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1、多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNA片断片断分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一其本质是在体外模拟胞内其本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程分子复制的过程美美国国科科学学家家穆穆利利斯斯(K.B.Mullis)发发明明了了PCR技技术术1993年年诺诺贝贝尔尔奖奖 一、多聚酶链式反应一、多聚酶链式反应是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增DNADNA片段的技术。片段的技术。能以极少量的能以极少量的DNADNA为模板，在几小时内为模板，在几小时内复制出上百万份的拷贝。复制出上百万份的拷贝。广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破
2、案、古生物学、基因克隆和古生物学、基因克隆和DNADNA序列测定等。序列测定等。二、二、DNADNA分子的结构分子的结构1 1、基本组成单位、基本组成单位脱氧核苷酸脱氧核苷酸脱脱氧氧核核苷苷酸酸脱氧核苷脱氧核苷磷酸磷酸脱氧核糖脱氧核糖含氮含氮碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤（腺嘌呤（A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G）胞嘧啶（胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T）脱氧核苷酸结构式脱氧核苷酸结构式35一个核苷酸上的一个核苷酸上的磷酸基团上的磷酸基团上的“OHOH”和和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之之间失去一分子水，形成间失去一分子水，形成磷酸二脂键，磷酸二脂键，即
3、在即在相邻相邻的的两个脱氧核苷酸的两个脱氧核苷酸的 3 3和和5 5碳原子碳原子之间形成之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3 3、5 5、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。核苷酸链。通常将通常将DNADNA的的羟基羟基 “OHOH”末端称末端称为为 3 3端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为5 5端。端。2 2、多脱氧核苷酸链的形成、多脱氧核苷酸链的形成OOPOHO碱基碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基5335碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖磷酸基团磷酸基团磷酸基团磷酸基团碱
4、基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖53多脱氧核苷酸链结构简图多脱氧核苷酸链结构简图3 3、DNADNA分子的双螺旋结构特点分子的双螺旋结构特点 DNA DNA分子是由两条反向平行的（即一条链为分子是由两条反向平行的（即一条链为3 35 5，另一条链为，另一条链为5 53 3 ）脱氧核苷酸）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构。长链盘旋而成的规则双螺旋结构。脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧。成基本骨架；碱基排列在链的内侧。两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱两
5、条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对。对。三、三、DNADNA的复制的复制2 2、时期、时期有丝分裂间期或减数第一次分裂前的间期有丝分裂间期或减数第一次分裂前的间期3 3、场所、场所细胞核（主）细胞核（主）（线粒体、叶绿体）（线粒体、叶绿体）4 4、模板、模板DNADNA母链母链1 1、概念、概念由一个由一个DNADNA形成两个完全相同的形成两个完全相同的DNADNA的过程的过程5 5、原材料、原材料脱氧核苷酸脱氧核苷酸6 6、基本条
6、件、基本条件酶、酶、ATPATP、原料、模板、原料、模板7 7、复制过程、复制过程 DNA DNA的解旋的解旋 亲代亲代DNADNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链平行的双链 RNA RNA引物的合成引物的合成以单股以单股DNADNA为模板，在引物酶的作用下合成为模板，在引物酶的作用下合成小段的小段的RNARNA引物。引物。 DNA DNA的生成的生成以单股的以单股的DNADNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶的作用下，聚合酶的作用下，在在RNARNA引物的末端由引物的末
7、端由5 5端端3 3端合成端合成DNADNA。边解旋边复制边解旋边复制( (过程）过程）8 8、复制特点、复制特点半保留复制（结果）半保留复制（结果）9 9、遵循原则、遵循原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则1010、精确复制的原因、精确复制的原因1111、复制的意义、复制的意义DNADNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性。后代，从而保持了遗传信息的连续性。规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行参与的组分参与的
8、组分在在DNADNA复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶DNADNA母链母链4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶引物引物总结：胞内总结：胞内DNADNA复制的基本体系复制的基本体系打开打开DNADNA双链双链提供提供DNADNA复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成DNADNA子链子链使使DNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3 3端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸四、四、 PCR(PCR(多聚酶链式反应）多聚酶链式反应）1 1、 PCRPCR原理原理在在8080100100的温度范围内，的温度范围内， DNADNA的双螺旋结的双螺旋
9、结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNADNA链又链又会重新结合成双链。会重新结合成双链。 PCR PCR利用了利用了DNADNA的热变性原理，通过控制温度的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCRPCR仪实仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。质上也是一台能够自动调控温度的仪器。变性变性复性复性延伸延伸加热到加热到9090，DNADNA双链双链解旋为单链解旋为单链降到降到5050，引物通过碱基，引物通过碱基互补配对与单链互补配
10、对与单链DNADNA结合结合升温到升温到7272，四种脱氧核苷酸，四种脱氧核苷酸在在DNADNA聚合酶的作用下，根据聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的碱基互补配对原则合成新的DNADNA链链2 2、细胞内和细胞外细胞内和细胞外DNADNA复制环境的区别复制环境的区别体内体内DNADNA的复制的复制体外的模拟体外的模拟模板（母链）模板（母链）引物引物4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶反应环境反应环境细胞内源细胞内源引物合成酶引物合成酶细胞内源细胞内源细胞内源细胞内源细胞内环境细胞内环境外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入缓冲液缓冲液 PC
11、R PCR过程需要的引物不是过程需要的引物不是RNARNA，而是人工合，而是人工合成的成的DNADNA单链，其长度通常为单链，其长度通常为20203030个脱氧核个脱氧核苷酸。苷酸。3 3、细胞内复制和、细胞内复制和PCRPCR的主要不同点的主要不同点 PCR PCR过程中过程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶，而是的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。通过对反应温度的控制来实现的。4 4、 DNADNA聚合酶聚合酶特性特性不能从头合成不能从头合成DNADNA，只能从，只能从DNADNA的的33端开端开始延伸始延伸DNADNA链，因此，链，因此， DNADNA复制需要引物。复制需
12、要引物。5 5、 DNADNA聚合酶聚合酶作用过程作用过程当引物与当引物与DNADNA母链通过碱基互补配对结合母链通过碱基互补配对结合后，后， DNADNA聚合酶就能从引物的聚合酶就能从引物的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链，链， DNADNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的55端端向向33端延伸。端延伸。高温解决了打开双链的问题，高温解决了打开双链的问题，但又导致但又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高聚合酶失活的问题，耐高温的温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致聚合酶解决了高温导致DNA聚聚合酶失活，促成了合酶失活，促成了PCR技术的自动化。技术的自动化。6 6、 Taq
13、DNA聚合酶的应用聚合酶的应用7 7、 缓冲液需要为缓冲液需要为PCRPCR反应提供的物质反应提供的物质DNA模板，分别与两条模板链相结合的模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚聚合酶存在于缓冲液中，同时通过控制温度使合酶存在于缓冲液中，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。复制在体外反复进行。PCR技术是技术是80年代中期发展起来的体外年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、它具有特异、敏感、产率高、快速、快速、 简便、重复性好、易自动化等特性。简便、重复性好、易自动化等特性。 8、
14、PCR技术的特点技术的特点五、五、 PCR的反应过程的反应过程1、PCR的反应步骤的反应步骤PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤为三个基本步骤变性、复性和延伸变性、复性和延伸变性（模板变性（模板DNA解旋）解旋）模板模板DNA经加热至经加热至900C以上。一定时间后，使模以上。一定时间后，使模板板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA解离，使成解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。2、循环过程、循环过程靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列P
15、CR 循环第一步：高温变性循环第一步：高温变性复性（退火）复性（退火） 低温复性低温复性模板模板DNA经加热变性成单链后，温度降经加热变性成单链后，温度降到到500C左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互补序单链的互补序列配对结合。列配对结合。靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物 引物引物 5 53 35 55 53 35 53 33 3PCR PCR 循环第二步循环第二步 ：引物与靶序列退火：引物与靶序列退火延伸延伸 中温延伸中温延伸DNA模板引物结合物在模板引物结合物在Taq DNA聚合聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对
16、的原则与半保留复制模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的的原理，合成一条新的DNA链。链。靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物引物引物引物引物5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 Taq DNATaq DNATaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶PCR PCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸：引物延伸靶序列靶序列靶序列靶序列 靶序列靶序列靶序列靶序列第第1 1个个PCRPCR循环完成后循环完成后 ：得到两个靶序列：得到两个靶序列循环次数循环次
17、数DNADNA数量数量122438201,048,576301,073,741,8243 3、3030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量六、六、 PCR 的实验操作的实验操作1 1、PCRPCR仪仪（一）设备及用具（一）设备及用具实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器的仪器2 2、微量离心管、微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为0.5ml0.5ml3 3、微量移液器、微量移液器用于定量转移用于定量转移PCRPCR配方中的液体，其上的配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次一次性吸液枪头用一次更换一次PCR仪仪微量离心管微量离心管一
18、一 次次 性性吸液枪头吸液枪头调节轮调节轮卸枪头按钮卸枪头按钮推动按钮推动按钮卸枪头器卸枪头器微量移液器微量移液器（二）实验操作步骤（二）实验操作步骤（一）理论上（一）理论上DNA扩增数目的计算扩增数目的计算七、七、课题成果评价课题成果评价1 、一条一条DNA，复制，复制n次，次， DNA为为2n2 、 a条条DNA，复制，复制n次，次， DNA为为a x2n（二）实验中（二）实验中DNA含量的测定原理含量的测定原理可以通过计算可以通过计算DNA含量来评价扩增的效含量来评价扩增的效果，果，DNA在在260nm的紫外线波段有一强烈的的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。的含量有关。光光吸吸收收波长波长nm2602402202800.10.2
