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1、基因芯片的制造及其应用基因芯片的制造及其应用夏咏梅2008.11.03篓部座椭痞咒鳃秋昌堤挺氛瞬邪祖挥精弃绎早佣床禁贞哲墒骏牌有赎墩顷生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用0811141.基本概念回顾基本概念回顾2.基因芯片的制备技术基因芯片的制备技术3.基因芯片的应用基因芯片的应用我是不听她上化学课的，你们看着办吧！葵毁溉州拇遂办翅钝疟裴汾见国滇客笺吨矾清半吻呛谭邵梢智镶相还叮念生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用0811141.基本概念回顾基本概念回顾justforchemistrypeople核酸包括DNA和RNA两大类。DNA核苷酸中的嘌呤碱(pu
2、rine)主要是鸟嘌呤(guanine,G)和腺嘌呤(adenine,A)，嘧啶碱(pyrimidine)主要是胞嘧啶(cytosine,C)、尿嘧啶(uracil,U)和胸腺嘧啶(thymine,T)。DNA和RNA都含有鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)；胸腺嘧啶(T)一般而言只存在于DNA中，不存在于RNA中；而尿嘧啶(U)只存在于RNA中，不存在于DNA中。嘌呤和嘧啶环中含有共轭双键，对260nm左右波长的紫外光有较强的吸收。碱基的这一特性常被用来对碱基、核苷、核苷酸和核酸进行定性和定量分析。问拘扣状撑菩铡镐工咐叼稻钳猜番抢煽丽鞘靠嗜尽陇麦基怒焦肾沪斩欺丙生物芯片的制造及其应用0
3、81114生物芯片的制造及其应用081114guanineadeninecytosineuracilthyminepurinepyrimidine摧涧召框应里照翔乘辑汕伦别综拥挤拢践锹冠斑卵吭泪瘫椎函唁疯报蠕轴生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114(1)同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同；(2)一种生物DNA碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化而改变；(3)几乎所有的DNA，无论种属来源如何，其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧啶摩尔含量相同(A=T)，鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩尔含量相同(G=C)，总的嘌呤摩尔含量与总的嘧啶摩尔含量相同(AG=CT)；(4)不同
4、生物来源的DNA碱基组成不同，表现在(AT)/(GC)比值的不同。DNA的二级结构的二级结构双螺旋结构双螺旋结构 (double helix model)DNA的半保留复制(semiconservativereplication)Oligonucleotide蟹役羌挫甚虽铆延顺卜鞘茁诵扔陌韦壳付讹箕墟檬趋涟概怕齐柯剐炸俗煌生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114HybridizationTm=69.30.41(%G+C).变性、复性和杂交。粗细线分别代表不同DNA。A是杂化双链;.突变体的鉴别。B代表天然DNA；C是B的缺失突变体；虚线框内是已缺失的部分；D是显示从
5、天然DNA链鼓出小泡;.粗线代表探针，粗线上的X表示放射性标记。核酸杂交及其应用示意图核酸杂交及其应用示意图捅诀柜蜂搞贷怔肝良斟俯准焚晤集缀剃铣断埋缀罢斌蔚浦士畏螺抚蛙趁昆生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114RNA的结构与功能DNA是遗传信息的载体，遗传信息的作用通常由蛋白质的功能来实现，但DNA并非蛋白质合成的直接模板，合成蛋白质的模板是RNA。正常细胞遗传信息的流向是：反转录作用(reversetranscription)与DNA相比，RNA种类繁多，分子量相对较小，一般以单股链存在，但可以有局部二级结构RNA碱基组成之间无一定的比例关系，且稀有碱基较多。此
6、外，tRNA还具有明确的三级结构。细胞核和胞液线粒体功能核蛋白体RNArRNAmttRNA核蛋白体组成成分信使RNAmRNAmtmRNA蛋白质合成模板转运RNAtRNAmttRNA转运氨基酸不均一核RNAhnRNA成熟mRNA的前体小核RNAsnRNA参与hnRNA的剪接、转运小胞浆RNAscRNA/7SL-RNA蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分注：原核细胞不含后3种RNARNA的分类的分类注：原核细胞不含后3种RNA细胞核和胞液线粒体功能核蛋白体RNArRNAmttRNA核蛋白体组成成分信使RNAmRNAmtmRNA蛋白质合成模板转运RNAtRNAmttRNA转运氨基酸不均一核RN
7、AhnRNA成熟mRNA的前体小核RNAsnRNA参与hnRNA的剪接、转运小胞浆RNAscRNA/7SL-RNA蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分吉勃屁朔娩藐凤蛛拼祭暗诺另宇威纽潘酒峦搞驼材惰淹薛渺羽矮起淑夫孟生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114miRNA和和siRNA的基本介绍及区别的基本介绍及区别siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。SiRNA的形成主要由Dicer和Rde-1(RNAi缺陷基因-1)调控完成。只降解与其序列互补配对的mRNA。MicroRNA（miRNA,微RNA）即为长度为22nt左右的5端带磷酸
8、基团、3端带羟基的非蛋白编码的调控小RNA家族。miRNA广泛存在于真核生物中，不具有开放阅读框架，不编码蛋白质，一般长20-24nt，miRNA的转录产物是发夹状结构，在RNase酶切后以双链形式存在，最后释放互补链，miRNA成熟。成熟的miRNA5端的磷酸基团和3端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA的又一特点基因表达时序性。MiRNA表达的时序性和组织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。是一类高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三种。人类基因组中大约有255个编码miRNA基因
9、，约占人类基因数的1%，但尚不清楚其功能。最近科学家发现小RNA与epigenetic现象有联系。所谓epigenetic是指并不涉及遗传序列的特征性的遗传改变。有人已试图将小RNA用于抗病毒治疗之用,认为它们有可能抑制HIV21和灰质类病毒丙型肝炎病毒的转录,以及也可能用于肿瘤的治疗。褐琉友郝特邀衍黎冰莱坝钱掇虫庆蜀食习我巨蚜帽前奔他斌镇啼缀朔裂硝生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114miRNA与siRNA的不同点1.根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNAi的中间产物。2.结构上，miRNA是
10、单链RNA，而siRNA是双链RNA。3.Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。4.在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3-UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。5.在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。6.miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性
11、和病毒感染。拯驾腋孜晴具逼讫汝壁侮针莽锻勋附瀑官仪潦忠槐忙素蹄奢掳弹毙峨逞送生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114miRNA Detection and Expression ProfilingWhatarethedifferencesbetweenmiRNAandmRNAmiRNAsaretooshorttoallowthealternativeprobesequenceselectionsmiRNAsdonothavepolyAtailtoinitiatecDNAsynthesismiRNAlabelingrequiresdifferentstrategymi
12、RNAsshortlengthsgivemoredispersedhybridizationaffinityandthussignalstrength脓词尔闯节筛苗既恐苇米雅篓坡罐臼秧缮辗凌鞘获捏始锋姥卧柞瑰吱黎肘生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114Formation of miRNAMicroRNA(miRNA)isendogenousandpresentacrossspecies.PrimarymiRNAtranscripts(Pri-miRNAs)areprocessedbyRNaseIIIenzyme,Drosha,togenerate70to100nu
13、cleotides(nt)hairpinprecursors(Pre-miRNAs).Pre-miRNAsarethenfurtherprocessedbyanotherRNaseIIIenzyme,Dicer,toyieldmature miRNAs,rangingfrom17to24ntinlength.miRNAsareincorporatedintotheRNAinterference(RNAi)effectorcomplex,RISC,andtargetspecificmessengerRNAs(mRNA)fortranslationalrepressionormRNAcleavag
14、e.Therefore,miRNAsplayanimportantroleinregulatinggeneexpression.FromBartel,D.P.MicroRNAs:Genomics,biogenesis,mechanism,andfunction.Cell116,281-297(2004)捍泪大茂叠扭积邑拦断桂私嗅返郝绢觅染命肪焊捐柞矢夷十翘氯莫胰斯雨生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114PCR飞规谜建鬃韧动策着纵腻枫赂眼刑尿舱峰末赘颓泻挂秩稀侮翼咨河环豌灰生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114核酸杂交核酸杂交是从核酸分
15、子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链核酸在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹杂交（Southernblothybridization）和RNA印迹杂交（Northernblothybridization）。其基本过程包括下列几个步骤。（1）制备样品：首先从待检测组织提取DNA或RNA。DNA应先用限制性内切酶消化以产生特定长度的片段，然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。一般来说DNA分子有其独特的限制性内切酶图谱，所以经酶
16、切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带。再将含有DNA片段的凝胶进行变性处理后，直接转印到支持膜上并使其牢固结合。这样等检测片段在凝胶上的位置就直接反映在了转印在膜上。RNA样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印并交联固定。（2）制备探针：探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。（3）杂交：先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，所以杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针
17、分子即可。（4）检测：检测的方法依标记探针的方法而异。用放射性同位素标记的探针需要用放射自显影来检测其在膜上的位置；而如果是用生物素等标记的探针则需要用相应的免疫组织化学的方法进行检测。基因诊断的方法基因诊断的方法与疾病相关的遗传背景改变主要有两类，一是遗传物质，即DNA或RNA的水平变化。二是遗传物质的结构变化，即基因突变，如点突变引起的基因失活，及染色体转位引起的基因激活或灭活等等。所以理论上说检测基因水平或结构的方法都应可用于基因诊断。咳算怀嚣挪菊巨炒肺疽裔烙嫉追盏矩刷健满敞锤勉榨把臃隅渺遭桩括冈准生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114组织中总RNA的提取利
18、用反转录酶合成cDNAPCR反应：反应液组织：反应缓冲液模板（上述合成的cDNA）底物（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）引物（例如某种病毒特异性引物）TaqDNA聚合酶循环：95，30sec（变性）55，1min（退火）30ormore循环72，1min（聚合）检测：电泳或核酸杂交PCR用于病毒感染的基因诊断用于病毒感染的基因诊断在优化的条件下，核酸杂交可检测到pg水平的靶分子，约相当于106个分子。但是在许多临床情况下，无法得到这样的样品量。用PCR来特异性地增加靶分子量，提高敏感性。田喊贰鉴雪往踩痪延虹泥奶辑转晤诬狱页荣痹轰绵囊脐先显侈扭茧谣俺罚生物芯片的制造及其应用081114生
19、物芯片的制造及其应用0811142. 基因芯片的制备技术基因芯片的制备技术里荆讶持涸膏辊码典文懂葵份茂空苔铡险治颅臣螺晨瓣盘拿丝富屡殉狰封生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114生物芯片技术通过微加工工艺在厘米见方的芯片上集成有成千上万个与生命相关的信息分子，它可以对生命科学与医学中的各种生物化学反应过程进行集成，从而实现对基因、配体、抗原等生物活性物质进行高效快捷的测试和分析。生物芯片由于采用了微电子学的并行处理和高密度集成的概念，因此具有高效、高信息量等突出优点。生物芯片的设想最早起始于80年代中期，90年代美国Affymetrix公司实现了DNA探针分子的高密
20、度集成，即将特定序列的寡核苷酸片段以很高的密度有序地固定在一块玻璃、硅等固体片基上，作为核酸信息的载体，通过与样品的杂交反应获取其核酸序列信息。Affymetrix公司生物芯片的市场占有率超过50%。2002年,Nimblegen公司、Xeotron开始提供光引发原位合成微点阵（microarray）芯片。Xeotron公司，微流体(microfluidicarray)芯片;2004年，Atantic、LC-Science;2006年，LC-Bio;2008年，LC-Genetics。询偷傣堰痕简舒域射洒擦扣行粗筛府撮续顷受绅触袄蠕狞频脊赏潍磊泄阿生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制
21、造及其应用081114按用途分可分为检测芯片和反应芯片；其形式主要为微点阵芯片。仅就目前的发展情况，微点阵芯片主要包括DNA微点阵芯片（又称基因芯片或DNA芯片）、蛋白或多肽微点阵芯片和组织芯片。基于其它生物大分子特异性相互作用的生物芯片也会相继问世。组织芯片不能用原位合成的方法制作。所谓DNA微点阵芯片是指同时将大量的探针分子固定到固相支持物上，借助核酸分子杂交配对的特异性对DNA样品的序列信息进行高效率的解读和分析，以用于基因表达谱的检测、突变筛查、DNA多肽性分析、DNA测序和基因组文库作图等研究。已有多种方法可以将寡核苷酸固定到固相支持物上。这些方法总体上分为两种：原位合成(insit
22、usynthesis)与合成后以微量点样技术点样。可用许多先进的固定技术进行制备同时也可实现自动化生产。都适于以玻片为支持物的芯片制作但有各自的优缺点。原位合成的具体方案有光引导原位合成(light-directedinsitusynthesis)、压电打印原位合成以及分子印章技术等。微点阵生物芯片的制作方法微点阵生物芯片的制作方法 蜡熙喳吼秉淮估峭优策她旭蠢段睛心些沈倾杏体读稚股涅倘仿缴锦献想慢生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114点样法在多聚物的设计方面与原位合成技术相似。只是合成工作用传统的DNA、多肽合成仪或PCR扩增或体内克隆等方法完成。大量制备好的核酸
23、探针、多肽、蛋白等生物大分子再用特殊的自动化微量点样装置将其以较高密度互不干扰地印点于经过特殊处理的玻片、尼龙膜、硝酸纤维素膜上，并使其与支持物牢固结合。支持物需预先经过特殊处理，例如多聚赖氨酸或氨基硅烷等。亦可用其它共价结合的方法将这些生物大分子牢牢地附着于支持物上。现在已经有比较成型的点样装置出售，例如美国Biodot公司的“喷印”仪以及CartesianTechnologies公司的Pix-SysNQ/PA系列“打印”仪。这些自动化仪器依据所配备的“打印”或“喷印”针将生物大分子从多孔板吸出直接“打印”或“喷印”于芯片片基上(Fig2)。“打印”时针头与芯片片基表面发生接触而“喷印”时针
24、头与片基表面保持一定的距离。所以“打印”仪适宜制作较高密度的微阵列（例如2500点/cm2），“喷印”法由于“喷印”的斑点较大，所以只能形成较低密度的探针阵列，通常400点/cm2。点样法制作芯片的工艺比较简单便于掌握、分析设备易于获取，适宜用户按照自己的需要灵活机动地设计微点阵，用于科研和实践工作。点样法点样法拳蛀厦组怒烽拐矛蜕谷柯莆剁展悸糯络炽齿袍莱胶寸末牡搬隋悍峭啸铃谋生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114分子印章技术与上述两种方法在合成原理上相同，区别仅在于该技术利用预先制作的印章将特定的合成试剂以印章印刷的方式分配到支持物的特定区域。后续反应步骤类似与压
25、电打印原位合成技术。分子印章类似于传统的印章，其表面依照阵列合成的要求制作成凹凸不平的平面，依此将不同的核酸或多肽合成试剂按印到芯片片基特定位点进而进行合成反应。选择适当的合成顺序、设计凹凸位点不同的印章即可在支持物上原位合成出位置和序列预定的寡核苷酸或寡肽阵列。从这一点上讲，分子印章原位合成技术与压电打印原位合成技术更为相似。分子印章除了可用于原位合成外还可以点样方式制作微点阵芯片。例如已有人将分子印章技术用于蛋白微点阵芯片的制作。以上三种原位合成技术所依据的固相合成原理相似，只是在合成前体试剂定位方面采取了不同的解决办法，并由此导致了许多细节上的差异。但三种方法合成时都必需解决的问题是必需
26、确保不同聚合反应之间的精确定位，这一点对合成高密度寡核苷酸或多肽阵列尤为重要。同时，由于原位合成每步合成产率的局限较长(50nt)的寡核苷酸或寡肽序列很难用这种方法合成。但是，由于原位合成的短核酸探针阵列具有密度高、杂交速度快、效率高等优点，而且杂交效率受错配碱基的影响很明显，所以原位合成的DNA微点阵适合于进行突变检测、多态性分析、表达谱检测、杂交测序等需要大量探针和高的杂交严谨性的实验。分子印章原位合成分子印章原位合成况叫搀迭愁村杉崭纶暇哭豪犊蔚星耕厢米狠齿蹿棱靴瓤啄膀兰喷伞芥戴哆生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114打印原位合成打印原位合成 压电打印原位合成
27、的方式类似于喷墨打印机，合成原理与传统的核酸或寡肽固相合成技术相同。合成过程为：合成前以与光引导原位合成类似的方式对芯片片基进行预处理，使其带有反应活性基团，例如伯氨基。同时，将合成用前体分子（DNA合成碱基、cDNA和其它分子）放入打印墨盒内，由电脑依据预定的程序在xyz方向自动控制打印喷头在芯片支持物上移动，并根据芯片不同位点探针序列需要将特定的碱基合成前体试剂（不足纳升）喷印到特定位点。喷印上去的试剂即以固相合成原理与该处支持物发生偶联反应。由于脱保护方式为酸去保护，所以每步延伸的合成产率可以高达99%，合成的探针长度可以达到4050nt。以后每轮偶联反应依据同样的方式将需要连接的分子喷
28、印到预定位点进行后续的偶联反应。类似地重复此操作可以在特定位点按照每个位点预定的序列合成出大量的寡核苷酸探针。庙拘掣帽釉僳淋杭蔓墓捶飞屹谓泣蛾基颇低逾杜酋泌弹墓窍批畏萨赏貌撒生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114目前，除了Affymetrix公司、Xeotron及Nimblegen等个别公司使用原位合成技术制造芯片外，大多中小型公司普遍采用点样技术制作生物芯片。Fig2.Printingdeviceandthetips.三嘉玛报在俺盎酒癸桐斤腻民帝盐封税虱粒涉辐熄抬讣称匈灼谚伦百势谷生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114原位合成具有合
29、成速度快、相对成本低、便于规模化生产等优点。照相平板印刷技术是平板印刷技术与DNA和多肽固相化学合成技术相结合的产物，可以在预设位点按照预定的序列方便快捷地合成大量寡核苷酸。Affymetrix公司运用该技术制造大规模集成的基因芯片。原位合成后的寡核苷酸或多肽分子与玻片共价连接。它用预先制作的蔽光板和经过修饰的4种碱基，通过光进行活化从而以固相方式合成微点阵。合成前，预先将玻片氨基化，并用光不稳定保护剂将活化的氨基保护起来。聚合用单体分子一端活化另一端受光敏保护剂的保护。选择适当的挡光板（mask）使需要聚合的部位透光，不需要发生聚合的位点蔽光。这样，光通过挡光板照射到支持物上，受光部分的氨基
30、解保护，从而与单体分子发生偶联反应。每次反应在成千上万个位点上添加一个特定的碱基。由于发生反应后的部位依然接受保护剂的保护，所以可以通过控制挡光板透光与蔽光图案以及每次参与反应单体分子的种类，就可以实现在特定位点合成大量预定序列寡核苷酸或寡肽的目的。由于每步的合成产率较低（95%），合成30nt的终产率仅为20%，所以该技术只能合成30nt左右长度的寡核苷酸（Fig1）。Michigan大学、Huston大学以及Xeotron公司，将光引导合成技术与半导体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以光不稳定保护的酸作为去保护剂，将每步合成产率提高到98-99%。光引导原位合成光引导原位合成恩刊体映且蛀型俞
31、村秩酒吠纬裴盏亡罕伐报完惭艳棵锐癌娄啸设枉啃复好生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114AffimatrixorNimblegenChips膝誊伙嗓俺撅埔称沁曙吾吵派棘硕丘和永数潜潦槽遂反瑶杂湃泉中仇囊疥生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114ParallelsynthesisofoligonucleotidesParallel synthesis using acid-labile protecting groups. The DNA chain is deprotected in a spatially controlled mann
32、er using photogenerated acid (PGA) (b and d), followed by coupling and oxidation reactions (c and e). This cycle is repeated until the desired lengths and sequences are obtained (f). hv hv hv hv hv hv hv hv 纫迁淑唾承烤赏逆宫烩护硷谊慨渝树郴爱脯譬箍沥苯挛桌扰馆米圭蛤举搪生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114如前所述，Michigan芯片技术同Affymetri
33、x及Nimblegen芯片技术类似，都是采用光引发原位合成技术制造芯片，其合成化学都是用亚磷酰胺偶联-酸脱保护法。其不同点在于，Affymetrix用光不稳定保护剂将待反应碱基的氨基保护起来，用金属mask将不需要反应的碱基位置屏蔽掉光；而Michigan芯片以光不稳定保护的酸作为脱保护剂，用计算机产生的图象作为mask将不需要反应的碱基位置屏蔽掉光。以合成45nt的DNA芯片为例，全合成过程需要约168步偶联反应，即需要168个mask。所以Michigan芯片技术与Affymetrix相比，不仅产率高（如前所述，98%对95%），可以用于制作45nt以上的芯片，而且成本低。光引发原位合成光
34、引发原位合成微流控芯片微流控芯片制作技术制作技术写镁尚蘑鳖峰砧饱骸佳瘪孽晕涎依讫圾敲掀痊窜卯功微啥鞍听消素蜡听碘生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114PGA(deprotection)lightDigitalPhotolithographyDigitalPhotolithographyNHCHCCH2OHONNHO(CH3)3COStandard protecting groupStandard protecting groupBoc-His(H)NHCHCCH2OHONNHOOONO2CH3OPhotolabile protecting groupPhotola
35、bile protecting groupAdifferentmethod:Buildingblocksarenoteasilyavailable.Oligonucleotide SynthesisOligonucleotide SynthesisLCSciencesAffymetrix射凄吭此拆哈瞒捡苞爵舜梗恫吓抽伞矩椿俊揖捍茬固召息厘浴成糜某五郊生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114Microfluidicchip(appearance)Schematic illustration of (a) the structure; and (b) the opera
36、tion of a microfluidic array device. Microreactors(a) (b)Our microfluidic chip with nanochambers撼窿掇厚来狼久署惕逸脚唤弟食咨凯渺谣乳妖织蜗悄抢赵聋葱爵援矣拽寅生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114hn nInletDrainDrainSiSubstrateGlassCoverFluidIndividualsynthesiscontrolledbyaddressablelightilluminationontargetreactorsHighlyminiaturized
37、chip,2cmX2cm4000individualmicroreactors!Need uniform reagent supply Ask for proper design & modeling!DrainInletSi SubstrateGlassCoverFluidChannelBondingSurfaceMicroreactorExternal pressure driven microreactor array made of silicon and glass using standard microfabrication technology Phototype Microf
38、luidic Array泻哉蜜国贼时申惕崩菏笆褒笼滴跃磅混司陇呀轿倍巡涵括幂星彰瑚葱面壁生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114辆尿确执羹忧彩扒娠氖俗毯仅蜀保畴嗣汕坡笋霖傀娜蹋曝猪与宛榷陪谦繁生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114探芽珠啃脐迹锨爷舷莫值莎囤籽宠粹犀择核惨符吵颧峙猫猜稗废梳堵巷理生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114OpticssystemA digital microarray platform consisting of amicroarrayreactor,amicromirrorarr
39、ayimageprojector,acontrollercomputerandanautomatedsynthesizer.娱宇城弧柠匆筷陡威诧新丑铱灿钥凶律溅簧雹舷叼磺滞悟舷顺弦省骤捐潮生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114MICROARRAY REACTORS FOR GENE CHIPSMICROARRAY REACTORS FOR GENE CHIPSO. Srivinnavit, J. M. Rouillard, Y. Xia, Z. Hua, A. Bilge Ozel, S. Mandal, W. H. Lee, B. S. Shim, Y. Mur
40、gha, Erdogan Gulari O. Srivinnavit, J. M. Rouillard, Y. Xia, Z. Hua, A. Bilge Ozel, S. Mandal, W. H. Lee, B. S. Shim, Y. Murgha, Erdogan Gulari University of Michigan- Ann Arbor Department of Chemical Engineering University of Michigan- Ann Arbor Department of Chemical EngineeringDr Xiaochuan Zhou,
41、Xeotron CorporationDr Xiaochuan Zhou, Xeotron CorporationDr Xiaolian Gao, University of HoustonDr Xiaolian Gao, University of HoustonINTRODUCTIONINTRODUCTIONTo date, sequencing the genome has been keeping mankind busy. Now is the time to decipher this sequence information and to relate it to the mec
42、hanisms of the various biological processes. To achieve this, one of the efficient approaches is to build up oligonucleotide arrays that address various sequences for high throughput applications, in areas ranging from medicine to environmental analysis. Our new approach in this field is based on an
43、 in situ photosynthesis platform that uses digital photolithography to activate photogenerated reactions in a microfluidic chip to produce large amounts of DNAs or peptides using inexpensive, conventional DNA/peptide building blocks. This technology enables us to to gain gain control control over ov
44、er each each individual individual reaction reaction at at each each reactive reactive sitesite; to to eliminate eliminate the the usage usage of of photomask-guided photomask-guided photolithographyphotolithography thus, reducing reducing the the cost cost considerablyconsiderably; yet maintaining
45、flexibility flexibility in in design, design, and and feasibility feasibility for for massively massively parallel parallel in in situsitu synthesis synthesis in in our our three-dimensional three-dimensional chambers on microfluidic chipschambers on microfluidic chips . .CONCLUSIONCONCLUSIONMicroar
46、rays have emerged as a useful tool to understand and correlate gene sequences and their related functions; to extend our knowledge to the proteomic level and to utilize it to capture more information. Our technology enables us to manufacture flexible, high-performance and cost effective microarrays
47、of high fidelity, based on our platform that combines massively parallel light-gated in situ synthesis process, digital photolithography and microfluidic technology. Combined with the above technological advantages, OligoArray 2.0, our oligonucleotide design software and OligoArrayDb, our database o
48、f predesigned oligonucleotides, allows expression analysis at the genome scale for any organism for which the genome sequence is known, without relying on cDNA or oligonucleotide libraries.REFERENCES:REFERENCES: 1. Gao X. et al, A Flexible light-directed DNA Chip Synthesis Gated By Deprotection Usin
49、g Solution Photogenerated Acids, Nucleic Acids Research, 29, 4744-4750 (2001).2. Gao X. et al, Oligonucleotide Synthesis Using Solution Photogenerated Acids, Journal of American Chemical Society, 120, 12698-9 (1998).3. Komolpis K. et al, Light-directed Simultaneous of Oligopeptides on Microarray Sub
50、strate Using a Photogenerated Acid, Biotechnology Progress, 18, 641-646 (2002).4. Leproust E. et al, Digital Light-Directed Synthesis: A Microarray Platform That Permits Rapid Reaction Optimization on a Combinatorial Basis, Journal of Combinatorial Chemistry, 2, 349-354 (2000).5. Pellois J. P. et al
51、, Individually Addressable Parallel Peptide Synthesis on Microchips, Nature Biotechnology, 20, 922-926 (2002).6. Rouillard J. M. et al, OligoArray: Genome-Scale Oligonucleotide Design for Microarrays, Bioinformatics, 18, 486-7 (2002).ACKNOWLEDGEMENTS:ACKNOWLEDGEMENTS:DARPA ATOMICHIGAN LIFE SCIENCES
52、CORRIDOR FUND GRANT NO. 1805COLLABORATIONS:COLLABORATIONS:MICHIGAN STATE UNIVERSITYUNIVERSITY OF HOUSTONUNIVERSITY OF MICHIGAN-ANN ARBOR MEDICAL SCHOOLXEOTRON CORPORATION OLIGONUCLEOTIDE DESIGN FOR DNA OLIGONUCLEOTIDE DESIGN FOR DNA MICROARRAYS:MICROARRAYS:A THERMODYNAMIC APPROACHA THERMODYNAMIC APP
53、ROACHOur technology of DNA synthesis on chips combined with the availability of an increasing number of sequenced genomes, have prompted us to implement a software to design specific oligonucleotides for microarrays. Ideally, such oligonucleotides should be totally specific to their respective targe
54、ts to avoid any cross-hybridization and should not form stable secondary structures that may interfere with the labeled probes during hybridization. We have developed OligoArray (Rouillard et al, 2002), a program to design specific oligonucleotides at genome scale. The latest version, OligoArray 2.0
55、 (Rouillard et al. submitted), uses a thermodynamic approach to predict secondary structures and calculate the specificity of a probe on the chips to a unique target in a mixture of labeled targets. PANGENOMIC DATABASE OF OLIGONUCLEOTIDESPANGENOMIC DATABASE OF OLIGONUCLEOTIDESWe have used our OligoA
56、rray 2.0 software to design pangenomic sets of oligonucleotides devoted to gene expression analysis for most of the organisms with a sequenced genome.As of today, we have designed 774,642 oligonucleotides representing 277,976 transcripts from 80 organisms (14 archaea, 59 bacteria and 7 eucaryotes in
57、cluding Homo sapiens and some genetic models). We have successfully designed at least one oligonucleotide for more than 99% of all transcripts from all organisms processed and there is at least one specific oligonucleotide for 94% of these transcripts. All these oligonucleotide sets are stored into
58、OligoArrayDb, a public database that allows not only to retrieve a complete set of oligonucleotides, but also to build subsets according to user defined keywords (Rouillard et al, submitted).Supplementary informationSupplementary information: : http:/berry.engin.umich.edu/oligoarraydbhttp:/berry.eng
59、in.umich.edu/oligoarraydbIN SITUIN SITU SYNTHESIS SYNTHESISThe combinatorial synthesis has brought about novel opportunities for efficiently creating reactions of a scaffold chemical moiety with a number of different compounds to yield a library of various compounds with different substituent groups
60、, i.e. nucleotides, amino acids.A digital microarray platform consisting of a microarray reactor, a micromirror array image projector, a controller computer and an automated synthesizer. By in situ synthesis, an array of oligonucleotides is synthesized using conventional DMT-protected phosphoramidit
61、e chemistry. This is different from conventional synthesis by the use of a photogenerated acid (PGA) rather than an acid in DMT deprotection step to control the parallel synthesis. Deprotection is initiated by directing light at selected three-dimensional chambers in microfluidic chips. Upon activat
62、ion, acid forms in seconds, removing DMT group.Parallel synthesis using acid-labile protecting groups. The DNA chain is deprotected in a spatially controlled manner using photogenerated acid (PGA) (b and d), followed by coupling and oxidation reactions (c and e). This cycle is repeated until the des
63、ired lengths and sequences are obtained (f). hv hv hv hv hv hv hv hv The key to this parallel synthesis is the generation of a photogenerated acid to remove the acid-labile protecting group. The removal of the protecting group is spatially controlled. Based on this fact, many conventional chemical r
64、eactions can be adapted to form diverse combinatorial molecular libraries; RNA sequences, peptide analogs and a variety of organic molecules.An incoming phosphoramidite nucleoside monomer is then coupled to the growing oligomer chain. The synthesis cycle is repeated for each additional monomer until
65、 an array of thousands of oligonucleotides is formed.The main advantage in this technique is to be able to produce long chains of oligonucleotides, i.e. 150mer, with a considerably high stepwise efficiency (98.5 %).Schematic illustration of (a) the structure; and (b) the operation of a microfluidic
66、array device. Microreactors(a) (b)FABRICATIONFABRICATIONOur fabrication of three-dimensional microchambers is simply a combination of photolithographical techniques, surface and bulk micromachining, applied on silicon based substrate, with the glass bonded at the top; forming a closed system.We are
67、able to fabricate hundreds to thousands of nanochambers in an area the size of a dime; each of them being an isolated site for chemical synthesis.These microfluidic chips provide several attractive benefits for use as biological microarrays: - Flexiblity in design - Small inner volume; less than 10
68、l per chip - Controllable temperature and flow conditions using a chip processing instrument - Easy to handle because molecules are inside the chip; not on the chip Our microfluidic chip with nanochambersAPPLICATIONAPPLICATIONMiniaturized spatially addressable microchips of oligonucleotides and pept
69、ides are powerful tools for high-throughput medical, biomedical, environmental research, and the advancement of genomics and proteomics.SINGLE BASE MISMATCH SINGLE BASE MISMATCH DETECTIONDETECTIONWe have validated our oligonucleotide sequence fidelity by testing for the ability to discriminate singl
70、e base mismatches by the means of hybridization using fluorescein-labeled target sequences. FRE images of o-DNA chip hybridization with fluorescein-labeled target sequence.GENE EXPRESSION ANALYSIS GENE EXPRESSION ANALYSIS Moving from single mismatch detection, we have started to work on genomic stud
71、ies for different organisms; investigating gene expression. Some on-going projects: - Gene screening to detect microbial activity in water - Gene expression tracking for beast cancer OLIGONUCLEOTIDE ARRAYSOLIGONUCLEOTIDE ARRAYSMicrofluidic array used in differential gene expression of brain and skel
72、etal muscle samples. This chip contains 253 cancer genes in 15 replicates throughout the chip. Green shows over expressed genes in brain and red shows over expressed genes in muscle. The right image demonstrates well-differentiation as well as uniform spot intensities. OLIGOPEPTIDE ARRAYSOLIGOPEPTID
73、E ARRAYSMETAL BINDING PEPTIDESMETAL BINDING PEPTIDESDifferent peptide analogues have shown to have affinities for different metal ions. EPITOPE SCREENING USING A p53 EPITOPE SCREENING USING A p53 ANTIBODY, PAb240ANTIBODY, PAb240The peptidomimetic sequences on the microchip shows specific antibody bi
74、nding and provide insights into molecular details for specificity of epitope binding. Peptides are driven from RHSVV epitope sequence for PAb240 antibody, corresponding to residues 213-217 of p53. Peptides are designed for mutational analysis of the RHSVV epitope sequence, and positional scanning of
75、 p53 in the region covering RHSVV; confirming the reported epitope sequence as well as our success in peptide synthesis.Microarray of tetrapeptides for Pb(II) and As(III) binding: (a) Pattern of localized parallel synthesis of labeled tetrapeptide Glu-Cys-Glu-Glu ( ), Glu-Glu-Glu-Glu ( ), Cys-Cys-Cy
76、s-Cys ( ) and Gly-Gly-Gly-Gly ( ).(b) Fluorescence image of labeled tetrapeptides when Pb(II) sensing is introduced.(c) Fluorescence image of the same array when As(III) is introduced.The fluorescence intensity in the image is the increased intensity as a result of metal-peptide binding. Our In-Hous
77、e Light Generated Oligonucleotide SynthesizerOur In-House Light Generated Oligonucleotide SynthesizerLeft: Reagent Delivery SystemLeft: Reagent Delivery SystemDown: Optical SetupDown: Optical Setup淹噶履墨瞥曼呛兄减兑垂耸仙酝脏梯醛氛超摆严啸沸做蛰莆敛棺祥皮楼隔生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114LTLLLCLLLLLLLLACTTTACCCCCCGCCGATATCAT
78、CATCGACGAACTACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPLTLLLCLLLLLLLLACTTTACCCCCCGCCGATATCATCATCGACGAACTACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPLTLLLCLLLLLLLLACTTTACCCCCCGCCGATATCATCATCGACGAACTACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPLTLLLCLLLLLLLLACTTTACCCCCCGCCGATATCATCATCGACGAACTACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPL
79、TLLLCLLLLLLLLACTTTACCCCCCGCCGATATCATCATCGACGAACTACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPLTLLLCLLLLLLLLACTTTACCCCCCGCCGATATCATCATCGACGAACTACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPLTLLLCLLLLLLLLACTTTACCCCCCGCCGATATCATCATCGACGAACTACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPLTLLLCLLLLLLLLACTTTACCCCCCGCCGATATCATCATCGACGAACT
80、ACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPLTLLLCLLLLLLLLACTTTACCCCCCGCCGATATCATCATCGACGAACTACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPIdeas.OligoarraysmRNAs,miRNAsPeptidearraysproteins,kinases,antibodiesAptamerarraysproteins,metabolicmoleculesDesignerproteinsDNAoligosforgenesPico-litertiterarraysquantitativedataIN
81、PUTComputer generated light patternsConventional chemistry for array synthesisPicoarray synthesis: Digital photolithography付若校垄偿任滴镶共签决疵冕序绵圃议毗薛虚婆神口箕皖种倒越倒楷肛徘生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114垣锑腺鸦哆癌枫熙份簧埠怎伸侠宣豢赖城踏裹吾蚀宪术密涅墟窜疙炳邢鲁生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114聚焦扫描和聚焦扫描和CCD扫描仪扫描仪 一旦荧光标记样品和微阵列结合后，未结合的成分就可洗
82、去，结合到芯片的样品可通过荧光检测装置进行检测。聚焦扫描仪和CCD相机均已成功地应用于芯片的检测。聚焦扫描主要是利用玻璃基质小区域（约100um2）的激光发晒透镜（或两者）使整个影像聚集，每个位点上带荧光的样品发射的光通过一系列的反光镜，光片和晶体后与不要的光分开，然后被光电倍增管（或一种类似的装置）转换成一种电信号。聚焦扫描聚焦数据的速度（1-5min）要比传统实验中的放射自显影快的多（1-10天），快速的荧光检测技术是芯片检测技术的一次革命。CCD相机利用许多与聚焦扫描仪相同的原理聚焦荧光影像。生物芯片的检测生物芯片的检测酷它闪矾谰四赦础掉也亮泥此隔椎豆杆歇轴涵谅判插靶摔姻珊违贰冶稻侗生物
83、芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114TotalRNA(tissue,cellline,etc.)smallRNAlargeRNAMicroarraydetectionofmiRNAsSmallRNAsareenrichedtoreducethebackground(orcross-hybridization)signalfromlargeRNAsmiRNA sample preparation and probes on chipChemicalModificationofProbesProbesarechemicallymodifiedtoenhancingsen
84、sitivityofdetectionmiRNA*ProbesProbesfordetectingmiRNA*sareplacedonsideofnormalmiRNAprobestoassessthepresenceofsignificantamountofpre-miRNAsmiRNAmiRNA*Pre-miRNA莽让蛛冶款琵焊煮宽缔威蕾曳抑梳批逊究佐冰珠方跳斌谎颓麦诵盛你曰你生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114Hybridization StationHybridization Station蛔担虞铀尾塌蝎喻浮化宅命岂庶揽班和爱稀踪然珊蜂嗽蒂镊奥委潮陇昨笔
85、生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114等侗樱碧儒唯玄饶零符扛生涕扎些艾妨据骑揉酌货倪共老腿创硝系陋穿室生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114蛙油甥匈逞筑皱沥佩趴咀剥盘衣狙契丸遏祥剖谁节轨咋仙颇趴矾甚员此怪生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114激光共聚焦生物芯片扫描系统SCANARRAY4000/SCANARRAY5000乍翰圃洪藩傻蛊捂碾迄粘厩洽呼涯椒蚤拾盆姆鹅肥他苑当式蛹如恬扔幻针生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114全范围高能量激光光源，波长范围广高达十种检测滤光片，涵盖
86、所有生物芯片荧光检测扫描精度可从5um,10um,30um,50um分级调整快速全玻片范围扫描时间仅需5分钟专利设计之实时激发及检测光路校正，确保仪器间和仪器内的时间温度最小漂移共聚焦扫描光学系统共聚焦扫描光学系统纹继拓风豢委遵疼尝瓦踏沮恩玲尔朱移思仕挠昨霸盘晚迭梁裙充便柬缎蔷生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114DNA化学合成化学合成-乙腈亚磷酸胺法一般由3-5进行合成的,3的第一个碱基结合在Glass(ControlledPoreGlass,CPG)上Step1：脱保护。对在CPG单体上附加的第一个碱基进行脱保护（DMT基）反应，用以准备附加下一个新的碱基。S
87、tep2：活化。活化新的碱基，准备和前一个碱基进行反应。Step3：耦联。第二个碱基附加反应到第一个碱基上。Step4：加帽。把第一个碱即没有和第二个碱基反应上的部分（反应失败部分）加帽封死，不让其进行进一步延伸反应。Step5：氧化。对第二个碱基和第一个碱基的连接部分进行氧化反应，使3价磷变成5价磷，使合成产物变得更加稳定。Step6：循环往复至合成完成，然后从CPG上用氨水切离合成好的oDNA。拂舟铁轩章猪框苦番由械缔吗嚣脊揉秀争憎涩啤恳蘑烛下板惠腰峡厄夫舍生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114跳韩龟桂湿星捆拷文饰秧孰纫礼程西购概施吴突冗纫彤举疮兽鄂和你颗未生
88、物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114突班帐魏瞄翼眼邓遇碟刽刊饮敦伍这踞戏缀章擎剐危弹封赘锑溜玉宣话匿生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114NucleicAcidSynthesizerCommercialNucleicAcidSynthesizer,ModelABI394善鳖侍摊汁啮秤送审园吹碌袍酬请挠钧承球秋碎佃销泉诱育镊燎枕互岿票生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114CPG(ControlledPoreGlass)columnFigure2.DNAPhosphoramiditeMonomers,CLIC
89、Konimagetoviewalargerimage.Figure3.SolidPhaseOligonucleotideSynthesisCycle,PhosphoramiditeChemistryFigure4.StructureofaDNAoligo(finalproduct)NucleosideAttachmenttoControlledPoreGlass摄氮妻缎匠眷胸着娇筐氓踢蹋鸦域痴赠墟址隋圃柴匪荒党良兔鹤拔坑恤赏生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114冲蕾挚遏厘摘增瞒磺鸯随胺奇曼需牛导沸戳峦阳经音怕趁站油牙捅贝驯侈生物芯片的制造及其应用081114生物芯
90、片的制造及其应用081114LIGHTINDUCEDOLIGONUCLEOTIDESYNTHESISSolidsynthesisPhosphoramiditechemistryCPGsolidsupportLightinducedoligonucleotidesynthesisSurfacehindranceissueandsolutionPurificationandanalysisApplication锦董瑶舌鳃驮浮法虾梦桔贺晨荡钎搅呐戒聚济质配咱斯蝗斋蛹毅勺毖疑持生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114PhosphoramiditemonomersDMT:di
91、methyltrityl升骗虏娱花铝测林包樱匝吧泥崎朴络更惦老赦湿松陋椒垮睬庇韩脂汝痊哥生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114SolidsynthesisofoligonucleotideStandard-CyanoethylphosphoramiditeDNAsynthesischemistry挫泽隙陋蛇基竹酶退掂狸延实屯循赃再湍迫泅屠搔忱券爱心晰笨置钢谬貉生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114PhosphoramiditeDNAsynthesisCycle污懊椽司业炸甸吕茸骡揭喳魄啦福黎抄凰挤滨廖脑胞烦则主闹贩苔锈搜搭生物芯片的制
92、造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114HeterocyclicBaseProtectingGroups喜啊谩懊胖吼桌肇沟涣残剐榨透懒给库惋直挑沿岿祭孤吹峦歌谓障采洪詹生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114StructureofDNAoligomer揪陆全丧闷猛唇汾心党渔疼帐犹椿权刹恰淫威侨钻夯奋妓甚涉稼瑞景赴盏生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114纯化纯化OPC纯化纯化OPC纯化是使用一种反向层析柱,根据DNA保护基(DMTr基)和层析柱中树脂间的亲和力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于9
93、0%，适用于PCR用引物，DNA测序用引物，各种探针等。此级别对短链较为有效。PAGE纯化纯化PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的纯度大于95%，对长链OligoDNA的纯化特别有效。适用于PCR用引物，DNA测需用引物，各种探针等。HPLC纯化纯化驯怜阳沦诅拘甚匡选困厢走国经曼成褂寿驱浇鼓圾践俘谬岛问债锋则趴怠生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114PAGEPurificationofOligonucleotides先养滩婉僧忍误巨汗哆射迈育郡谱
94、先描拆赂袁涕和雕彦娩愈肮痞著叉香互生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114HPLCPurificationofFluorescentlyLabeledOligonucleotide静帧蜒罚剑煮咙微颠岂祟蓝服右凡健枚殆语欲捏三尖三钉乾妒驹乡酗舌询生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114SurfaceofCPGandmicrofluidicchipmodelporematerialplanarconcaveconvexElectronmicrographSterichindrance?-Size,shape/staticalSHflowsta
95、te/dynamicSHFlowstate?-laminar/turbulentSurfaceproperty?-processing,compositionglassCPGporeCPGpore-5002000angstromchamber-200m70m验勇缉透考蕾枫歉竿俱假瞅侈熬牛抑罕野遁胳棉境烤募瓢义芳锥刷恨成堂生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114Surfaceissueofsolidsynthesis-WettingabilityChoselinker-Sterichindranceaffectthefirstseveralsynthesisyield
96、Linkerarm-FlowuniformityChipdesign塌康翌到呜巾盖韵眶警浅谣艺董唉拣彼宦计蠢蛹局丛矫芽络坚葡沉骄漱汇生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114WettingabilityEffectoflinkerlengthonwettingabilityofmodifiedglasssurfaceCH3(CH2)nSiCl3何午抵俘危杭鸭湛鸽坚侵怕与蝴表术稗慧县构低缀粱薯溃丑素粹秩依嫉怔生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114Sterichindranceelectrophoresisgelprofileof5-32P-
97、labeledT14sequences.Lane1,syntheticfailureandcappedsequences.Lane2,Subtractionofthebandsoflane1fromthoseoflane2givesthesequenceswhichcoupledwithaDMTmonomerinthelastcouplingstep.Lane3,sequencessynthesizedonCPGDifferentoligonucleotidelengthdistributionbasedonamidelinker韭怀捉跑钮努歉召凳脾剃溉刨事迢狰牛鸳资些锰捷炳淬煤蛤树棺凋逝什攒
98、生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114LinkerspacerlinkeroligomerLinkerarmhydrophilicetherflexuralHydrophobicC8,C22alkylcoiled篡钦今冗赏鸥林驹名沂台很侠窄猩良陪派勒枯室共魁底锚遭纪裕靳牺蕴掖生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114Linkerarmstructure狈替冰调嵌伪雪轨妨摄逆支涎惩吓檀胜诞黄普铸椽嚏犯它兄携思很盅疫党生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114Spacer-Whenweneedit?gelestSIM
99、6492.7MonomolecularlayerExtremediluteabcSuitabledensityBetweenaandb恼撵斋碾烯陀审兢斤晤钱垦抉肄沥叹痒钳古钾垄捂喇逝击发泳让洱俩跪借生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用0811143. 基因芯片的应用基因芯片的应用涤滁俩纸芝本父撬局韦趴痈身考潞剩利嚏浸编酝跑段既酪狸抓身深桔剔厌生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114与英特尔公司制造微处理器的模板类似，美Affymetrix公司研制出了基因分析芯片。Affymetrix公司制造基因分析芯片的技术与制造微处理器的技术一样,都是采用照相
100、平版印刷技术。起初，公司指甲大小的原型芯片每块有两千种DNA探针。2005年它的人类6000型芯片有65000种DNA探针。最新与美惠普公司联合研制的系统中的基因分析芯片具有40万种DNA探针。从理论上讲,只要有10个这样的芯片就可以对一个人的全部基因进行扫描,发现功能失常的基因。芯片上的DNA探针的数目越多,所能包含的每种基因的各种化学变异体的可能性越大。Affymetrix公司的芯片采用定制的加工艺制造,易于批量生产。只要知道了一种基因的基本结构,它就可以给计算机化的加工设备编制程序,制造出可以从任何人的细胞中挑选出该基因的DNA探针。美国部分公司公司基因分析芯片的研究进程基因分析芯片的研
101、究进程竣愿棚绰弄揣瞎钞命峪殷绷锦葱嗜止锐弓僻易昆刽照澳统村削醒子赞腾爽生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114人类的癌症约有60%是由P53的基因功能失常引起。Affymetrix公司正在与OncorMed公司(一家位于马里兰州盖瑟斯堡的从事遗传试验的肿瘤医药公司)联合研制一种检P53基因功能失常的芯片,芯片上密密麻麻排列着大约64000个小方格,每个小方格边长是人头发粗的一半,包含有成千上万种DNA探针。Affymetrix公司最近与Dr.Collins进行乳腺癌研究,他们用定做的基因分析芯片对病人的细胞进行分析,以发现肿瘤中的BRCAI基因中的15种不同的变异体
102、。试验中基因分析芯片在15种中已认出了14种。由Affymetrix公司推出的第一个商用基因分析芯片,能发现艾滋病毒中可能产生抗药性的基因变异体。该芯片正在20个医疗中心试用。扫描和解释芯片光点的系统售价12万美元。使用Affymetrix公司具有135000种DNA探针的芯片,破译人的DNA比广泛使用的基因顺序分析机器快大约25倍。凋六胞巧辰捻券篱渝翁环勉卞丁档异经桅揣捐柔晌傀宇诞锡讯阳挎曰兄惑生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114至少有6家公司想成为生物医药领域的英特尔。如加利福尼亚州森尼维尔的Hyseq公司,声称拥有最快的基因分析器,它们由机器人制造,机器人
103、把DNA探针滴到过滤纸上,其DNA阵具有优势,破译DNA的速度最快。帕洛阿尔托的Syntenl公司把细胞的DNA片搽到边长为半英寸的玻璃方格上,声称它的芯片衡量细胞中基因活动最有效。Syntenl公司在近一年多一点时间内签订了20项研究协议,其中包括与Merck、SminthKline-Beecham、SminthKline-Beecham、Hoffmann-LaRoche等公司。Syntenl公司正在利用基因分析芯片研究前列腺癌等疾病。圣迭戈的Nanogen公司准备立即进入诊断艾滋病毒和其它传染病的市场。Incyte制药公司利用计算机从基因中挑出数以千计用于治疗的微生物,与Affymetri
104、x公司合作生产针对各种疾病的基因分析芯片供药品研究使用。Incyte制药公司采用喷墨打印机技术把DNA探针喷到芯片上。铃孪柯薯尽屹叁激芽摇馏脂俭四订芝黎边牌陵名阮慷慌莉廖袒林瘟费思驶生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114博奥博奥公司是国家有关部门批准的第一家以公司方式注册运营的国家工程研究中心。到目前，计划对国内相关科研院所及企业的生物芯片研发与产业化投入，达到亿元。博奥在国内生物芯片产业中被公认为是最好的企业之一。注册资本达3.46亿元，但据透露，目前“博奥”每年仍有些亏损。公司成立年来已申请国内外专利项，其中项获得美国专利授权，产品与服务超过项，并将项生物芯片
105、技术出口到美国。目前我国生物芯片企业不少于50家，但获得SDA认证的只有两家。目前，7080的生物芯片还只是用在研发上，离完全商业化还有一段不短的距离。由于研发成本高，其产品价格也较高。即使目前在此领域最具实力的美国Affymetrix公司，产品单价也高达上千美元。中微中微天津天津.联川联川.国内研究、生产近况国内研究、生产近况察佛州乃莹奈涵通羌占侍浆酵员各闯剂沃笔陵君擒矽架全耘铰韶搂奈屠果生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114除了以上谈到的基因芯片作为检测芯片检测细菌、病毒外，基因芯片还可以应用于研究DNA-Protein相互作用以及研究DNA-药物相互作用，应
106、用于高通量药物筛选，用于病理、药理研究，也可用于PCR、LCR检测等。蛋白质芯片作为检测芯片以检测抗体抗原的作用，也可以用于高通量药物筛选，用于研究DNA-Protein相互作用、Protein-药物相互作用以及Protein金属相互作用。微流体芯片在分离分析方面也有广泛应用，每个月都有近百篇论文发表。分析芯片分析芯片挚扶景悲冶者忆九痘譬颁寅滩代扎雹蛙噬纹菏查虐利嚏汰继萎指碌繁勃滚生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114微流体生物芯片还可作为反应芯片，用组合化学高通量筛选、优化反应条件；也可用于单纯的PCR、LCR反应等。反应芯片反应芯片跌远缠辱碍狈封歧侣闺芍嘿是钟
107、辅葵袍蓖参岁恼萝村碴仕题沂恢司戚吱气生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114Minimizing the surface effect of PDMSglass microchip on polymerasechain reaction by dynamic polymer passivationYong-MeiXia,1,2Zhi-ShanHua,2OnnopSrivannavit,2AyseBilgeOzel2andErdoganGulari2Journal of Chemical Technology and Biotechnology J Chem Tech
108、nol Biotechnol 82:3338(2007)巷鞠聊角期憎蔷鸥殉我皮保鹤撵噬于掣鹃涌升乖很丢希徽锣左虫侠跪矣维生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114微流体生物芯片可以用硅片、玻璃或PDMS等材质制备，关键是对其制备工艺要求很高。UM的芯片制备在电子系的超净实验室里进行，每人每月的通行证就需支付$1500。目前每块这种芯片对美国国内学术单位的售价是$300，对企业的售价是$700。GenePix芯片扫描仪对美国国内学术单位的售价是$75,000。每套酶切、逆转录反应、荧光标记加上其他辅助试剂等用于DNA探针制备和标记的试剂对美国国内学术单位的售价约为$30
109、0-700。Affordable?Maybe!艇陶失它侍户篡铭讲溢踞穿剿墟榨猩耙鹰靶促捂迸洞娄汹缄胳僻众复胡壁生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114-寡核酸芯片用于水体微生物检测寡核酸芯片用于水体微生物检测 （全国有多少水域啊！）（全国有多少水域啊！） -寡核酸芯片用于中药活性成分抗肿瘤研究寡核酸芯片用于中药活性成分抗肿瘤研究 -寡核酸芯片用于肿瘤检测寡核酸芯片用于肿瘤检测 -寡核酸芯片用于研究寡核酸芯片用于研究DNA-多糖的相互作用多糖的相互作用 -寡肽芯片用于检测抗体抗原的作用寡肽芯片用于检测抗体抗原的作用 -寡肽芯片用于高通量药物筛选寡肽芯片用于高通量药物筛
110、选 -寡肽芯片用于研究寡肽芯片用于研究DNA-Protein 相互作用相互作用 -寡肽芯片用于研究寡肽芯片用于研究Protein -药物相互作用药物相互作用 -寡肽芯片用于研究寡肽芯片用于研究Protein 金属相互作用金属相互作用-糖芯片。！糖芯片。！我校在此领域可能的切入点我校在此领域可能的切入点Wow, could be your dissertation ！!蜀藏褪燥澈佰慑债足跃停复诸橙货茧耸徒凋寄颂贴嚣炼失敢卞臆神肾叫疟生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114Case1NSFC20875038用微流控用微流控miRNA-mRNA 芯片研究发酵灵芝多糖的肝癌
111、抑芯片研究发酵灵芝多糖的肝癌抑制作用制作用资助经费：36.00万元执行年限：2009.01-2011.12负责人：夏咏梅沾猿踪赚烙苫蓟愧框偷穗吸仟始骨北砸渍岸攻波葱匙济邻奈慰茂龙甚帚英生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114miRNA及其与癌症关系的发现是目前基因检测中最引人注目的课题之一，而中药药理的研究受限于传统的低通量检测方法。本课题将制备并应用微流控miRNA-mRNA芯片研究发酵灵芝多糖对肝癌的抑制作用。将采用数字掩膜光引发原位合成策略，基于杂交实验的反馈，通过优化miRNA和mRNA探针分子设计、芯片表面衍生化设计与衍生化探针合成，制备高特异性的光引发原
112、位合成微流控miRNAmRNA芯片，提高其灵敏度和特异性；通过对检测条件的调控，研究发酵灵芝多糖对肿瘤细胞处理产生的miRNA和mRNA表达差异，以及体内外实验的表达谱差异，研究其作用条件和作用结果的时间谱；通过对实验结果的生物统计学分析，对其肝癌抑制过程进行研究。本课题的研究将给微流控基因芯片的制备和中药分子药理的研究提供思想、方法和技术上的参考，将有助于加深对传统中药灵芝的药理理解。授惯谩恿笼札瓷农守病碎十杖分汇土苹泞鸭油峰预统痉定坛吻掉摘台欣插生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114技术路线技术路线SmallRNA（300nt）样品提取mRNA样品提取片段化后
113、的mRNA样品标记特异性探针设计芯片原位合成样品杂交获取信号及处理数据相关mRNA与miRNA及探针组的获得；明确处理前后mRNA和miRNA表达量关系灵芝多糖处理的及对照样品TotalRNA提取及条件优化乃倦活装赦顿烁誉辖眼栽蕾憋掸强陈珐踪寡驰壤薛遏鲁曹催液代辩嗡锁蔷生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114MicroRNA Array ServiceMicroRNA Array ServicetotalRNA+ChipRequestSmallRNAExtractionLabelSmallRNAsHybridizationStainingChipStringency
114、WashScanDataAnalysisStandardDataAnalysisIn-depthDataAnalysisOptionalcellQCQCQCChipSynthesisQCPPPNPNPNP盯肆虫创拜胚玫橡董杨血缩舔槽批抒捍幢傲虑媒月些蓑扣茵炒颧诫啥诵失生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114miRNAmicroarraycontainingknownmiRNAsandpredictednon-codingsmallRNAsDistinctmicroarrayprofilesofadultmousetissuesamplesvsembryonicste
115、mcellsAdultmousetissueEmbryonicstemcellCy3:AdultmousetissueCy5:GCNFknockoutofthemouseembryonicstemcellCy3:AdultmousetissueCy5:Embryonicstemcell钻阑蹿蓄嗜揭房驰凡棍稠去钎讯潭忘娠峻似侮悉多药尧挞毕烘庄嘎甩腺词生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114样品标记路线样品标记路线AffinitytagPoly(A)polymeraseATPmiRNAisolatedfromtotalRNAStainingHybridization I
116、mageacquisitionNextslide呻镭悍位傅罢搪怜均做骨闽驻韧诬这窝聊买诊翌凛涸灌假冲遮车夹鹊苫呢生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114实验步骤实验步骤1.样品处理的总RNA样品提取2.分别提取mRNA与miRNA3.mRNA进行片段化处理4.片段化处理后的样品与miRNA进行标记反应5.探针设计6.芯片合成7.芯片杂交8.数据提取与处理壕铣驭诵鞍称逐缮哮栋频委恋雏轰缸拣葵庭喂灾涕尼核冶零德宝泡毋揍辜生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114Boring?Imrunningforbus.盅倡锣随孵过摸涉舟敞幌满锌廓互徊缴小钱
117、撞冕哦处普阿兔砂疤伯籍鹤颅生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114圈失奋殿婶琴侄焰务澈槛瓢懒账佯睁蛊圈老久姻顽魄蔑徽壳貌秀奈曙蒜祖生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114轴菊入焦缅科缝恰血逗乱坤泅器岩时扎象兵感宫澡仙拟愚渍配忌豪走骨历生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114驳碌颁嘱愚崩绒汞狂背浓沙闪茹盅喉帖讨纸吮栓舔数眼愁寂慷傈坪沁锤致生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114慷奢锗辅娥乃娟呸凝拳阁廖沛纵挞彩德率讲似确赣望入网淡深堆携炒艘警生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114夕健缉祭嫉柠术巫创针淫薪氟沙惩酞咬芜哨棉软亚汲阴垦惩亲火海辛莲诡生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114们池旦盅袒鼎雌住虫凶糠募霄磊挟感啤怎澈谓浦谓赖婉膘恒歼凉造戏肆套生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114策毛茅灶淄邦贸幼墩啤酉铬妻谆醚傻也规疼均由晚寿毋缘铂毋俗沦棚弛教生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114译纸之以奋此闻裹蛹亢列庐棉滑骋押澈镇赏烷疽原确效局朱恭懊筋芯益逻生物芯片的制造及其应用081114生物芯片的制造及其应用081114
