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1、第三章 酶学（Chemistry of Enzyme）酶学三重要酶类及其活性调节（一）酶活性的调节方式（一）酶活性的调节方式2、通过改变细胞内已有的酶分子的活性来调、通过改变细胞内已有的酶分子的活性来调节酶的活性节酶的活性1、通过改变酶的数量和分布来调节酶的活性、通过改变酶的数量和分布来调节酶的活性（1）改变酶的结构（别构调节、可逆的共价修饰）改变酶的结构（别构调节、可逆的共价修饰调节、酶原激活等）调节、酶原激活等）（2）通过直接影响酶与底物的相互作用来调节酶）通过直接影响酶与底物的相互作用来调节酶的活性（竞争性抑制剂等）的活性（竞争性抑制剂等）八、酶活性的调节八、酶活性的调节酶学三重要酶类及
2、其活性调节1、定义：、定义：（二）酶的别构调控（二）酶的别构调控 酶的调节部位可以与某些化合物可逆地非共酶的调节部位可以与某些化合物可逆地非共价结合，使酶发生结构的变化，进而改变酶的价结合，使酶发生结构的变化，进而改变酶的催化活性，这种酶活性的调节方式称为酶的别催化活性，这种酶活性的调节方式称为酶的别构调节构调节酶学三重要酶类及其活性调节（二）酶的别构调控（二）酶的别构调控2、变构酶（别构酶）及别构调节、变构酶（别构酶）及别构调节1）变构酶（别构酶）变构酶（别构酶） 有有些些酶酶可可以以与与某某些些化化合合物物（称称为为变变构构剂剂）发发生生非非共共价价结结合合，引引起起酶酶分分子子构构象象的
3、的改改变变，对对酶酶起起到到激活或抑制的作用，这类酶通常称为别构酶激活或抑制的作用，这类酶通常称为别构酶。酶学三重要酶类及其活性调节（1 1）常为多个亚基构成的寡聚体；）常为多个亚基构成的寡聚体；（2 2）具有别构效应；）具有别构效应；（3 3）动力学曲线）动力学曲线不符合米氏方程双曲线；不符合米氏方程双曲线；（4 4）酶分子上含两个中心或部位：活性中心）酶分子上含两个中心或部位：活性中心 （活性部位）和别构中心（别构部位）。（活性部位）和别构中心（别构部位）。 注：变构中心不是酶活性中心的组成部分。注：变构中心不是酶活性中心的组成部分。1963年，年，Monod等首次提出别构酶的概念。等首次
4、提出别构酶的概念。他认为别构酶应具备以下特征：他认为别构酶应具备以下特征：酶学三重要酶类及其活性调节酶的别构（变构）效应示意图酶的别构（变构）效应示意图效应剂效应剂别别构构中中心心活性活性中心中心酶学三重要酶类及其活性调节（1）调调节节物物：也也称称效效应应物物，对对酶酶分分子子具具有有别别构构调调节节作作用用的的化化合合物物。一一般般是是酶酶的的底底物物或或底底物物类类似似物物或或代代谢谢的的终终产产物物。结结合合在在酶酶的的别别构构中中心心，负负责责调调节节酶酶促促反反应的速度应的速度。（2）正正效效应应物物：指指效效应应物物的的结结合合使使酶酶活活性性升升高高，也也称称别构激活剂。别构激
5、活剂。 （3）负负效效应应物物: 指指效效应应物物的的结结合合使使酶酶活活性性降降低低，也也称称别构抑制剂。别构抑制剂。 相关概念相关概念酶学三重要酶类及其活性调节同促效应同促效应：配体相同，当一个效应物与酶结合后，配体相同，当一个效应物与酶结合后，影响另一相同的效应物与酶的另一部位结合。影响另一相同的效应物与酶的另一部位结合。 异促效应异促效应：配体不同，当一个效应物与酶结合后，配体不同，当一个效应物与酶结合后，影响另一不同效应物与酶另一部分结合。影响另一不同效应物与酶另一部分结合。2）协同效应（）协同效应（cooperative effect）协同效应协同效应：一个效应物分子与变构酶的变构
6、中心：一个效应物分子与变构酶的变构中心结合，对第二个效应物分子的结合产生影响，称结合，对第二个效应物分子的结合产生影响，称协同效应协同效应酶学三重要酶类及其活性调节 正协同效应正协同效应：指效应物分子与变构酶结合后，指效应物分子与变构酶结合后，本身构象发生变化，本身构象发生变化，有利于有利于后续底物分子或调节物后续底物分子或调节物分子的结合。分子的结合。 负协同效应负协同效应：指效应物分子与变构酶的结合后，指效应物分子与变构酶的结合后，本身构象发生变化，本身构象发生变化，不利于不利于后续底物分子或调节物后续底物分子或调节物分子的结合。分子的结合。酶学三重要酶类及其活性调节正、负协同效应别构酶与
7、米氏酶动力学比较正、负协同效应别构酶与米氏酶动力学比较 酶学三重要酶类及其活性调节别构酶调节的两种模型别构酶调节的两种模型SS SS SSSSSSSSSS亚基全部亚基全部处于处于R型型亚基全部亚基全部处于处于T型型依次序变化依次序变化序变模型（序变模型（KNF）：）：1966年由年由Koshland、Nemethy和和Filmer 提出提出酶学三重要酶类及其活性调节齐变模型（齐变模型（MWC）：）： 1965年由年由Monod、Wyman和和Changeux提出。提出。 S SSSS SSS SST状态（对称亚基）状态（对称亚基）R状态（对称亚基）状态（对称亚基）SSSS对称亚基对称亚基对称亚
8、基对称亚基齐步变化齐步变化酶学三重要酶类及其活性调节（三）可逆的共价修饰调节（三）可逆的共价修饰调节共价修饰共价修饰(covalent modification)在在其其他他酶酶的的催催化化作作用用下下，某某些些酶酶蛋蛋白白肽肽链链上上的的一一些些基基团团可可与与某某种种化化学学基基团团发发生生可可逆逆的的共共价价结结合合，从而，从而改变酶的活性改变酶的活性，此过程称为共价修饰。，此过程称为共价修饰。 常见类型：常见类型：磷酸化与脱磷酸化（最常见）磷酸化与脱磷酸化（最常见） 乙酰化和脱乙酰化乙酰化和脱乙酰化 甲基化和脱甲基化甲基化和脱甲基化 腺苷化和脱腺苷化腺苷化和脱腺苷化 -SH与与-S-S
9、互变互变酶学三重要酶类及其活性调节酶学三重要酶类及其活性调节酶学三重要酶类及其活性调节（四）酶原及酶原激活（四）酶原及酶原激活n酶原酶原(zymogen)：有些酶（如消化系统中的各种有些酶（如消化系统中的各种蛋白酶）以无活性的前体形式合成和分泌，然后蛋白酶）以无活性的前体形式合成和分泌，然后输送到特定部位；当功能需要时，经特异性蛋白输送到特定部位；当功能需要时，经特异性蛋白酶的作用转变为有活性的酶而发挥作用。这些不酶的作用转变为有活性的酶而发挥作用。这些不具有催化活性的酶的前体具有催化活性的酶的前体(precursor)称为酶原。称为酶原。n酶原的激活：酶原的激活：某种物质作用于酶原使之转变为
10、有某种物质作用于酶原使之转变为有活性的酶的过程称为酶原的激活。活性的酶的过程称为酶原的激活。酶学三重要酶类及其活性调节n酶原激活的机理酶原激活的机理酶酶 原原分子构象发生改变分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心形成或暴露出酶的活性中心 一个或几个特定的肽键断裂，水解一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽掉一个或几个短肽在特定条件下在特定条件下酶学三重要酶类及其活性调节赖赖缬缬天天天天天天天天甘甘异异赖赖缬缬天天天天天天天天缬缬组组丝丝S SS SS SS S464618183 3甘甘异异缬缬组组丝丝S SS SS SS S肠激酶肠激酶胰蛋白酶胰蛋白酶活性中心活性中心胰蛋白酶原的激活
11、过程胰蛋白酶原的激活过程酶学三重要酶类及其活性调节n 酶原激活的生理意义酶原激活的生理意义避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。体内代谢正常进行。有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。化作用。酶学三重要酶类及其活性调节切赫（切赫（Cech）奥尔特曼（奥尔特曼（Altman）1982年美国年美国 Cech和和Altman发现四膜虫的发现四膜虫的r
12、RNA前体能在完前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，证明全没有蛋白质的情况下进行自我加工，证明RNA具有催化活具有催化活性，性，因此共获因此共获1989年度诺贝尔化学奖年度诺贝尔化学奖。九、核酶、抗体酶与同工酶九、核酶、抗体酶与同工酶（一）核酶（一）核酶酶学三重要酶类及其活性调节随后的研究表明：随后的研究表明： L19RNA具备酶促催化的几个特征：具备酶促催化的几个特征： 高度的底物专一性高度的底物专一性 遵循遵循Michaelis-Menten动力学动力学 对竞争性抑制剂的敏感性对竞争性抑制剂的敏感性酶学三重要酶类及其活性调节 (2) 1992年，年，Piccirilli等发现等发现
13、L19RNA具有氨具有氨酰酯酶的活性，催化氨酰酯水解。酰酯酶的活性，催化氨酰酯水解。 (3) L19RNA还有限制性内切酶作用：还有限制性内切酶作用： -CpUpCpUpN- + G -CpUpCpU +GpN 酶学三重要酶类及其活性调节 (4) 1997年，年，Zhang和和Cech用人造的用人造的RNA分子分子催化合成了肽链，表明催化合成了肽链，表明RNA具有肽基转移酶活性。具有肽基转移酶活性。 (5) 原核生物原核生物RNaseP和和 兔肌兔肌1，4- - -葡聚糖分枝酶葡聚糖分枝酶均包括均包括RNA+蛋白组分，蛋白组分，起催化作用的都是起催化作用的都是RNA。酶学三重要酶类及其活性调节
14、n核酶的发现与研究证明核酶的发现与研究证明RNA也可以是酶，即酶不也可以是酶，即酶不都是蛋白质都是蛋白质，而且有重要的理论与实践意义。，而且有重要的理论与实践意义。n核酶的发现证明了核酶的发现证明了RNA既能够携带遗传信息既能够携带遗传信息，又又具有生物催化功能具有生物催化功能。n对核酶结构和作用机制的研究可帮助人们对核酶结构和作用机制的研究可帮助人们设计生设计生物体内本不存在的酶物体内本不存在的酶，作为工具去催化特定的反，作为工具去催化特定的反应。应。核酶发现的意义核酶发现的意义酶学三重要酶类及其活性调节RNA既能携带遗传信息既能携带遗传信息 又有生物催化功能。又有生物催化功能。RNA可能早
15、于蛋白质和可能早于蛋白质和DNA， 是生命起源中首先出现的生物大分子是生命起源中首先出现的生物大分子 切割癌基因、致病病毒基因切割癌基因、致病病毒基因（三）核酶的研究意义与应用前景（三）核酶的研究意义与应用前景酶学三重要酶类及其活性调节九、核酶、抗体酶与同工酶九、核酶、抗体酶与同工酶（一）核酶（一）核酶九、核酶、抗体酶与同工酶九、核酶、抗体酶与同工酶（二）抗体酶（二）抗体酶1986年年Schultz和和Lerner等人研制成工抗体酶等人研制成工抗体酶（abzyme），这一研究成果对酶学研究具有重），这一研究成果对酶学研究具有重要的理论意义和广泛的应用前景。要的理论意义和广泛的应用前景。抗体酶（
16、抗体酶（abzyme）：）：是具有催化能力的免疫球是具有催化能力的免疫球蛋白，又称为催化性抗体。蛋白，又称为催化性抗体。酶学三重要酶类及其活性调节（三）同工酶（三）同工酶定义：定义：指能指能催化相同的化学反应，催化相同的化学反应，但酶本身的但酶本身的分分子结构组成、理化性质、免疫功能子结构组成、理化性质、免疫功能和和调控特调控特性性等方面有所不同的一组酶。等方面有所不同的一组酶。在同一种属中由不同基因或等位基因编码在同一种属中由不同基因或等位基因编码的多肽链组成的单体、纯聚体或杂交体。的多肽链组成的单体、纯聚体或杂交体。酶学三重要酶类及其活性调节H HH HH HH HH HH HH H MM
17、H HH HMMMMH HMMMMMMMMMMMMMMLDH1 (H4)LDH2(H3M) LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5 (M4)乳酸脱氢酶的同工酶乳酸脱氢酶的同工酶* 举例：举例：乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH1 LDH5)同工酶的概念在同工酶的概念在1959年由年由Marker和和Moller提提出，他们发现的同工酶是出，他们发现的同工酶是乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LD）由两种亚基组成的四聚体：由两种亚基组成的四聚体：H（heart）型和）型和M（muscle）型）型酶学三重要酶类及其活性调节乳酸脱氢酶同工酶形成示意图乳酸脱氢酶同工酶形成示意图多肽多肽亚基亚基mRNA四聚体四
18、聚体结构基因结构基因a b乳酸脱氢酶同乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱工酶电泳图谱+H4MH3M2H2M3HM4点样线点样线HM酶学三重要酶类及其活性调节 存在于存在于同一个体的不同组织中，同一个体的不同组织中，也存在于也存在于同同一组织、同一细胞的不同亚细胞结构中，甚至存一组织、同一细胞的不同亚细胞结构中，甚至存在于不同发育时期的组织中。在于不同发育时期的组织中。n是细胞分化及形态遗传的分子学基础研究的有力工具；是细胞分化及形态遗传的分子学基础研究的有力工具；n在代谢调控中也起重要作用；在代谢调控中也起重要作用；n作为疾病诊断的指标。如乳酸脱氢酶（作为疾病诊断的指标。如乳酸脱氢酶（LDH）同工酶的应
19、用同工酶的应用酶学三重要酶类及其活性调节乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱五种五种LD在不同器官中的含量比较在不同器官中的含量比较酶学三重要酶类及其活性调节LDH同工酶谱分析的临床意义：同工酶谱分析的临床意义：LDH1：染色斑点大而深：染色斑点大而深帮助诊断帮助诊断心肌梗塞心肌梗塞LDH5：染色斑点大而深：染色斑点大而深帮助诊断帮助诊断肝癌肝癌酶学三重要酶类及其活性调节（一）酶分离纯化的一般原则（一）酶分离纯化的一般原则与蛋白质相似与蛋白质相似n1、选材：、选材：新鲜，含酶量高新鲜，含酶量高n2、破碎细胞、破碎细胞：因材而已：因材而已n3、抽提：、抽提：低温，水或低盐溶液低温，水
20、或低盐溶液n4、分离纯化：、分离纯化：粗分级及细分级粗分级及细分级n5、保存：、保存：低温低温十、酶的研究方法与酶工程十、酶的研究方法与酶工程酶学三重要酶类及其活性调节1、酶活力（、酶活力（enzyme activity, 也称酶活性）也称酶活性） （二）酶活力的测定方法（二）酶活力的测定方法 指酶催化一定化学反应的能力，用在一定条件指酶催化一定化学反应的能力，用在一定条件下酶所催化反应的下酶所催化反应的反应速度反应速度来表示。来表示。2、酶活力单位（、酶活力单位（activit unit） 酶活力的大小用酶活力的大小用酶活力单位酶活力单位来表示，简称来表示，简称酶单酶单位（位（unit, U
21、），），就是表示酶量多少的单位。其表示就是表示酶量多少的单位。其表示方法与所用的测定方法有关。方法与所用的测定方法有关。 酶学三重要酶类及其活性调节酶活力单位的表示方法酶活力单位的表示方法 国际单位国际单位(IU)：1961年年 在最适条件下，在最适条件下，每分钟每分钟催化催化1mol底物转化为底物转化为产物所需的酶量为一个国际单位。产物所需的酶量为一个国际单位。 催量单位催量单位(katal)：1972年年 指在最适条件下，指在最适条件下，每秒钟每秒钟使使mol底物转化为底物转化为产物所需的酶量为产物所需的酶量为1Kat单位。单位。 崔量单位与国际单位之间的关系：崔量单位与国际单位之间的关系
22、：1Kat6107IU ，可以用纳可以用纳Kat、微、微Kat来进行换算。来进行换算。酶学三重要酶类及其活性调节3、酶的比活力、酶的比活力(specific activity，也称比活性，也称比活性) 比活力：比活力：指指每每mg酶蛋白酶蛋白所具有的酶活力单位数，所具有的酶活力单位数，一般用一般用U/mg蛋白质蛋白质来表示。来表示。 比活力有时也可用每比活力有时也可用每g或每或每ml酶制剂含多少个酶制剂含多少个活力单位来表示。活力单位来表示。 比活力总活力单位数比活力总活力单位数蛋白质总毫克数蛋白质总毫克数 活力单位数活力单位数mg蛋白质蛋白质 (杂蛋白杂蛋白:包括酶蛋白及含非酶蛋白）包括酶蛋
23、白及含非酶蛋白） 比活力是衡量酶纯度的重要指标之一比活力是衡量酶纯度的重要指标之一酶学三重要酶类及其活性调节4、测定酶活力时应注意几点、测定酶活力时应注意几点 （1）应测反应的初速度）应测反应的初速度（2）酶的反应速度一般用）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增加量单位时间内产物的增加量来来表示。表示。 （3）测酶活力时应使）测酶活力时应使反应温度、反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。素保持恒定。 （4）测定酶反应速度时，应）测定酶反应速度时，应使使SE。 产产物物浓浓度度P(t)酶学三重要酶类及其活性调节5、测定酶活力的一般方法、测定酶活力的一般方法 分
24、光光度法分光光度法 荧光法荧光法 酶偶联分析法酶偶联分析法酶学三重要酶类及其活性调节（1）分光光度法（）分光光度法（spectrophotometry） 该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。分光吸收不同。 如氧化还原酶类。如氧化还原酶类。简便、迅速、准确简便、迅速、准确 一个样品可多次测定，有利于动力学研究一个样品可多次测定，有利于动力学研究 可检测到可检测到10-9mol/L水平的变化。水平的变化。 优点：优点：酶学三重要酶类及其活性调节（2）荧光法（）荧光法（fluorometry）放射测量法放射测量法 该法要求酶反应的底物或产物有荧光
25、变化。该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。 主要优点：主要优点：灵敏度高，可以检测灵敏度高，可以检测10-12mol/L的样品的样品 酶蛋白分子中的酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe残基以及一残基以及一些辅酶、辅基，如些辅酶、辅基，如NADH NADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。等都能发出荧光。 例：乙醇例：乙醇 + NAD+ 乙醛乙醛 + NADH + H+ 乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶酶学三重要酶类及其活性调节（3）酶偶联分析法）酶偶联分析法(enzyme coupling assay) 第一个酶的产物为第二个酶的底物，这第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一起反应。两个酶系统
26、在一起反应。 P1无光吸收或荧光变化，偶联后无光吸收或荧光变化，偶联后, P2有光有光吸收或荧光变化。吸收或荧光变化。酶学三重要酶类及其活性调节酶的纯度鉴定：酶的纯度鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法等电聚焦电泳法等电聚焦电泳法酶学三重要酶类及其活性调节 酶工程（酶工程（enzyme engineering）：是研究酶的生）：是研究酶的生产和应用的一门技术性学科，是把酶学到基本产和应用的一门技术性学科，是把酶学到基本原理、化学工程技术及基因重组技术有机结合原理、化学工程技术及基因重组技术有机结合在一起而形成的新型应用技术。在一起而形成的新型应用技术。（三）酶工程（主要自学）（三）酶
27、工程（主要自学）化学酶工程化学酶工程生物酶工程生物酶工程酶学三重要酶类及其活性调节三、酶工程酶工程：指酶制剂在工业上的大规模生产和应用。1、化学酶工程： 由酶学与化学工程技术相结合而形成。 通过化学修饰、固定化处理、甚至化学 合成法等手段改善酶的性质，以提高催 化效率及降低成本。五、酶学发展及动向五、酶学发展及动向酶学三重要酶类及其活性调节2、生物酶工程： 是在化学酶工程基础上发展起来的，是以酶学和DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。包括：1）用DNA重组技术大量生产酶；2）对酶基因进行修饰，产生突变酶；3）设计新的酶基因，合成自然界不曾有过的、性能稳定、催化效率更高的新酶。五
28、、酶学发展及动向五、酶学发展及动向酶学三重要酶类及其活性调节酶与某些疾病发生的关系酶与某些疾病发生的关系酶学三重要酶类及其活性调节皮肤乳白色，毛发淡皮肤乳白色，毛发淡黄或银白色，瞳孔淡黄或银白色，瞳孔淡红，虹膜淡灰或淡红，红，虹膜淡灰或淡红，半透明视网膜缺乏色半透明视网膜缺乏色素。素。酪氨酸酶酪氨酸酶缺陷缺陷白化病白化病酶学三重要酶类及其活性调节智力低下，智力低下，60%60%患儿患儿有脑电图异常，头发有脑电图异常，头发细黄，皮肤色淡和虹细黄，皮肤色淡和虹膜淡黄色，惊厥，尿膜淡黄色，惊厥，尿有有“发霉发霉”臭味或鼠臭味或鼠尿味。尿味。苯丙氨酸羟化酶苯丙氨酸羟化酶缺陷缺陷苯丙酮酸尿症苯丙酮酸尿症酶学三重要酶类及其活性调节胱硫醚合成酶胱硫醚合成酶缺陷缺陷同型胱氨酸尿症同型胱氨酸尿症多发性血栓形成，晶多发性血栓形成，晶体脱位，身体瘦长，体脱位，身体瘦长，蜘蛛样指（趾），轻蜘蛛样指（趾），轻中度智力低下中度智力低下酶学三重要酶类及其活性调节酶学三重要酶类及其活性调节
