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1、第五节第五节 荧光原位杂交荧光原位杂交（FISH）人类染色体疾病的诊断染色体显带技术的优缺点染色体显带技术的优缺点n n染色体显带是细胞遗传学分析技术中不染色体显带是细胞遗传学分析技术中不可替代的基本方法。可替代的基本方法。“金标准”l l操作简便，经济操作简便，经济l l可以提供核型的完整图像可以提供核型的完整图像n n影响因素：影响因素：l l染色体相似性很强，复杂畸变时；或畸变微小（如缺染色体相似性很强，复杂畸变时；或畸变微小（如缺失失5Mb)5Mb)，不足以引起图像明显变化时，结果分析困，不足以引起图像明显变化时，结果分析困难。难。l l耗时（培养需耗时（培养需7272小时）且依赖于获
2、得良好的分裂相，小时）且依赖于获得良好的分裂相，而有的标本中分裂指数低，或染色体形态学表型差。而有的标本中分裂指数低，或染色体形态学表型差。人类染色体疾病的诊断一、一、FISH原理原理（一）、几个概念（一）、几个概念n n杂交杂交n n原位杂交原位杂交n n荧光原位杂交荧光原位杂交依据DNA双链碱基互补、变性双链碱基互补、变性和复性原理，用已知碱基序列和复性原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针检测的单链核酸片段作为探针检测样本中是否存在与其互补的同样本中是否存在与其互补的同源核酸序列，这一过程叫做杂源核酸序列，这一过程叫做杂交。交。原位杂交(in situ hybridization)是
3、用已是用已标记的核酸探针与组织切片或标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序细胞中的待测核酸中的互补序列杂交列杂交,从而对组织细胞中的从而对组织细胞中的核酸进行定性、定位和相对定核酸进行定性、定位和相对定量分析。量分析。人类染色体疾病的诊断原位杂交原位杂交n n1 1）同位素原位杂交）同位素原位杂交）同位素原位杂交）同位素原位杂交(Isotopic in situ (Isotopic in situ hybridization)70hybridization)70年代年代年代年代n n2 2）非同位素原位杂交）非同位素原位杂交）非同位素原位杂交）非同位素原位杂交(Non-isoto
4、pic in situ (Non-isotopic in situ hybridization)80hybridization)80年代中后期年代中后期年代中后期年代中后期l l（1 1）免疫酶联）免疫酶联）免疫酶联）免疫酶联l l（2 2）荧光原位杂交（）荧光原位杂交（）荧光原位杂交（）荧光原位杂交（Fluorescence in situ Fluorescence in situ hybridization, FISH)*hybridization, FISH)*同位素原位杂交的不足：同位素原位杂交的不足：同位素原位杂交的不足：同位素原位杂交的不足：1 1）不稳定；）不稳定；）不稳定；）不
5、稳定；2 2）高背景；）高背景；）高背景；）高背景；3 3）曝光时间长；）曝光时间长；）曝光时间长；）曝光时间长；4 4）结果统计）结果统计）结果统计）结果统计学处理繁琐学处理繁琐学处理繁琐学处理繁琐;5;5）同位素的使用和处理）同位素的使用和处理）同位素的使用和处理）同位素的使用和处理人类染色体疾病的诊断荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISH）n nFISH技术是常规染色体分析的辅助手段。它是用荧光素标记特异探针，与染色体做杂交后，根据特异的荧光信号来判断结果。n n它可用于标记染色体的识别、特异融合基因的检测，并可广泛用于肿瘤的诊断分型，新基因定位，用全染色体涂抹探针识别复杂的染色体结构异常
6、等。人类染色体疾病的诊断原理：通过观察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况。人类染色体疾病的诊断人类染色体疾病的诊断二、二、FISH的优点：的优点：1. 1.操作简便，探针标记后稳定，一次标记后可使用操作简便，探针标记后稳定，一次标记后可使用二年。二年。2. 2.方法敏感，能迅速得到结果。方法敏感，能迅速得到结果。3. 3.在同一标本上，可同时几种不同探针，显示在同一标本上，可同时几种不同探针，显示DNADNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确；可以检测隐匿或微小的染色体畸变定位精确；可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型。以及复杂核型
7、。 4. 4.不仅可用于分裂细胞染色体数量或结构变化的研不仅可用于分裂细胞染色体数量或结构变化的研究，而且还可用于静止期细胞的染色体数量及究，而且还可用于静止期细胞的染色体数量及基因改变的研究。基因改变的研究。人类染色体疾病的诊断三、三、FISH探针探针n n用生物素或地高辛标记称为间接标记。间接标记。 杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号。杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号。l优点：在信号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大l缺点步骤较多,操作麻烦。（一）、直接标记和间接标记（一）、直接标记和间接标记人类染色体疾病的诊断直接用荧光素标记DNA的方法称为直接标记直接标记。l优
8、点：由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信号,省去了烦琐的免疫荧光反应。由于近年来荧光素的亮度和抗淬灭性的不断改进和提高,直接标记的荧光探针应用越来越多。人类染色体疾病的诊断探针标记n n在已知探针DNA结构及序列情况下可采用PCR或RNA逆转录法标探针。通常用Biotin标记的探针应大于100bp，较小的探针可采用PCR技术来标记。n n近年来，VYSIS公司成功的生 产了大片段的DNA探针（100400kb）。由于探针较长，故可将荧光物质直接标记在核苷酸上，这不仅使杂交过程进一步简化面且杂交信号增强。人类染色体疾病的诊断（二）、（二）、FISH探针的种类探针的种类1）单拷贝探针：）单拷
9、贝探针：（1）种类：酵母人工染色体（）种类：酵母人工染色体（YAC），细），细菌人工染色体（菌人工染色体（BAC），），Cosmid，Plasmid，cDNA片段片段（2）应用）应用（a）定位）定位DNA片段及嵌合体克隆验证；片段及嵌合体克隆验证；（b）确定染色体微小缺失与重复；）确定染色体微小缺失与重复；（c）染色体断裂点分析。）染色体断裂点分析。人类染色体疾病的诊断）简单重复序列探针）简单重复序列探针(simple repetitive probes） 其靶序列为其靶序列为 卫星卫星卫星卫星DNADNA或卫星或卫星或卫星或卫星III DNA(alpha III DNA(alpha sate
10、llite/satellite III DNA)satellite/satellite III DNA)多位于染色体的着丝粒，多位于染色体的着丝粒，多位于染色体的着丝粒，多位于染色体的着丝粒，异染色质区域和端粒，重复数百次至数千次。异染色质区域和端粒，重复数百次至数千次。异染色质区域和端粒，重复数百次至数千次。异染色质区域和端粒，重复数百次至数千次。特点：信号强特点：信号强应用：应用：(a)标记染色体识别标记染色体识别(b)染色体数目异常检测染色体数目异常检测(c)同时由于同时由于G显带时，端粒区是苍白的，因此涉显带时，端粒区是苍白的，因此涉及此区的易位常难以检测，而应用端粒探针则及此区的易位
11、常难以检测，而应用端粒探针则弥补了弥补了G显带的不足显带的不足人类染色体疾病的诊断3）染色体涂染探针（）染色体涂染探针（chromosome painting probes)整条染色体探针或染色体区带特异性探针整条染色体探针或染色体区带特异性探针包括通过流式细胞仪（包括通过流式细胞仪（FACSFACS）分选或显微切割）分选或显微切割获得的全染色体，染色体臂，或染色体特异性区带涂抹获得的全染色体，染色体臂，或染色体特异性区带涂抹探针探针应用：应用：检测染色体数目或结构异常。检测染色体数目或结构异常。人类染色体疾病的诊断四、FISH的临床应用人类染色体疾病的诊断n n1. 1.在细胞遗传学检查中，
12、重复序列的探针应用最多，在细胞遗传学检查中，重复序列的探针应用最多，它们是它们是 卫星卫星DNADNA、 卫星卫星DNADNA和经典卫星和经典卫星DNADNA探探针。针。uu 卫星卫星DNADNA探针主要检测人染色体的着丝粒。探针主要检测人染色体的着丝粒。uu 卫星卫星DNADNA位于顶端着丝粒染色体及染色体的异位于顶端着丝粒染色体及染色体的异染色质染色质 周围。周围。uu经典卫星经典卫星DNADNA有着有着AATGGAATGG短片段，位于染色体短片段，位于染色体1 1、9 9、1515、1616和和Y Y染色体长臂异染色质周围，后染色体长臂异染色质周围，后两处探针除了可用于染色体数目检查外，
13、还可用两处探针除了可用于染色体数目检查外，还可用于上述部位精细改变的检查。于上述部位精细改变的检查。人类染色体疾病的诊断染色体着丝粒荧光人类染色体疾病的诊断染色体端粒荧光人类染色体疾病的诊断n nFISHFISH检测检测1818三体及三体及TurnerTurner综合征结果综合征结果左图：左图： 1818（蓝色）（蓝色）X(X(绿色绿色)Y)Y（红色）探针，显示（红色）探针，显示1818号、号、X X和和Y Y染色体为正常；染色体为正常；中图：中图：1818三体综合征病例的三体综合征病例的FISHFISH结果，有三个蓝色信号结果，有三个蓝色信号（1818号）；号）；右图：右图：TurnerTu
14、rner综合征病例的综合征病例的FISHFISH结果，结果，1 1个绿色信号（个绿色信号（X X单体）单体）人类染色体疾病的诊断n nFISH检测21三体综合征结果 左图：以左图：以1313（绿色）（绿色）2121（红色）为探针，显示（红色）为探针，显示1313号和号和2121号染色体为正常；号染色体为正常；中图及右图：中图及右图：2121三体综合征病例的三体综合征病例的FISHFISH结果，结果，有三个红色信号（有三个红色信号（2121号）。号）。 人类染色体疾病的诊断n n对于临床来说，对母血清唐氏筛查异常的高危孕妇，可以考虑选择FISH检测。 因为血清学筛查主要针对因为血清学筛查主要针对
15、2121、1818、1313一三体发病风险一三体发病风险的统计，的统计，8080的常见染色体异常发生在的常见染色体异常发生在2l2l、1818、l3l3、X X及及Y Y这这5 5对染色体，而对染色体，而FISHFISH针对这些血清学异常已达针对这些血清学异常已达到很高的特异性及敏感性，且到很高的特异性及敏感性，且FISHFISH的快速简便，可以的快速简便，可以极大的缓解孕妇的焦虑情绪。极大的缓解孕妇的焦虑情绪。n n晚孕期的的孕妇也建议使用FISH检测。 因为晚孕期羊水培养失败率较高，而脐血穿刺流产的因为晚孕期羊水培养失败率较高，而脐血穿刺流产的风险较高，选择风险较高，选择FISHFISH检
16、测快速用于临床诊治指导，减检测快速用于临床诊治指导，减轻孕妇的焦虑及负担。轻孕妇的焦虑及负担。人类染色体疾病的诊断n nFISH检测与传统核型分析相比具有对孕周无严格要求，快速，简便，需要样本量小，可以检测微小缺失等优点，但它也有仅能检出部分染色体数目异常，不能检出染色体结构异常的缺点。人类染色体疾病的诊断n n2.血液病检测n n大部分白血病存在某种染色体易位，产生新的融合基因，大部分白血病存在某种染色体易位，产生新的融合基因，编码新的融合蛋白。利用这些标志可以诊断不同类型的白编码新的融合蛋白。利用这些标志可以诊断不同类型的白血病。特殊染色体异常往往同时有特征性的形态学异常和血病。特殊染色体
17、异常往往同时有特征性的形态学异常和独特的临床特点，染色体核型与独特的临床特点，染色体核型与AMLAML患者的预后和治疗密患者的预后和治疗密切相关，因此细胞遗传学在切相关，因此细胞遗传学在WHOWHO分型中占据了重要地位。分型中占据了重要地位。例如：例如：WHO 2001WHO 2001年建议，急性白血病（年建议，急性白血病（AMLAML）被划分为以）被划分为以下四组：下四组： (1)(1)急性髓系白血病伴急性髓系白血病伴重现性染色体异常重现性染色体异常； (2) (2)急性髓系白血病伴有多系细胞增生异常；急性髓系白血病伴有多系细胞增生异常； (3) (3)治疗相关的急性髓系白血病与骨髓增生异常
18、综合征；治疗相关的急性髓系白血病与骨髓增生异常综合征； (4) (4)不能归类的急性髓系白血病。不能归类的急性髓系白血病。人类染色体疾病的诊断n n 检查检查 初始治疗初始治疗n n HLAHLA配型配型 n n 体格检查体格检查 SouthernSouthernBCR-ABLBCR-ABL阴性阴性n n 血小板、血细胞记数血小板、血细胞记数 PhPh1 1阴性阴性 Western Western BMTBMTa an n 生化全套生化全套 PCR PCR n n成人成人CML CML 骨穿骨穿 活检活检 FISH FISH BCR-ABLBCR-ABL阳性阳性n n慢性期慢性期 形态学观察形
19、态学观察n n 幼稚细胞百分比幼稚细胞百分比 进行起始治疗（进行起始治疗（CML-2CML-2） n n 嗜碱性细胞百分比嗜碱性细胞百分比n n 核型分析核型分析 PhPh1 1阳性阳性 nna a n nNCCN:NCCN:国家综合肿瘤网肿瘤学临床实践指导国家综合肿瘤网肿瘤学临床实践指导国家综合肿瘤网肿瘤学临床实践指导国家综合肿瘤网肿瘤学临床实践指导20042004年第一版年第一版年第一版年第一版 慢性髓性白血病慢性髓性白血病慢性髓性白血病慢性髓性白血病20042004年第一版年第一版年第一版年第一版人类染色体疾病的诊断n n细胞遗传学和血液学缓解的标准细胞遗传学和血液学缓解的标准细胞遗传学
20、和血液学缓解的标准细胞遗传学和血液学缓解的标准1 1n n血液学完全缓解血液学完全缓解血液学完全缓解血液学完全缓解n n 末梢血完全正常，白细胞末梢血完全正常，白细胞101010109 9/L/Ln n 血小板血小板45010 45010 450109 9/L/Ln n 持续脾大但范围小于治疗前的持续脾大但范围小于治疗前的50%50%。nn1 1摘自摘自Faderi D Faderi D 等所著：等所著：慢性粒细胞白血病：生物学及治疗慢性粒细胞白血病：生物学及治疗。发表于。发表于Ann Intern Med Ann Intern Med 131:207-219,1999131:207-219,
21、1999。nn2 2至少检查至少检查2020个分裂象。个分裂象。人类染色体疾病的诊断n n肿瘤基因变异（或统称突变）的发生是一个累积的和概肿瘤基因变异（或统称突变）的发生是一个累积的和概率的过程率的过程 。我们每个人体内都在发生着突变，实际上大。我们每个人体内都在发生着突变，实际上大多数突变是无意义的，多数突变是无意义的，因此，一个肿瘤患者基因组内可因此，一个肿瘤患者基因组内可因此，一个肿瘤患者基因组内可因此，一个肿瘤患者基因组内可能有很多变异，可以表现为不同的形式。有的是决定意能有很多变异，可以表现为不同的形式。有的是决定意能有很多变异，可以表现为不同的形式。有的是决定意能有很多变异，可以表
22、现为不同的形式。有的是决定意义的，比如义的，比如义的，比如义的，比如BCR-ABL1BCR-ABL1融合基因；有的也有一定的辅助融合基因；有的也有一定的辅助融合基因；有的也有一定的辅助融合基因；有的也有一定的辅助意义，如复杂的染色体异常或特定的基因变异。意义，如复杂的染色体异常或特定的基因变异。意义，如复杂的染色体异常或特定的基因变异。意义，如复杂的染色体异常或特定的基因变异。n n不仅肿瘤的发生是一个动态过程，肿瘤发生后它的基因不仅肿瘤的发生是一个动态过程，肿瘤发生后它的基因不仅肿瘤的发生是一个动态过程，肿瘤发生后它的基因不仅肿瘤的发生是一个动态过程，肿瘤发生后它的基因组也在持续的发生着动态
23、的变化。一旦出现了新的有意组也在持续的发生着动态的变化。一旦出现了新的有意组也在持续的发生着动态的变化。一旦出现了新的有意组也在持续的发生着动态的变化。一旦出现了新的有意义的突变，还会导致疾病的进展。如部分义的突变，还会导致疾病的进展。如部分义的突变，还会导致疾病的进展。如部分义的突变，还会导致疾病的进展。如部分CMLCML患者发患者发患者发患者发病时只能看到和检测到病时只能看到和检测到病时只能看到和检测到病时只能看到和检测到BCR-ABL1BCR-ABL1融合基因，但发生急融合基因，但发生急融合基因，但发生急融合基因，但发生急变时就能看到复杂的染色体异常或变时就能看到复杂的染色体异常或变时就
24、能看到复杂的染色体异常或变时就能看到复杂的染色体异常或IKZF1IKZF1基因的变化。基因的变化。基因的变化。基因的变化。实际上是由于后来发生了更多的基因的异常，才导致了实际上是由于后来发生了更多的基因的异常，才导致了实际上是由于后来发生了更多的基因的异常，才导致了实际上是由于后来发生了更多的基因的异常，才导致了CMLCML进展为急性白血病。进展为急性白血病。进展为急性白血病。进展为急性白血病。人类染色体疾病的诊断FISH检测不需要进行细胞培养，是临床遗传学检测的有效补充检测不需要进行细胞培养，是临床遗传学检测的有效补充手段：手段：传统的染色体检查方法周期长，人工消耗大，而且染色体分析需要有较
25、好质量的中期分裂相。白血病患者肿瘤细胞中期分裂相不易获得，而且有些重要预后意义的累及基因位点的微缺失或仅存在于间期细胞中的异常，传统的细胞遗传学技术是不能检测出来的。荧光原位杂交技术不需要中期分裂相，因此可分析大量间期细胞，且具有操作相对简单、重复性好、敏感性和特异性高的优点。但需要指定基因特异性的探针，失去了核型分析的宏观性。人类染色体疾病的诊断Translocation t(9;22)(q34;q11)人类染色体疾病的诊断Translocation t(9;22)(q34;q11)人类染色体疾病的诊断在正常的细胞中，两个红点和两个绿点分别表示正常的ABL和BCR基因的正常位置。在不正常的细
26、胞中，BCR-ABL融合基因呈现为红绿两种颜色的融合，这种融合基因常常在观察中显示为黄色荧光（箭头所指）。人类染色体疾病的诊断五、几种新技术介绍五、几种新技术介绍人类染色体疾病的诊断1.多色荧光原位杂交（多色荧光原位杂交（M-FISH）采用全染色体探针（WCP）与染色体杂交，分析染色体数量和结构异常的分子生物学方法。探针是经过聚合酶链反应(Degenerateoligonucleotideprimedpolymerasechainreaction,DOP-PCR)扩增、流式分选、并用5种荧光素组合荧光标记法标记的同源染色体。这种经过标记的探针集合(Pool)与制备好的间期细胞染色体杂交,可使杂
27、交后的每条染色体表现出独有的颜色,从而能够分辨出人的22对常染色体和X、Y两条性染色体(图215),杂交后的图像通过滤光装置被计算机获得并分析得出结果。如果一条染色体的颜色不相同,则提示该条染色体有重组现象,根据每条染色体各自独有的颜色,可以知道哪几条染色体之间进行了重组人类染色体疾病的诊断M-FISH对染色体间复杂易位的分析有突出优势,但是对染色体微小易位(1MB)的分析则受到限制,而对染色体内部异常的分析则无能为力,这包括染色体的扩增、微小缺失和倒位人类染色体疾病的诊断染色体光谱核型比对分析技术（SKY-spectral-karyotyping)-创新的染色体数目和结构异常检查工具原理：光
28、谱核型分析SKY经由CCD相机撷取图像，利用光谱干涉仪及傅立叶转换技术，分辨获得图像每一像素点的光谱，以此标定出不同光谱的不同颜色。优势：对比传统的M-FISH,光谱核型分析技术的采用优势无法比拟。一传统的技术使用显微镜荧光滤镜来分辨荧光信号，缺点存在严重的荧光信号干扰（cross-talk),信号重叠，信号位移等，无法有效分辨染色体，也无法准确诊断染色体的细微变异，异位。而SKY完全克服以上缺点，对图像每一像素的光谱标以不同颜色，显而易见。二从成本上看，不需要电动显微镜，荧光滤镜仅使用一颗SKY滤镜，SKYPaint探针做一次杂交，一次图像撷取，让使用人员减轻时间，精力，同时获取稳定结果。人
29、类染色体疾病的诊断人类染色体疾病的诊断4. 4. 比较基因组杂交比较基因组杂交 Comparative Genomic Hybridization (CGH) (CGH)原理：原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂在荧光原位杂交基础上，结合消减杂 交技术而发展起来的技术，主要用于交技术而发展起来的技术，主要用于 肿瘤的检测及其基因组分析肿瘤的检测及其基因组分析是由是由Kallioniemi等在等在1992年首先提出的，是年首先提出的，是检测整个肿瘤基因组检测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力增加或减少的强有力的工具的工具人类染色体疾病的诊断比较基因组杂交（CGH） n nCGHCGH不需要
30、制备患者的染色体标本不需要制备患者的染色体标本, , 只需采用肿瘤患者只需采用肿瘤患者的基因组的基因组DNADNA和正常人的基因组和正常人的基因组DNADNA作为探针，与正作为探针，与正常人的中期染色体分裂相进行杂交。比较两种探针所常人的中期染色体分裂相进行杂交。比较两种探针所标的荧光信号的强度比率来判断肿瘤患者的标的荧光信号的强度比率来判断肿瘤患者的DNADNA是否是否存在缺失、增加或复制。存在缺失、增加或复制。 因而因而CGHCGH最适合于检测实体最适合于检测实体瘤瘤, , 淋巴瘤等不易得到高质量染色体标本的疾病淋巴瘤等不易得到高质量染色体标本的疾病. . n nCGHCGH另一无法替代的
31、优点是另一无法替代的优点是, , 它可在一次杂交中检测整它可在一次杂交中检测整个基因遗传个基因遗传 物质的增加或减少物质的增加或减少, , 但精度有限但精度有限, , 对微小的对微小的扩增或缺失检测不出扩增或缺失检测不出, , 仅适用于对整个基因组进行筛查仅适用于对整个基因组进行筛查. . CGHCGH也无法发也无法发 现平衡染色体易位现平衡染色体易位. . 人类染色体疾病的诊断比较基因组杂交原理示意比较基因组杂交原理示意 肿瘤肿瘤DNADNA和对照和对照DNADNA在染色在染色体上的相对结合量取决于两体上的相对结合量取决于两种种DNADNA标本中相应杂交序列标本中相应杂交序列的多少的多少 因
32、此可根据不同荧光強度因此可根据不同荧光強度的比率而定量分析肿瘤基因的比率而定量分析肿瘤基因組中組中DNADNA的增加或丟失的增加或丟失等比混合等比混合人类染色体疾病的诊断比较基因组杂交过程比较基因组杂交过程人类染色体疾病的诊断DAPIDAPI4 4,6-,6-二联脒二联脒-2-2-吲哚苯吲哚苯FITC异硫氰酸酯异硫氰酸酯TRITC硫氰酸四甲基罗丹明硫氰酸四甲基罗丹明人染色体不同荧光素染色结果人染色体不同荧光素染色结果人类染色体疾病的诊断数数字字化化图图像像人类染色体疾病的诊断FITC/TRITC FITC/TRITC 荧光强度比率分析图荧光强度比率分析图Ratio image FITC/TRI
33、TCRatio image FITC/TRITC人类染色体疾病的诊断人类染色体疾病的诊断比较基因组杂交应用范畴比较基因组杂交应用范畴n n可可可可在在在在基基基基因因因因组组组组水水水水平平平平上上上上对对对对染染染染色色色色体体体体变变变变异异异异部部部部位位位位进进进进行行行行准准准准确确确确的的的的定量定位分析；定量定位分析；定量定位分析；定量定位分析；n n不不不不需需需需要要要要细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养可可可可对对对对肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤基基基基因因因因组组组组DNADNADNADNA的的的的拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数进进进进行行行行定性分析与定量分析；定性分析与定量分析；定性分析
34、与定量分析；定性分析与定量分析；n n对对对对细细细细胞胞胞胞遗遗遗遗传传传传学学学学难难难难以以以以判判判判断断断断的的的的肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤染染染染色色色色体体体体的的的的某某某某些些些些成成成成分分分分（如双微体、标记染色体）的来源进行鉴定；（如双微体、标记染色体）的来源进行鉴定；（如双微体、标记染色体）的来源进行鉴定；（如双微体、标记染色体）的来源进行鉴定；n n快快快快速速速速检检检检出出出出染染染染色色色色体体体体三三三三体体体体性性性性、单单单单体体体体性性性性和和和和部部部部分分分分染染染染色色色色体体体体大大大大片片片片段段段段重重重重复复复复的的的的拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数变
35、变变变化化化化，有有有有利利利利于于于于对对对对先先先先天天天天畸畸畸畸形形形形、自自自自然流产等疾病进行快速诊断。然流产等疾病进行快速诊断。然流产等疾病进行快速诊断。然流产等疾病进行快速诊断。人类染色体疾病的诊断优势：优势： 可快捷检测中期、间期基因组可快捷检测中期、间期基因组 不需预先知道不需预先知道DNA发生改变的部位发生改变的部位 一次实验即可检出待测样本整个基因一次实验即可检出待测样本整个基因 组拷贝数的增减组拷贝数的增减人类染色体疾病的诊断多色信号采集n n常规的荧光显微镜的荧光显微镜的照像， 彩色胶片不易多次曝光，限制了这种联合标记探针的应用，使用CCD照像系统，先分别多次摄取灰
36、色的影像关储存在计算机内，而后冠以人为的颜色，运用软件系统融合各次得到的影像，最终形成一个复合的多颜色的图像。人类染色体疾病的诊断FISH和G显带技术结合n n对已做过G显带的染色体片子用75%的 乙醇或甲醇褪色后，可使FISH更清晰的辨认各条染色体及染色体结构异常（包括某些复杂的易位，插入，倒位等）,不仅可以用新近G带外理过的片子，而且还可用陈旧的G带片子。因此，FISH技术可成功的帮助细胞遗传学家做出回顾性分析。人类染色体疾病的诊断FISH技术和其他技术的结合n nFISH技术和RFLP结合，可以精确地描述原属于染色本长短臂等结构改变和染色体核形或复杂片段的性质。n nFISH和细胞免疫化
37、学技术结合，可以同时用多种颜色反应不同的核苷酸链和蛋白质，这样可以在单个细胞内同时找到基因的位点。转录和翻译和产物，有助了解核苷酸结构功能以及表达产物之间关系的研究。人类染色体疾病的诊断n nFISHFISH的应用的应用的应用的应用n n(1)(1)基因定位与基因制图（基因定位与基因制图（gene mappinggene mapping） 原理前面已叙述。原理前面已叙述。FISHFISH已经已经极大地加速了人类基因定位和基因制图的进程。极大地加速了人类基因定位和基因制图的进程。n n(2)(2)基因诊断基因诊断(gene diagnosis) (gene diagnosis) 精确、直观、明了
38、精确、直观、明了n n(3)(3)间期细胞遗传学（间期细胞遗传学（interphase cytogeneticsinterphase cytogenetics）n n(4)(4)FISHFISH在肿瘤生物学中的应用在肿瘤生物学中的应用 n n肿瘤细胞遗传学（肿瘤细胞遗传学（onco-cytogeneticsonco-cytogenetics）；）；n n基因定位：基因定位：FISHFISH可用于分离出的癌基因与抑癌基因初步定位；可用于分离出的癌基因与抑癌基因初步定位；n n病毒基因插入基因组部分的检测：虽然逆转录病毒以激活原癌基病毒基因插入基因组部分的检测：虽然逆转录病毒以激活原癌基因为主，也
39、有像腺病毒、因为主，也有像腺病毒、HPVHPV、SV40SV40等病毒以蛋白产物与抑癌基因蛋白等病毒以蛋白产物与抑癌基因蛋白产物相互作用而诱导细胞转化。但病毒基因特别是产物相互作用而诱导细胞转化。但病毒基因特别是DNADNA病毒多有病毒基病毒多有病毒基因成分插入到人基因组。利用因成分插入到人基因组。利用FISHFISH可以检测到病毒整合到人基因组中的可以检测到病毒整合到人基因组中的情况，对深入研究病毒致癌机理，以及检测、防治肿瘤均具有重要意义；情况，对深入研究病毒致癌机理，以及检测、防治肿瘤均具有重要意义；n n基因的扩增与缺失：原癌基因的激活与抑癌基因的失活是目前肿基因的扩增与缺失：原癌基因
40、的激活与抑癌基因的失活是目前肿瘤研究的热点。已知原癌基因的激活方式有：突变、基因扩增、易位、瘤研究的热点。已知原癌基因的激活方式有：突变、基因扩增、易位、病毒序列插入。抑癌基因的失活方式有：点突变、基因缺失。病毒序列插入。抑癌基因的失活方式有：点突变、基因缺失。FISHFISH为研为研究基因的扩增和缺失提供了新的方法，能将基因扩增和染色体重复分开。究基因的扩增和缺失提供了新的方法，能将基因扩增和染色体重复分开。 人类染色体疾病的诊断多色荧光原位杂交（M-FISH）n nM-FISHM-FISH相当于在相当于在 一次杂交中给每一条染色体一次杂交中给每一条染色体都涂上了不同的颜色都涂上了不同的颜色
41、, , 因而很容易就可看到多因而很容易就可看到多条染色体间的复杂易位情况和确定标志染条染色体间的复杂易位情况和确定标志染 色色体的来源体的来源. . n nM-FISHM-FISH是是19961996年才建立的一种新技术。使用年才建立的一种新技术。使用5 5种荧光染料按比例标记探针，杂交后形成种荧光染料按比例标记探针，杂交后形成2424条染色体上条染色体上2424种特异的荧光色彩以供核型分种特异的荧光色彩以供核型分析。它为人们提供了既丰富又完善的细胞遗析。它为人们提供了既丰富又完善的细胞遗传学信息，包括确定标记染色体的来源、检传学信息，包括确定标记染色体的来源、检测微小的染色体易位和检测复杂的染色体易测微小的染色体易位和检测复杂的染色体易位位 。人类染色体疾病的诊断多色荧光染色体显带（Rx-FISH）n n能否让每条区带也杂交上不同的颜色呢? 这一想法导 致了彩色核型分析(Rx-FISH)的诞生.n n Rx-FISH技术是采用多种荧光素标记与人类DNA有高度同原性猿的DNA作为探针，杂交后使人类的24条染色体上呈现特异的带型。这样便可根据彩色的荧光条带进行核型分析。人类染色体疾病的诊断
