色团离得较近，且其中一种生色团的荧光发射谱
115、与另一种生色团的激发谱有相当程度的重叠。则当第一种荧光团被谱与另一种生色团的激发谱有相当程度的重叠。则当第一种荧光团被激发时，另一种荧光团却因第一种生色团激发能的转移而被激发，这激发时，另一种荧光团却因第一种生色团激发能的转移而被激发，这种现象称为共振能量转移。种现象称为共振能量转移。共振能量转移共振能量转移Dependenceofefficiencyofenergytransferonthesixthpoweroftheseparationr FigureFigure 11.1411.14 TheThe efficiencyefficiency ofof energyenergy trans
116、fertransfer changeschanges rapidlyrapidlywiththedistancebetweendonorandacceptor.withthedistancebetweendonorandacceptor.Efficiency of energy transferTheefficiencyoftransferisgivenbyefficiency=HereR0isthedistancefor0.5efficiencyof transfer, and is characteristic of thedonor-acceptor pair and the mediu
117、mbetweenthem. R R0 0称称为为临临界界距距离离，定定义义为为能能量量转转移移效效率率为为50%50%时时两两个个生生色色团之间的距离，对于每个供体一受体时，团之间的距离，对于每个供体一受体时，R R0 0是常数。是常数。 R R0 0可可以以根根据据受受体体的的吸吸收收谱谱和和供供体体的的发发射射谱谱、介介质质的的折折射射系系数数、供供体体和和受受体体跃跃迁迁电电偶偶极极矩矩的的朝朝向向因因子子、供供体体在在没没有受体存在时的量子产率等参数估算出来。有受体存在时的量子产率等参数估算出来。 根根据据转转移移效效率率和和R R0 0，即即可可求求出出两两个个生生色色团团之之间间的
118、的距距离离。这种测定生色团距离的方法，常被人称为光谱尺。这种测定生色团距离的方法，常被人称为光谱尺。R0FORSOMEDONOR-ACCEPTORS(nm) R R0 0isordinarilyfoundisordinarilyfoundtobeoftheorderoftobeoftheorderof2nm2nm FluorescenceFluorescencetransferservesasatransferservesasausefulyardstickforusefulyardstickforthedistancesthedistancesbetweengroupsinbetweengr
119、oupsinmacromoleculesmacromoleculessuchasproteinssuchasproteins EnergyEnergytransfertransferisisaacommoncommonphenomenonphenomenonininproteinsproteinsItcanbeusedforinvestigatingtheirstructureItcanbeusedforinvestigatingtheirstructureTyrosineTyrosine andand tryptophantryptophan groupsgroups inin protei
120、nsproteinsoftensatisfybothrequirementsfortransferoftensatisfybothrequirementsfortransferSpecificSpecific aminoamino acidsacids cancan bebe labeledlabeled withwith aafluorophorefluorophoresuchsuchasasdimethyldimethylaminonapthalene-5-sulfonate(DNS)aminonapthalene-5-sulfonate(DNS)EnergyEnergytransfert
121、ransferusedusedtotomeasuremeasurethethedistancedistancebetweenbetween thethe dyedye andand otherother aromaticaromatic groupsgroupsintheproteinintheproteinAMP(c-AMP)fluorosensor c-AMP-dependentc-AMP-dependentproteinproteinkinasekinaseconsistsconsists ofof twotworegulatoryregulatoryandandtwotwocataly
122、ticcatalyticsubunits.subunits.c-AMPc-AMPcausescausesthethedissociationdissociationofofthesethesefourfoursubunitssubunitsandandthetheactivationactivationofoftheenzyme.theenzyme. TheThedyedyefluorosceinfluorosceinwaswasattachedattachedtotothethecatalyticcatalyticsubunitsubunitandand thethe dyedye rhod
123、aminerhodamine attachedattached toto thethe regulatoryregulatorysubunit.subunit.TheTheinactiveinactivetetramertetramerexhibitsexhibitsenergyenergytransfertransferofofthetheexcitedexcitedfluorosceinfluorosceintotothethenearbynearbyrhodamine.rhodamine.AdditionAdditionofc-AMPdissociatesthetetramer.ofc-
124、AMPdissociatesthetetramer. TheThedissociationdissociationeliminateseliminatesenergyenergytransfer,transfer,whichwhichininturnturnincreasesincreasesthethefluorescencefluorescenceofoffluorosceinfluorosceinatat520520nmnmandanddecreasesthefluorescenceofrhodamineat580nm.decreasesthefluorescenceofrhodamin
125、eat580nm. TheThe fluorescencefluorescence atat 520520 nmnm relativerelative toto 580580 nmnm isis aasensitivemeasureofc-AMPconcentration.sensitivemeasureofc-AMPconcentration.FigureFigure11.1511.15DissociationDissociationofofthethefourfoursubunitssubunitsininc-AMP-c-AMP-dependentdependentproteinprote
126、inkinasekinaseincreasesincreasesthethefluorescencefluorescenceofoffluorosceinfluorosceinatat520520nmnmatatthetheexpenseexpenseofofthethefluorescencefluorescenceofrhodamineat580nminthec-AMPfluorosensor.ofrhodamineat580nminthec-AMPfluorosensor. Noaddedc-AMP(),0.07McAMP(.),0.19McAMP(),and53McAMP().Visu
127、alizingc-AMPwithfluorescenceFluorescentprobeshavewideapplication.As a particularly beautiful example, De-BernardiandBrooker(1996)usedthec-AMPfluorosensordiscussedtodetectc-AMPinlivecells. FigureFigureA11.1A11.1showsshowsthethenondestructivenondestructivevideovideoimagingimagingofofcellscellsbothboth
128、beforebeforeandandafterafterforskolinforskolin treatment,treatment, whichwhich inducesinduces c-AMPc-AMP productionproduction inin thethe nucleus.nucleus. BeforeBeforeforskolinforskolintreatmenttreatmentweweseeseethatthatthethecellcellbarelybarelyfluorescesfluorescesatat520520nmnmwithwith488488nmnme
129、xcitation.Aftertreatmentweseemarkedfluorescencefromthenucleus.excitation.Aftertreatmentweseemarkedfluorescencefromthenucleus. FLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTElNS4.Changesinfluorescencepolarizationwithtimethatcanbeusedtomonitorshape5. Fluorescence Anisotropy Applied toBiomolecularInteractionsChangesinfluor
130、escencepolarizationwithtimecanbeusedtomonitorshapeIfIfthethemoleculesmoleculesrotaterotateduringduringthethefluorescencefluorescencelifetime,lifetime,weweexpectexpectevenevenmoremoredepolarization,depolarization,andand thethe magnitudemagnitude ofof thethe anisotropyanisotropy willwill bebefurtherde
131、creased.furtherdecreased.MostMost biopolymersbiopolymers cancan undergoundergo aa perceptibleperceptiblereorientationreorientation duringduring thethe typicaltypical excited-stateexcited-statelifetimelifetime ofof 1010 9 9 toto 1010 8 8 sec,sec, soso polarizedpolarizedfluorescencefluorescence cancan
132、 bebe usedused toto measuremeasure thisthisdynamicproperty.dynamicproperty. RotationRotationdependsdependsononmolecularmolecularvolumevolumeandandshape.shape. MostMost proteinsproteins havehave aa similarsimilar densitydensityandandshape,shape,sosoininthisthiscasecaserotationrotationisissensitivesen
133、sitivetomolecularweight.tomolecularweight.PolarizedPolarizedfluorescencefluorescenceisisthetheonlyonlyspectroscopicspectroscopictechniquetechniquethatthatisisresponsiveresponsivetotomolecularmolecular weightweight changes,changes, andand thusthus isisconvenientconvenient forfor studyingstudying reac
134、tionsreactions suchsuch asasmonomer-dimerequilibria.monomer-dimerequilibria.Pulsefluorometryisadirectwaytoexaminemolecularrotation TheThefluorescentfluorescentsamplesampleisisexcitedexcited withwith aa veryvery shortshort pulsepulseofoflightlight(about(aboutl0l0 9 9 sec)sec)andandthenthenthetheaniso
135、tropyanisotropyisismeasuredmeasuredasasaafunctionoftime.functionoftime. MoleculesMolecules thatthat emitemit laterlater willwillhavehave hadhad timetime toto undergoundergorotationalrotationalmotion,motion,andandtheirtheiranisotropyanisotropywillwilldecreasedecreasethroughdepolarization.throughdepol
136、arization.Figure11.18Decayoftheanisotropy after the sample hasbeenexcitedwithaveryshortpulse.Rotation of the molecule causes alossinsignal.Figure11.22Fluorescenceanisotropyforthe stoichiometric titration of Polistesmastoparanwithcalmodulin. TheThe changechange inin anisotropyanisotropyoccursoccurs w
137、henwhen thethe peptidepeptide isistitratedwithcalmodulin.titratedwithcalmodulin. TheThe increaseincrease inin anisotropyanisotropysaturatessaturates atat thethe one-to-oneone-to-onecomplex,complex,demonstratingdemonstratingthatthattherethereisisaasinglesinglebindingbindingsitesite onon calmodulincal
138、modulin withwith aahighaffinityforthepeptidehighaffinityforthepeptideFigure11.27Thesteady-statepolarization of proflavin intercalated indouble stranded DNA as a function oftemperature. InInthisthisearlyearlyexperimentexperimentproflavinproflavinwaswasintercalatedintercalated betweenbetween thethe ba
139、sesbases ofof aadouble-strandeddouble-stranded andand helicalhelical DNA.DNA.PolarizationPolarization ratherrather thanthan anisotropyanisotropywaswasusedusedtotodescribedescribethethemeasurementmeasurement here,here, andand thethe resultsresultsareare graphedgraphed asas aa PerrinPerrin plotplot ve
140、rsusversusT/T/ . . TheThe polarizationpolarization decreasesdecreases slightlyslightlywithwith temperature,temperature, untiluntil thethe DNADNAdenaturesdenatures(60(60 C),C),andandthethepolarizationpolarization decreasesdecreases dramaticallydramaticallyastheproflavinisreleased.astheproflavinisrele
141、ased.FLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTElNS6.ObservethepresenceofintermediatesFLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTElNS7.DetermineequilibriumconstantsFLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTElNS8.Ascertainthemicroenvironmentofbindingsites例例1.ThefluorescencespectrumofPolistesmastoparan1.ThefluorescencespectrumofPolistesmastoparanfree(.
142、)andboundtocalmodulin(free(.)andboundtocalmodulin() ) TheTheshiftshifttotoshortershorterwavelengthwavelengthforforthethefluorescencefluorescenceofofPolistesPolistes mastoparanmastoparanononbindingbindingtotocalmodulincalmodulin isis shownshown inin FigureFigure11.21.11.21. ThisThis isis aa solventso
143、lvent effect,effect, whichwhichshowsshowsthatthatthetheenvironmentenvironmentofofthethetryptophantryptophanononbindingbindingisishydrophobichydrophobicandandshieldedshieldedfromfromthetheaqueoussolvent.aqueoussolvent. ThereThere isis alsoalso somesome quenchingquenching ofofthethefluorescencefluores
144、cenceononbinding,binding,whichwhichoftenaccompaniessolventeffects.oftenaccompaniessolventeffects.例2 盐诱导的碱变性肌酸激酶再折叠盐诱导的碱变性肌酸激酶再折叠 ANSANSANSANS荧荧荧荧光光光光谱谱谱谱会会会会随随随随着着着着所所所所处处处处环环环环境境境境疏疏疏疏水水水水性性性性的的的的增增增增加加加加而而而而发发发发生生生生兰兰兰兰移移移移，且且且且量量量量子子子子产产产产率率率率也也也也随随随随之之之之提提提提高高高高。利利利利用用用用ANSANSANSANS的的的的这这这这个个个个性
145、性性性质质质质，可可可可以以以以衡衡衡衡量量量量ANSANSANSANS结结结结合合合合的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质部部部部位位位位的的的的极极极极性性性性的的的的变变变变化化化化。根根根根据据据据极极极极性性性性的的的的变变变变化化化化，又又又又可可可可以以以以进进进进一一一一步步步步推推推推测测测测蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质结结结结构构构构的的的的变化。变化。变化。变化。 碱碱碱碱变变变变性性性性肌肌肌肌酸酸酸酸激激激激酶酶酶酶溶溶溶溶液液液液中中中中ANSANSANSANS荧荧荧荧光光光光随随随随着着着着KClKClKClKCl浓浓浓浓度度度度增增增增大大大大，ANSANSANSANS
146、荧荧荧荧光光光光强强强强度度度度随随随随着着着着它它它它与与与与蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质疏疏疏疏水水水水区区区区的的的的结结结结合合合合而而而而增增增增大大大大，且且且且峰峰峰峰位位位位兰兰兰兰移移移移。在在在在ANSANSANSANS与与与与碱碱碱碱变变变变性性性性肌肌肌肌酸酸酸酸激激激激酶酶酶酶结结结结合合合合之之之之后后后后，ANSANSANSANS荧荧荧荧光光光光强强强强度度度度的的的的增增增增加加加加和和和和兰兰兰兰移移移移并并并并不不不不大大大大，但但但但随随随随着着着着溶溶溶溶液液液液中中中中加加加加入入入入的的的的KClKClKClKCl浓浓浓浓度度度度的的的的增增增增加加加加
147、，ANSANSANSANS的的的的强强强强度度度度和和和和峰峰峰峰位位位位的的的的变变变变化化化化明明明明显显显显加加加加大大大大。说说说说明明明明KClKClKClKCl的的的的加加加加入入入入使使使使碱碱碱碱变变变变性性性性肌肌肌肌酸酸酸酸激激激激酶酶酶酶表表表表面面面面形形形形成成成成了了了了更更更更多多多多的的的的疏疏疏疏水水水水区区区区域域域域。盐盐盐盐可可可可以以以以诱诱诱诱导导导导碱碱碱碱变变变变性性性性肌肌肌肌酸酸酸酸激激激激酶酶酶酶再再再再折折折折叠叠叠叠，作作作作者者者者认认认认为为为为：盐盐盐盐诱诱诱诱导导导导的的的的再再再再折折折折叠叠叠叠是是是是起起起起始始始始于于于
148、于变变变变性性性性蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质中中中中残残残残余余余余的的的的二二二二级级级级结结结结构构构构框框框框架架架架，然然然然后后后后形形形形成成成成一个表面以疏水结构为主的熔球体折叠中间态。一个表面以疏水结构为主的熔球体折叠中间态。一个表面以疏水结构为主的熔球体折叠中间态。一个表面以疏水结构为主的熔球体折叠中间态。FLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTElNS9.Followenzymeactivityandkinetics9.FollowenzymeactivityandkineticsInvestigationofthePolymerizationofG-Actin M
149、arriottMarriottetetal.al.(1988)(1988)usedusedfluorescencefluorescencespectroscopyspectroscopyininitsitsvariousvariousaspectsaspectsininananelegantelegantinvestigationinvestigationofofthethemusclemuscleprotein,protein,actin.actin.MonomericMonomeric G-actinG-actin waswas labeledlabeled withwith Prodan
150、,Prodan, aafluorophorefluorophorethatthatisisparticularlyparticularlysensitivesensitivetotosolventsolventeffectseffects andand convenientlyconveniently fluorescesfluoresces farfar intointo thethevisibleregionwithalargequantumyield.visibleregionwithalargequantumyield.FigureA11.2aThelabelProdanshiftsi
151、tsfluorescencefrom492nmto466nmasG-actin () is polymerized into F-actin(). PolymerizationPolymerizationofofG-actinG-actinintointo F-actinF-actin blueblue shiftsshifts thethefluorescencefluorescencefromfrom492492nmnmtoto466nm.466nm. ThisThis demonstratesdemonstrates thatthat thetheProdanProdanhashasli
152、mitedlimitedexposureexposuretotothethesolventsolventininthethepolymericpolymeric F-actin,F-actin, andand givesgivesaasimplesimplemethodmethodforforspectralspectraldiscriminationdiscrimination betweenbetween thethetwoforms.twoforms.FigureFigureA11.2bA11.2bTheTheshiftshiftininthetheaverageaverageenerg
153、yenergyofoffluorescencefluorescencegivesgivesthethetimetimedependencedependenceofofthethepolymerizationofG-actinintoF-actin.polymerizationofG-actinintoF-actin. TimeTime dependencedependenceofof thethepolymerizationpolymerization waswas followedfollowedthroughthrough thethe shiftshift inin averageave
154、rageenergyofthefluorescence.energyofthefluorescence. ThisThis fluorescencefluorescence datadata cancanbebe usedused toto determinedetermine thetheequilibriumequilibriumconstantconstantandandinvestigateinvestigate thethe kineticskinetics ofofpolymerization.polymerization. ( (参参见见林林克克椿椿“ “生生物物物物理理技技术术
155、波波谱谱技技术术及及其其在在生生物物学学中中的的应应用用” ”，高高等等教教育育出出版版社，社，19891989，p74p747878) )FLUORESCENCEAPPLIEDTONUCLElCAClDSThe DNA bases have only a very lowfluorescence. However, fluorescencemethods can be applied to studies ofnucleicacidsbysubstitutingafluorescentanalogforanormalbaseorbybindingafluorophore.NucleicAci
156、dStains PropertiesofCyanineDyesPropertiesofCyanineDyes PremiereCyanineDyesforUltrasensitiveNucleicAcidPremiereCyanineDyesforUltrasensitiveNucleicAcidDetectionandQuantitationDetectionandQuantitation Cell-ImpermeantCyanineDimers:TheTOTOFamilyofCell-ImpermeantCyanineDimers:TheTOTOFamilyofDyesDyes Cell-
157、ImpermeantCyanineMonomers:theTO-PROCell-ImpermeantCyanineMonomers:theTO-PROFamilyofDyesFamilyofDyes Cell-ImpermeantSYTOXDyesforDead-CellStainingCell-ImpermeantSYTOXDyesforDead-CellStaining Cell-PermeantCyanineDyes:TheSYTONucleicAcidCell-PermeantCyanineDyes:TheSYTONucleicAcidStainsStains Phenanthridi
158、nesandAcridines:ClassicIntercalatingPhenanthridinesandAcridines:ClassicIntercalatingDyesDyes IndolesandImidazoles:ClassicMinorGrooveBindingIndolesandImidazoles:ClassicMinorGrooveBindingDyesDyes OtherNucleicAcidStainsOtherNucleicAcidStains OverOverthetheyears,years,manymanynucleicnucleicacidbindingac
159、idbindingcyaninecyaninedyedye derivativesderivatives havehave beenbeen invented.invented. TheyThey shareshareseveraluniqueproperties:severaluniqueproperties: HighHighmolarmolarabsorptivity,absorptivity,withwithextinctionextinctioncoefficientscoefficientstypically50,000cmtypically50,000cm-1-1MM-1-1at
160、visiblewavelengthsatvisiblewavelengths VeryVery lowlow intrinsicintrinsic fluorescence,fluorescence, withwith quantumquantumyieldsyields usuallyusually 0.010.01 whenwhen notnot boundbound toto nucleicnucleicacidsacids LargeLarge fluorescencefluorescence enhancementsenhancements (often(often overover
161、1000-fold)1000-fold) uponupon bindingbinding toto nucleicnucleic acids,acids, withwithincreasesinquantumyieldstoashighas0.9increasesinquantumyieldstoashighas0.9 ModerateModerate toto veryvery highhigh affinityaffinity forfor nucleicnucleic acids,acids,withlittleornostainingofotherbiopolymerswithlitt
162、leornostainingofotherbiopolymers NormalizedfluorescenceemissionspectraofDNA-NormalizedfluorescenceemissionspectraofDNA-boundcyaninedimers,identifiedbythecolorkeyonboundcyaninedimers,identifiedbythecolorkeyonthesidebar.thesidebar. NucleicAcidDetectioninGels,inCapillaryElectrophoresisandonBlotsNucleic
163、AcidDetectioninGelsNucleicAcidDetectioninGelsNucleicAcidSequencingNucleicAcidSequencingCapillaryElectrophoresisandChannelCapillaryElectrophoresisandChannelElectrophoresisElectrophoresisNucleicAcidDetectiononBlotsandonChipsNucleicAcidDetectiononBlotsandonChips AnalysisofDNAStructure,DNABindingandDNAD
164、amageSingleNucleicAcidMoleculeDetectionNucleicAcidConformationalAnalysisDNABindingAssaysAssessingDNADamageAssaysforEnzymesthatModifyNucleicAcidsNuclearandChromosomeCounterstainingNuclearCounterstainingofFixedCellsandNuclearCounterstainingofFixedCellsandTissuesTissuesNuclearCounterstainsforLiveCellsa
165、ndNuclearCounterstainsforLiveCellsandUnfixedTissuesUnfixedTissuesTrackingChromosomesthroughMitosisTrackingChromosomesthroughMitosisChromosomeCounterstainingChromosomeCounterstainingChromosomeBandingChromosomeBanding生物膜的荧光研究structuralandbiophysicalanalysisofmembranesstructuralandbiophysicalanalysisof
166、membranesfollowingfollowing lipidlipid transporttransport andand metabolismmetabolism inin livinglivingcellscellsinvestigatinginvestigating lipid-mediatedlipid-mediated signalsignal transductiontransductionprocessesprocesseslong-termcelltracinglong-termcelltracingmembranemarkersofendocytosisandexocy
167、tosismembranemarkersofendocytosisandexocytosisPhospholipids PhospholipidsPhospholipids areare thethe principalprincipal buildingbuilding blocksblocks ofof cellcellmembranes.membranes. MostMost phospholipidsphospholipids areare estersesters ofof glycerolglycerolcomprisingcomprisingtwotwofattyfattyacy
168、lacylresiduesresidues(nonpolar(nonpolartails)tails)andandaasinglesingle phosphatephosphate esterester substituentsubstituent (polar(polar headhead group).group).DespiteDespitetheirtheiroveralloverallstructuralstructuralsimilarity,similarity,naturalnaturalphospholipidsphospholipidsexhibitexhibitsubtl
169、esubtledifferencesdifferencesinintheirtheirfattyfattyacidacidcompositions,compositions, degreedegree ofof acylacyl chainchain unsaturationunsaturation andand ininthethe typetype ofof polarpolar headhead group.group. TheseThese differencesdifferences cancanproduceproduce significantsignificant variat
170、ionsvariations inin membranemembrane physicalphysicalproperties,properties,thethelocationlocationofofphospholipidsphospholipidsininaalipidlipidbilayerbilayerandintheirbiologicalactivity.andintheirbiologicalactivity. FluorescentFluorescentphospholipidphospholipidanalogsanalogscancanbebeclassifiedclas
171、sifiedaccordingaccordingtotowherewherethethefluorophorefluorophoreisisattached.attached. TheThe fluorophorefluorophore cancan bebe attachedattached totooneone (or(or both)both) ofof thethe fattyfatty acylacyl chainschains oror toto thethepolarpolarheadheadgroup.group.TheTheattachmentattachmentpositi
172、onpositionofofthethefluorophorefluorophore determinesdetermines whetherwhether itit isis locatedlocated ininthethe nonpolarnonpolar interiorinterior oror atat thethe water/lipidwater/lipidinterfaceinterface whenwhen thethe phospholipidphospholipid analoganalog isisincorporatedintoalipidbilayermembra
173、ne.incorporatedintoalipidbilayermembrane. (A)DPH,(B)NBD-C6-HPC,(C)bis-pyrene-PC,(D)DiI,(E)cis-parinaricacid,(F)C5-BODIPY,(G)N-Rh-PE,(H)DiA,(I)C12-fluorescein.LocationandorientationofrepresentativefluorescentmembraneprobesinaphospholipidbilayerPotentiometricProbes PotentiometricPotentiometric optical
174、optical probesprobes enableenable researchersresearchers totoperformperformmembranemembranepotentialpotentialmeasurementsmeasurementsininorganellesorganellesandandinincellscellsthatthatarearetootoosmallsmalltotoallowallowthetheuseuse ofof microelectrodes.microelectrodes. Moreover,Moreover, inin conj
175、unctionconjunction withwithimagingimagingtechniques,techniques,thesetheseprobesprobescancanbebeemployedemployedtotomapmapvariationsvariationsininmembranemembranepotentialpotentialacrossacrossexcitableexcitablecellscellsandandperfusedperfusedorgans,organs, withwithspatialspatialresolutionresolutionan
176、dandsamplingsampling frequencyfrequency thatthat areare difficultdifficult toto achieveachieve usingusingmicroelectrodes.microelectrodes.The plasma membrane of a cell typically has atransmembranepotentialofapproximately70mV(negative inside) as a consequence of K+, Na+andClconcentrationgradientsthata
177、remaintainedbyactivetransportprocesses.Potentiometricprobesofferanindirectmethodofdetectingthetranslocationoftheseions,whereasthe fluorescent ion indicators can be used todirectlymeasurechangesinspecificionconcentrations.Increases and decreases in membrane potential referred to as membrane hyperpola
178、rization anddepolarization,respectivelyplayacentralroleinmany physiological processes, including nerve-impulsepropagation,musclecontraction,cellsignalingandion-channelgating.Potentiometricprobesareimportanttoolsforstudyingtheseprocesses,aswellasforvisualizingmitochondria(whichexhibittransmembranepot
179、entialsofapproximately150mV,negativeinsidematrix),andforcellviabilityassessment.PotentiometricPotentiometric probesprobes includeinclude thethe cationiccationic ororzwitterioniczwitterionicstyrylstyryldyes,dyes,thethecationiccationiccarbocyaninescarbocyaninesandand rhodamines,rhodamines, thethe anio
180、nicanionic oxonolsoxonols andand hybridhybridoxonolsoxonols andand merocyaninemerocyanine 540.540. TheThe classclass ofof dyedyedeterminesdeterminesfactorsfactorssuchsuchasasaccumulationaccumulationinincells,cells,responsemechanismandtoxicity.responsemechanismandtoxicity.CalibrationCalibration ofof
181、potentiometricpotentiometric probesprobes cancan bebeaccomplishedaccomplished byby imposingimposing aa transmembranetransmembranepotentialpotential usingusing valinomycinvalinomycin inin conjunctionconjunction withwithexternallyappliedKexternallyappliedK+ +solutions.solutions.SelectingaPotentiometri
182、cProbeSelecting the best potentiometric probe for aparticular application can be complicated by thesubstantialvariationsintheiropticalresponsesphototoxicityinteractionswithothermoleculesProbescanbedividedintotwocategoriesbasedontheirresponsemechanism:Fast-responseprobes Fast-responseFast-responsepro
183、besprobes(usually(usuallystyrylpyridiniumstyrylpyridinium（苯苯乙乙烯烯吡吡啶啶） dyes;dyes;operateoperatebybymeansmeansofofaachangechangeinintheirtheirelectronicelectronicstructure,structure,andandconsequentlyconsequentlytheirtheirfluorescencefluorescenceproperties,properties,ininresponseresponsetotoaachangech
184、angeininthethesurroundingsurroundingelectricelectricfield.field.TheirTheiropticalopticalresponseresponseisissufficientlysufficientlyfastfasttoto detectdetect transienttransient (millisecond)(millisecond) potentialpotential changeschanges ininexcitableexcitable cells,cells,includingincluding singlesi
185、ngle neurons,neurons,cardiaccardiaccellscellsandand intactintact brains.brains. However,However, thethe magnitudemagnitude ofof theirtheirpotential-dependentpotential-dependent fluorescencefluorescence changechange isis oftenoftensmall;small; fast-responsefast-response probesprobes typicallytypicall
186、y showshow aa 210%210%fluorescencechangeper100mV.fluorescencechangeper100mV.Slow-responseprobes Slow-responseSlow-response probesprobes exhibitexhibit potential-dependentpotential-dependentchangeschanges inin theirtheir transmembranetransmembrane distributiondistribution thatthat areareaccompaniedac
187、companiedbybyaafluorescencefluorescencechange.change.TheThemagnitudemagnitudeofoftheirtheiropticalopticalresponsesresponsesisisusuallyusuallymuchmuchlargerlarger thanthan thatthat ofof fast-responsefast-response probes.probes. Slow-Slow-responseresponseprobes,probes,whichwhichincludeincludecationicc
188、ationiccarbocyaninescarbocyanines（ 羰羰 花花 青青 ） andand rhodaminesrhodamines andand anionicanionicoxonols,oxonols,arearesuitablesuitableforfordetectingdetectingchangeschangesininaverageaveragemembranemembranepotentialspotentialsofofnonexcitablenonexcitablecellscellscausedcausedbybyrespiratoryrespirator
189、y activity,activity, ionion channelchannel permeability,permeability, drugdrugbindingandotherfactors.bindingandotherfactors.Potential-dependentstainingofmitochondriainCCL64fibroblastsbyJC-1.Themitochondriawerevisualizedbyepifluorescencemicroscopyusinga520nmlongpassopticalfilter.Regionsofhighmitochon
190、drialpolarizationareindicatedbyredfluorescenceduetoJ-aggregateformationbytheconcentrateddye.DepolarizedregionsareindicatedbythegreenfluorescenceoftheJC-1monomers.IndicatorsforCa2+,Mg2+,Zn2+andOtherMetalsCaCa2+2+MeasurementswithFluorescentIndicators:MeasurementswithFluorescentIndicators: FluorescentF
191、luorescent probesprobes thatthat showshow aa spectralspectral responseresponseuponupon bindingbinding CaCa2+2+ havehave enabledenabled researchersresearchers totoinvestigateinvestigatechangeschangesininintracellularintracellularfreefreeCaCa2+2+ concentrationsconcentrations usingusing fluorescenceflu
192、orescence microscopy,microscopy, flowflowcytometrycytometry andand fluorescencefluorescence spectroscopy.spectroscopy.TheseThesefluorescentfluorescentindicators,indicators,mostmostofofwhichwhicharearederivativesderivativesofofthethe CaCa2+2+ chelatorschelators EGTA,EGTA, APTRAAPTRA andand BAPTA,BAPT
193、A, havehaveevolvedevolvedlargelylargelythroughthroughthetheeffortseffortsofofRogerRogerTsienTsienandandhiscolleagues.hiscolleagues. FluorescentCa(2+)IndicatorsExcitedwithVisibleLightFluo-3,Rhod-2andRelatedDerivativesFluo-3,Rhod-2andRelatedDerivativesLow-AffinityCalciumIndicators:Fluo-5N,Low-Affinity
194、CalciumIndicators:Fluo-5N,Rhod-5N,X-Rhod-5NandRelatedDerivativesRhod-5N,X-Rhod-5NandRelatedDerivativesCalciumGreen,CalciumOrangeandCalciumCalciumGreen,CalciumOrangeandCalciumCrimsonIndicatorsCrimsonIndicatorsOregonGreen488BAPTAIndicatorsOregonGreen488BAPTAIndicatorsFuraRedIndicatorFuraRedIndicatorCa
195、lceinCalceinFluorescentMg(2+)IndicatorsMagnesiumIndicatorsExcitedbyUVLightMagnesiumIndicatorsExcitedbyUVLightMagnesiumIndicatorsExcitedbyVisibleLightMagnesiumIndicatorsExcitedbyVisibleLightFluorescentIndicatorsforZn(2+)andOtherMetalsApplicationsofCaApplicationsofCa2+2+andMgandMg2+2+IndicatorsforIndi
196、catorsforDetectionofZnDetectionofZn2+2+andOtherMetalsandOtherMetalsIndicatorsforZincIndicatorsforZincIndicatorsforCopperIndicatorsforCopperIndicatorsforIronIndicatorsforIronIndicatorsforMercury,LeadandCadmiumIndicatorsforMercury,LeadandCadmiumIndicatorsforNickelandCobaltIndicatorsforNickelandCobaltI
197、ndicatorsforAluminumandGalliumIndicatorsforAluminumandGalliumIndicatorsforLanthanidesIndicatorsforLanthanides Photoactivatable(Caged)Probes FlashFlashphotolysisphotolysisofofphotoactivatablephotoactivatableororcagedcagedprobesprobesprovidesprovidesaa meansmeans ofof controllingcontrolling thethe rel
198、easerelease bothboth spatiallyspatially andandtemporallytemporallyofofbiologicallybiologicallyactiveactiveproductsproductsororotherotherreagentsreagentsofofinterest.interest. TheThe chemicalchemical cagingcaging processprocess maymay alsoalso conferconfermembranemembranepermeabilitypermeabilityonont
199、hethecagedcagedligand,ligand,asasisisthethecasecaseforforcagedcagedcAMPcAMPandandcagedcagedluciferin.luciferin.CagedCagednucleotides,nucleotides,chelators,chelators,secondsecond messengersmessengers andand neurotransmittersneurotransmitters havehave tremendoustremendouspotentialpotentialforforuseuse
200、withwithlivelivecells.cells.Caged Caged CompoundsCompounds, ,volumevolume291291ofof Methods Methods in in EnzymologyEnzymology, , isis aa valuablevaluable referencereference bookbook thatthatprovidesprovides anan up-to-dateup-to-date overviewoverview ofof caged-probecaged-probe synthesis,synthesis,c
201、haracterizationcharacterization andand applicationsapplications fromfrom leadingleading expertsexperts inin thethefield.field.In addition to caged versions of biologically activemolecules,peoplepreparedcagedfluorescentdyesthatare essentially nonfluorescent until after photolysis.These caged fluoroph
202、ores have proven useful forphotoactivation of fluorescence (PAF) experiments,which are analogous to fluorescence recovery afterphotobleaching (FRAP) experiments except that thefluorophore is activated upon illumination rather thanbleached.Measuringthebrightfluorescentsignalofthephotoactivatedfluorop
203、horeagainstadarkbackgroundisintrinsically more sensitive than measuring a darkphotobleachedregionagainstabrightfield.用荧光研究细胞的活性用荧光染料确定细胞的活性，通常是测量细胞用荧光染料确定细胞的活性，通常是测量细胞用荧光染料确定细胞的活性，通常是测量细胞用荧光染料确定细胞的活性，通常是测量细胞的代谢过程的代谢过程的代谢过程的代谢过程( ( ( (例如酶的活性和膜电位例如酶的活性和膜电位例如酶的活性和膜电位例如酶的活性和膜电位) ) ) )。判断细胞是否死亡或正在死亡，可利用不
204、透膜判断细胞是否死亡或正在死亡，可利用不透膜判断细胞是否死亡或正在死亡，可利用不透膜判断细胞是否死亡或正在死亡，可利用不透膜的核染色。的核染色。的核染色。的核染色。还有一类探测细胞存活的荧光探针是一些酶的还有一类探测细胞存活的荧光探针是一些酶的还有一类探测细胞存活的荧光探针是一些酶的还有一类探测细胞存活的荧光探针是一些酶的底物，这些酶在健康的细胞中具有活性。底物，这些酶在健康的细胞中具有活性。底物，这些酶在健康的细胞中具有活性。底物，这些酶在健康的细胞中具有活性。也有的荧光探针是一些功能性的离子泵。也有的荧光探针是一些功能性的离子泵。也有的荧光探针是一些功能性的离子泵。也有的荧光探针是一些功能
205、性的离子泵。ViabilityandCytotoxicityAssaysforDiverseCellTypes Viability/CytotoxicityAssaysUsingEsteraseSubstratesViability/CytotoxicityAssaysUsingEsteraseSubstrates Viability/CytotoxicityAssaysUsingNucleicAcidStainsViability/CytotoxicityAssaysUsingNucleicAcidStains Viability/CytotoxicityAssaysThatMeasureO
206、xidationorViability/CytotoxicityAssaysThatMeasureOxidationorReductionReduction OtherViability/CytotoxicityAssayMethodsOtherViability/CytotoxicityAssayMethods ViabilityAssayKitsforAnimalCellsViabilityAssayKitsforAnimalCells ViabilityAssayandOrganelleMarkerKitsforYeastViabilityAssayandOrganelleMarkerK
207、itsforYeast ViabilityAssayandGramStainKitsforBacteriaViabilityAssayandGramStainKitsforBacteria FluorescentAntibioticsandRelatedProbesFluorescentAntibioticsandRelatedProbesViability/CytotoxicityAssaysUsingNucleicAcidStains ToTosimultaneouslysimultaneouslydetectdetectbothboththethelive-celllive-cellan
208、danddead-dead-cellcellpopulations,populations,viabilityviabilityassessmentsassessmentsofofanimalanimalcells,cells,bacteriabacteria andand yeastyeast frequentlyfrequently employemploy polarpolar andandthereforetherefore cell-impermeantcell-impermeant nucleicnucleic acidacid stainsstains totodetectdet
209、ect thethe dead-celldead-cell population.population. NucleicNucleic acidacid stainsstainsarearemostmostoftenoftenusedusedinincombinationcombinationwithwithintracellularintracellularesteraseesterasesubstratessubstrates(see(seeabove),above),membrane-membrane-permeantpermeantnucleicnucleicacidacidstain
210、sstains(see(seebelow),below),membranemembranepotentialpotential probes,probes, organelleorganelle probesprobes oror cell-permeantcell-permeantindicatorstodetectthelive-cellpopulation.indicatorstodetectthelive-cellpopulation. AssaysforCellEnumeration,CellProliferationandCellCycleCellEnumerationandCel
211、lProliferationCellEnumerationandCellProliferationAssaysforAnimalCellsAssaysforAnimalCellsDetectionandEnumerationAssaysforDetectionandEnumerationAssaysforMicroorganismsandVirusesMicroorganismsandVirusesCell-CycleAnalysisCell-CycleAnalysisAssaysforApoptosisApoptosisAssaysUsingNucleicAcidStainsApoptosi
212、sAssaysUsingNucleicAcidStainsDetectingDNAStrandBreakswithDetectingDNAStrandBreakswithChromaTideNucleotidesChromaTideNucleotidesApoptosisAssaysUsingAnnexinVApoptosisAssaysUsingAnnexinVConjugatesConjugatesApoptosisAssaysBasedonProteaseActivityApoptosisAssaysBasedonProteaseActivityApoptosisAssaysUsingM
213、itochondrialStainsApoptosisAssaysUsingMitochondrialStainsApoptosisAssaysUsingFreeRadicalProbesApoptosisAssaysUsingFreeRadicalProbesApoptosisAssaysUsingIonIndicatorsApoptosisAssaysUsingIonIndicatorsApoptosisAssaysUsingEsteraseSubstratesApoptosisAssaysUsingEsteraseSubstrates ProbesforCellAdhesion,Chem
214、otaxis,andMultidrugResistanceCellAdhesionAssaysCellAdhesionAssaysChemotaxisAssaysChemotaxisAssaysMultidrugResistanceAssaysMultidrugResistanceAssays用流式细胞术检测细胞活性 流式细胞术是荧光技术与激光技术、计算机技术结合的产物，流式细胞术是荧光技术与激光技术、计算机技术结合的产物，流式细胞术是荧光技术与激光技术、计算机技术结合的产物，流式细胞术是荧光技术与激光技术、计算机技术结合的产物，是对单个细胞或其它生物微粒（如细菌、真菌、染色体、细是对单个细胞
215、或其它生物微粒（如细菌、真菌、染色体、细是对单个细胞或其它生物微粒（如细菌、真菌、染色体、细是对单个细胞或其它生物微粒（如细菌、真菌、染色体、细胞聚合体等）进行快速定量分析与分选的一种技术。胞聚合体等）进行快速定量分析与分选的一种技术。胞聚合体等）进行快速定量分析与分选的一种技术。胞聚合体等）进行快速定量分析与分选的一种技术。 在分析或分选过程中，包在液流在分析或分选过程中，包在液流在分析或分选过程中，包在液流在分析或分选过程中，包在液流( ( ( (称为鞘液称为鞘液称为鞘液称为鞘液) ) ) )中的单个细胞或中的单个细胞或中的单个细胞或中的单个细胞或颗粒顺序通过聚焦的探测光，进而用各种光监测
216、元件测量细颗粒顺序通过聚焦的探测光，进而用各种光监测元件测量细颗粒顺序通过聚焦的探测光，进而用各种光监测元件测量细颗粒顺序通过聚焦的探测光，进而用各种光监测元件测量细胞或颗粒的散射光或荧光等参数，对细胞和颗粒的物理和化胞或颗粒的散射光或荧光等参数，对细胞和颗粒的物理和化胞或颗粒的散射光或荧光等参数，对细胞和颗粒的物理和化胞或颗粒的散射光或荧光等参数，对细胞和颗粒的物理和化学性质进行测量，并根据这些性质对细胞或颗粒进行分类和学性质进行测量，并根据这些性质对细胞或颗粒进行分类和学性质进行测量，并根据这些性质对细胞或颗粒进行分类和学性质进行测量，并根据这些性质对细胞或颗粒进行分类和分选。分选。分选。
217、分选。 进行这种测量的仪器称为流式细胞计进行这种测量的仪器称为流式细胞计进行这种测量的仪器称为流式细胞计进行这种测量的仪器称为流式细胞计( ( ( (flowcytometerflowcytometer) ) ) )。仪器由电子电路和计算机控制，并测量和输出若干参数，如向前散仪器由电子电路和计算机控制，并测量和输出若干参数，如向前散射光射光(FSC,forwardlightscattering)、90 散射光散射光(SSC,sidescattering)及不同波长的荧光及不同波长的荧光FL1、FL2、FL3等。等。以细胞数为纵坐标，把以上四个参数中的任何一个作为横坐标，可以细胞数为纵坐标，把以
218、上四个参数中的任何一个作为横坐标，可以得到各种直方图。以得到各种直方图。如果把以上四个参数中的任何一个作为横坐标，另一个作为纵坐标，如果把以上四个参数中的任何一个作为横坐标，另一个作为纵坐标，则可以得到各种二维点图，其中每一个点代表一个细胞。由于细胞则可以得到各种二维点图，其中每一个点代表一个细胞。由于细胞性质的相同和不同，二维点图上的细胞点会聚集成不同的类别或亚性质的相同和不同，二维点图上的细胞点会聚集成不同的类别或亚群。群。如果在二维点图的基础上再加入细胞数作为第三维，则可以得到三如果在二维点图的基础上再加入细胞数作为第三维，则可以得到三维图。三维图也可以用二维等高图的形式来表示。维图。三
219、维图也可以用二维等高图的形式来表示。用不同的荧光探剂标记细胞内用不同的荧光探剂标记细胞内不同的成分，即可得到不同的不同的成分，即可得到不同的信息。信息。在在细细胞胞生生物物学学研研究究中中，流流式式细细胞胞术术应应用用最最多多的的是是细细胞胞周周期期分分析析，包包括细胞周期各时相的百分比及细胞周期动力学参数。括细胞周期各时相的百分比及细胞周期动力学参数。用用荧荧光光探探剂剂标标记记DNA和和RNA，在在细细胞胞周周期期内内，DNA和和RNA含含量量随随各各时时相相发发生生周周期期性性变变化化，根根据据DNA和和RNA含含量量的的变变化化可可以以计计算算出出核核酸酸的的合合成成速速率率，判判断断
220、细细胞胞处处于于什什么么时时相相，并并计计算算出出处处于于不不同同细细胞胞周周期期时时相相的的细细胞胞数数量量，并并研研究究不不同同细细胞胞在在不不同同条条件件下下(如如加加入入不不同同药药物物时时)细细胞胞周周期期动动力力学学的的参参数数的的变变化化，得得到到有有关关细细胞胞生生物物学学、药药理学、病理学的信息。理学、病理学的信息。例例如如，溴溴脱脱氧氧尿尿嘧嘧啶啶核核苷苷(Bromodeoxyuridine,BrdU)是是胸胸苷苷的的一一种种类类似似物物，用用BrdU处处理理细细胞胞，BrdU将将代代替替胸胸苷苷参参与与DNA合合成成。用用FITC等等荧荧光光探探针针标标记记的的BrdU单
221、单克克隆隆抗抗体体与与已已含含有有BrdU的的细细胞胞一一起起温浴，荧光探针的荧光强度就可以反映细胞内温浴，荧光探针的荧光强度就可以反映细胞内DNA合成的情况。合成的情况。可可以以用用这这种种方方法法研研究究抗抗癌癌药药物物或或细细胞胞生生长长因因子子对对细细胞胞增增殖殖的的抑抑制制或或促进作用，从而得到有关药物药效和药理学的信息。促进作用，从而得到有关药物药效和药理学的信息。细胞内细胞内pH、膜电位、细胞内钙都是细胞激活过程中重要的细胞参数膜电位、细胞内钙都是细胞激活过程中重要的细胞参数用用pH敏感的荧光探针可以测量细胞内敏感的荧光探针可以测量细胞内pH值值用用cyanine(花青苷花青苷)
222、、Rhodamine123、Oxonol等膜电位敏感性等膜电位敏感性荧光探针标记细胞膜，可以根据荧光强度的变化与膜电位的对应关荧光探针标记细胞膜，可以根据荧光强度的变化与膜电位的对应关系来测量膜电位系来测量膜电位用用Quin-2、Indo-1、Fura-2、Fluo-3和和Rhod-2等钙螯合剂等钙螯合剂EGTA的衍生物可以测量细胞内钙的浓度。的衍生物可以测量细胞内钙的浓度。根据这些参数，可以了解更多的细胞内信号传导和激活过程的细节根据这些参数，可以了解更多的细胞内信号传导和激活过程的细节用流式细胞术研究环境中的污染物质引起的细胞突变用流式细胞术研究环境中的污染物质引起的细胞突变研究细胞表面抗
223、原决定簇的性质研究细胞表面抗原决定簇的性质研究细胞抗原的表达研究细胞抗原的表达分离各种各样异常的细胞分离各种各样异常的细胞利用流式细胞术还可以将分离后的染色体进行分类和纯化，利用流式细胞术还可以将分离后的染色体进行分类和纯化，分选指定的染色体，用来建立人类染色体分选指定的染色体，用来建立人类染色体DNADNA文库文库流式细胞术也被用来检测细胞表面或内部由特异基因编码流式细胞术也被用来检测细胞表面或内部由特异基因编码的细胞；用来分离和分选家畜的的细胞；用来分离和分选家畜的X X、Y Y精子，以进一步控制精子，以进一步控制胎畜的性别。胎畜的性别。在微生物学中，流式细胞术被用来对大量的细菌进行逐个在
224、微生物学中，流式细胞术被用来对大量的细菌进行逐个的快速多参数精确测量和分类，研究病毒对细胞的感染过的快速多参数精确测量和分类，研究病毒对细胞的感染过程。程。Jurkatcells(T-cellleukemia,human)treatedwith10Mcamptothecin(喜树碱)forfourhours(blackline)oruntreated(ascontrol,blueline).CellswerethentreatedwiththereagentsintheVybrantApoptosisAssayKit#1followedbyflowcytometricanalysis. Not
225、e that the camptothecin-treated cells (black line) have a higherpercentageofapoptoticcells(intermediategreenfluorescence)thanthebasallevelofapoptosisseeninthecontrolcells(blueline).Jurkatcells(T-cellleukemia,human)treatedwith10Mcamptothecin(喜 树 碱 ， 一 种 抗 癌 药 ) for fourhours (bottom panel) oruntreate
226、d(ascontrol,toppanel).Cellswerethen treated with the reagents inthe Vybrant Apoptosis Assay Kit#2, followed by flow cytometricanalysis.Notethatthecamptothecin-treatedcells(bottompanel)haveahigherpercentageofapoptoticcells(indicatedbyanA)than the basal level of apoptosisseen in the control cells (top
227、panel). V = viable cells, N =necroticcells.Jurkat cells (T-cell leukemia,human) treated with 10 Mcamptothecin for four hours(bottompanel)oruntreated(ascontrol, top panel). Cells werethentreatedwiththereagentsintheVybrantApoptosisAssayKit#4 followed by flow cytometricanalysis.Notethatthecamptothecin-
228、treatedcells(bottom panel) have a higherpercentage of apoptotic cells(indicated by an A) than thebasallevelofapoptosisseeninthecontrolcells(toppanel).V=viablecells,N=necroticcells.QuantitativeflowcytometricanalysisofEscherichia coliviabilityusing SYTOX Green nucleic acidstain.Abacterialsuspensioncon
229、taininganequalnumberofliveand isopropyl alcoholkilled E. coliwasstainedwithSYTOXGreenandanalyzedusingexcitationat488nmonaBectonDickinsonFACSVantagecytometer.Abivariatefrequency distribution for forwardlightscatterversuslogfluorescenceintensity (collected with a 510 nmlongpass optical filter) shows t
230、woclearly distinct populations. Whenliveanddeadbacteriaweremixedin varying proportions, a linearrelationshipbetweenthepopulationnumbersandtheactualpercentageof live cells in the sample wasobtained(seeinsert).Flow cytometric enumerationofBacillus cereususingBacteriaCountingKit.Bacteriastained with th
231、e SYTO BCbacterial cell stain and mixedwith known concentrations ofweaklyfluorescent6mpolystyrenemicrospherestandardsproduceabivariatefrequencydistributionforforward light scatter versusgreen fluorescence intensitythatallowsthebacterialpopulationnumbertobedeterminedbyreferencetotheclearlyseparatedmi
232、crospherestandardpopulation.Indicatedbyreddatapoints.FlowcytometricviabilityassayusingLIVE/DEADViability/Cytotoxicity Kit. A 1:1mixture of live and ethanol-fixed human B cells wasstained with calcein AM andethidiumhomodimer-1accordingtothekitsprotocol.After5minutes,flowcytometricanalysiswascarriedou
233、t with excitation at 488 nmon a Becton Dickinson FACSVantagecytometer.Theresulting bivariate frequencydistribution shows the clearseparationofthegreen-fluorescent (530 nm) live-cellpopulationfromthered-fluorescent(585nm)dead-cellpopulation.Flow cytometric analysisof a mixed population ofliveandcompl
234、ement-treatedgoatlymphocytesstainedusingthereagents and protocolsprovided in LIVE/DEADReducedBiohazardViability/CytotoxicityKitandmonitoredovera24-hour period. The panels(lefttoright,toptobottom)representthedistribution of SYTO 10(FL1) and DEAD Red(FL3)fluorescenceinlymphocytes at 0, 5 and24 hours a
235、fter fixation.Thelowerrightpanelisaplot of the separationbetween the live- anddead-populationpeaksasafunctionoftime.A)Two-colorflowcytometricanalysisofStaphylococcus aureus（金黄色葡萄球菌）populationsstainedwith30 mM DiOC2(3) in the presence(red) or absence (blue) of themetabolicuncouplercarbonylcyanidem-ch
236、lorophenylhydrazone(CCCP). Note the variability (100-fold range) of the green and redfluorescenceintensities.B) The same data expressed asred/greenfluorescenceintensityratios. Ratio values are calculatedbysubtractingthelogarithmicgreenfluorescencechannelvaluefromthecorrespondinglogarithmicredfluores
237、cencechannelvalue.BivariateJC-1analysisofmitochondrialmembranepotentialinHL60cellsbyflowcytometry.ThesensitivityofthistechniqueisdemonstratedbytheresponsetoK+/valinomycin-induceddepolarizationB).Distinctpopulationsofcellswithdifferentextentsofmitochondrialdepolarizationaredetectablefollowingapoptosi
238、s-inducingtreatmentwith5Mstaurosporine（星形孢菌素）fortwohoursC).光镊(opticaltweezers) 光镊是以光的力学效应为基础发展起来的一种新型技术光镊是以光的力学效应为基础发展起来的一种新型技术光镊是以光的力学效应为基础发展起来的一种新型技术光镊是以光的力学效应为基础发展起来的一种新型技术 用用用用光光光光镊镊镊镊可可可可以以以以实实实实现现现现对对对对细细细细胞胞胞胞、细细细细胞胞胞胞器器器器以以以以至至至至生生生生物物物物大大大大分分分分子子子子进进进进行行行行非非非非机械接触的、无损的捕获和操作。机械接触的、无损的捕获和操作。机
239、械接触的、无损的捕获和操作。机械接触的、无损的捕获和操作。 光光光光镊镊镊镊在在在在生生生生物物物物学学学学研研研研究究究究中中中中的的的的应应应应用用用用，大大大大都都都都与与与与荧荧荧荧光光光光技技技技术术术术密密密密切切切切结结结结合合合合。所所所所研研研研究究究究的的的的细细细细胞胞胞胞或或或或生生生生物物物物大大大大分分分分子子子子往往往往往往往往采采采采用用用用荧荧荧荧光光光光探探探探针针针针进进进进行行行行标标标标记记记记。例例例例如如如如，用用用用荧荧荧荧光光光光探探探探针针针针标标标标记记记记肌肌肌肌动动动动蛋蛋蛋蛋白白白白，结结结结合合合合光光光光镊镊镊镊技技技技术术术术，拍拍拍拍摄摄摄摄了单个了单个了单个了单个“ “分子马达分子马达分子马达分子马达” ”的运动情况。的运动情况。的运动情况。的运动情况。
