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1、流式细胞分析在临流式细胞分析在临床血液学中的运用床血液学中的运用1、白血病免疫分型vFAB主要根据形状学和细胞化学进展分型。vMIC方案在FAB方案根底上结合了免疫学和细胞遗传学。M：形状学 I：免疫学 C：细胞遗传学免疫分型与FAB的关系vFAB分型受检查者的客观要素影响大，符合率有一定限制。v免疫标志可以提供正常细胞在演化成恶性肿瘤过程中细胞基因及抗原标志发生变化的信息，而这种变化经常是细微的，以致于常规FAB方法不能分辨。v免疫分型是MIC的重要组成部分，它是对FAB分型的补充。v属于同一种FAB型的病例，能够具有不同的免疫表型。v免疫表型在AML和ALL上与FAB的不一致并不减低免疫分
2、型在白血病患者的运用价值，相反，免疫表型使我们对血液肿瘤细胞的生物学特征有了更深化和更准确的认识。v免疫表型对肿瘤的诊断、治疗战略的制定、预后判别及肿瘤发病机制的研讨都具有重要作用。免疫分型的两个阶段v根据白血病细胞表达的系列相关抗原，确定其系列来源。如：淋系T/B、粒单系、红系、巨核系等。v根据白血病细胞表达的系列分化其相关抗原进一步分型。如：早前B，前B，普通B急性白血病的四大免疫类型v单表型急性白血病v表达某一个系列抗原为主的急性白血病v双表型/双克隆急性白血病v未分化型急性白血病急性白血病的免疫学系列分型急性白血病的免疫学系列分型 类类 型型 系系 列列 积积 分分 B系系 T系系 粒
3、单粒单系系 巨核系巨核系 红系红系1.单表型单表型 纯纯B-ALL 2 0 0 0 0 纯纯T-ALL 0 2 0 0 0 纯纯AML 0 0 2 0 0 纯纯AML-M6 0 0 2 2 2 纯纯AML-M7 0 0 2 2 2 急性白血病的免疫学系列分型急性白血病的免疫学系列分型 类类 型型 系系 列列 积积 分分 B系系 T系系 粒单粒单系系 巨核系巨核系 红系红系2.单表型为主单表型为主 My+B-ALL 2 0 2 0 0 My+T-ALL 0 2 2 0 0 Ly+AML 2 2 2 2 2 T+B-ALL 2 2 0 0 0 注注: My+ : 髓系抗原阳性髓系抗原阳性;Ly+:
4、淋系抗原阳性淋系抗原阳性急性白血病的免疫学系列分型急性白血病的免疫学系列分型 类类 型型 系系 列列 积积 分分 B系系 T系系 粒单粒单系系 巨核系巨核系 红系红系3.双表型双表型/双克隆型双克隆型 T/B 2 2 0 0 0 T/M 0 2 2 0 0 B/M 2 0 2 0 0 4.未分化型未分化型 AUL 2 2 2 2 2B细胞系ALL的免疫分型亚型型CD19CD20HLA-DRCD10CyIgSmIgFAB分型分型早前B-ALL+L1,L2前B-ALL+/+L1普通B-ALL+/ +L1,L2成熟B-ALL+/ /+L3 T细胞系ALL的免疫分型 亚型 CD7 CD2 TdT FA
5、B分型早前T-ALL + + L1,L2 T-ALL + + + L1,L2免疫分型的价值免疫分型的价值n确定ALL的细胞类型B细胞或T细胞和ALL的分化阶段。n鉴定AML的特征。n对形状学上未分化的急性白血病有助于鉴定细胞类型。n诊断一些少见类型的白血病。如：M6、M7、M0等。n诊断双表型/混合细胞型急性白血病。n鉴别诊断ALL伴有髓系抗原表达My+或AML伴有淋系抗原表达Ly+。n鉴别急性白血病与其他造血系统和非造血系统恶性肿瘤。n根据一些特殊的免疫表型特征诊断与某核型异常相关的亚型。如：M3/t(15;17); M2/t(8;21);M4Eo/inv(16)等。慢性白血病免疫分型慢性白
6、血病免疫分型v慢性粒细胞性白血病主要用于急变期的分型同急性白血病免疫分型。v慢性淋巴细胞性白血病除了鉴别是T还是B淋巴细胞型外，还用于与反响性淋巴细胞增多症的鉴别，以及与部分淋巴瘤的鉴别诊断。v一些少见的白血病如：毛细胞白血病、浆细胞白血病、恶性组织细胞性白血病等的诊断与鉴别诊断。v 2、再生妨碍性贫血的研讨AA是一组由不同发病机制介导的骨髓造血功能妨碍综合征，其发病机制复杂，目前尚未完全明了，但越来越多的临床和实验证听阐明，免疫介导的造血抑制AA最常见的病理机制之一。而且，具有免疫表型异常如：CD4/CD8倒置，CD8+、活化T细胞或TCR异常增高等的患者，临床表现相对严重，但免疫抑制治疗相
7、对有较好的疗效。常用的淋巴细胞外表标志物淋巴细胞亚群T细胞：CD3+、TCR/CD4+(Th/Ti)CD8+(Ts/Tc)B细胞：CD19+NK细胞：CD3-CD16+CD56+淋巴细胞亚群细分：淋巴细胞亚群细分：T细胞：细胞：Ts：CD8+ CD28- Tc：CD8+ CD28+ Th：CD4+ CD29+ Ti：CD4+ CD45RA+B细胞：细胞：B1：CD5+ CD19- B2：CD5 + CD19+活化淋巴细胞亚群：活化淋巴细胞亚群：活化总活化总T T细胞：细胞： CD3+ /HLADR+ CD3+ /HLADR+静止总静止总T T细胞：细胞： CD3+ /HLADR- CD3+ /
8、HLADR-活化活化CD4+CD4+细胞：细胞：CD4+ /HLADR+CD4+ /HLADR+活化活化CD8+CD8+细胞：细胞：CD8+ /HLADR+CD8+ /HLADR+活化诱导分子：活化诱导分子： CD69 CD69白细胞介素白细胞介素2 2低亲和力受体：低亲和力受体： CD25 CD25CD25+ /CD3+CD25+ /CD3+：活化：活化T T细胞细胞CD25- /CD3+CD25- /CD3+：静止：静止T T细胞细胞根据根据T T淋巴细胞分泌细胞因子的不同淋巴细胞分泌细胞因子的不同 CD4+: Th1:CD4+IFNr+ Th2:CD4+IL4+ Th0:CD4+IFNr
9、+IL4+ CD8+: Tc1:CD8+IFNr+ Tc2:CD8+IL4+ Tc0:CD8+IFNr+IL4+Th1Th1细胞：介导细胞免疫、细胞毒性细胞：介导细胞免疫、细胞毒性T T细胞的生长和活细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反响。其功化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反响。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性本身免疫能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性本身免疫病，急性排异反响和接触性皮炎等的发病和免疫病病，急性排异反响和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。理损伤。Th2Th2细胞细胞 ：介导体液免疫，促进：介导体液免疫，促进B B细胞的生长、活化细胞的生长、活化和分化
10、，是和分化，是IgG1IgG1和和IgEIgE类抗体的转换因子，其功能类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反响，参与高亢进将导致特异性过敏反响，参与高IgEIgE综合症和综合症和嗜酸性粒细胞增多症。嗜酸性粒细胞增多症。Th1/Th2Th1/Th2细胞平衡偏移多见于：感染症、本身免疫病、细胞平衡偏移多见于：感染症、本身免疫病、过敏症、排斥反响、免疫缺陷、肿瘤恶化等。检测过敏症、排斥反响、免疫缺陷、肿瘤恶化等。检测Th1/Th2Th1/Th2细胞平衡主要是分析疾病发生开展的情况，细胞平衡主要是分析疾病发生开展的情况，为临床调整为临床调整Th1/Th2Th1/Th2细胞平衡偏提供正确的治疗根
11、细胞平衡偏提供正确的治疗根据。据。3、血栓与止血血小板糖蛋白血小板糖蛋白 血小板质膜糖蛋白血小板质膜糖蛋白GPa GPa ：CDw49b GPaCDw49b GPa： CD61 CD61GPb GPb ：CD42b GPCD42b GP： CD36 CD36GPc GPc ：CDw49f GPCDw49f GP： CD42a CD42aGPa GPa ：CD29 GPbCD29 GPb： CD41 CD41GPaGPa：CD31CD31 血小板颗粒膜糖蛋白血小板颗粒膜糖蛋白颗粒：颗粒：CD62P (GMP140CD62P (GMP140、PADGEM)PADGEM)颗粒：溶酶体完好膜糖蛋白颗粒
12、：溶酶体完好膜糖蛋白 CD63 CD63 溶酶体相关膜糖蛋白溶酶体相关膜糖蛋白-1 LAMP-1-1 LAMP-1 溶酶体相关膜糖蛋白溶酶体相关膜糖蛋白-2 LAMP-2-2 LAMP-2活化血小板检测活化血小板检测 CD62P CD62P， CD63 CD63 GPb/a GPb/a复合物复合物(CD41/61)(CD41/61) GP(CD36) GP(CD36) PAC-1 PAC-1 Thrombospondin Thrombospondin 血小板内钙离子血小板内钙离子遗传性血小板功能缺陷性疾病诊断遗传性血小板功能缺陷性疾病诊断 巨血小板综合症巨血小板综合症(BSS)GP Ib-(C
13、D42a/CD42b)缺陷或缺乏缺陷或缺乏 血小板无力症血小板无力症(CT)GP b/a(CD41/61)缺陷或缺乏缺陷或缺乏 储存池疾病储存池疾病-SPD下降下降4、CD34的绝对计数 随着近年来外周血造血干细胞移植病例的日益增多，外周血造血干细胞的流式定量越来越成为一个突出的话题。如何准确地定量干细胞数量，什么是有效的质量控制成了各大实验室的话题。1989年，欧洲人创建了米兰方案，利用SS与CD34作双参数直方图，计算CD34阳性细胞数；同年，北欧人改良了米兰方案，参与了对照，称之米兰/北欧方案。 1995年，血液病治疗及移植国际结合会(the International Society
14、of Hematotherapy and Graft Engineering，ISHAGE)成立了干细胞绝对计数(Enumeration)小组，努力于寻求一种简单、快速、灵敏的流式细胞仪检测方法去定量外周血中的造血干细胞数量。这一方法必需是对于临床实验室中不同的流式细胞仪都有效，而且在不同的移植中心具有可比性。这一方案即在96年问世的ISHAGE方案，至今为止，其他各种方案改良均以此方案为根底。5、多药耐药MDR的研讨白血病治疗的失败再很大程度上是由于白血病细胞对化疗药物产生了耐药。因此对白血病耐药机制的研讨具有重要的意义。但是耐药的构成过程却很多。主要有几个方面：药物吸收减少、细胞解毒作用加
15、强、靶分子改动、DNA损伤修复才干加强、细胞内药物溢出增多、细胞凋亡的抑制等。常见的流式检测工程：常见的流式检测工程：参与药物在细胞内外转运的蛋白：参与药物在细胞内外转运的蛋白： P-170、MRP、LRP、BCRP、MVP参与细胞解毒的酶：参与细胞解毒的酶： ALK、GST、GSH、MS抑制细胞凋亡的蛋白：抑制细胞凋亡的蛋白： bcl-2/bax、P53药物泵的功能检测：药物泵的功能检测： 罗丹明罗丹明123R123或柔红霉素或柔红霉素6、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)是由于造血干细胞发生体细胞突变而引起的获得性溶血性贫血,典型病例有发作夜间血红蛋白尿,可伴
16、全血细胞减少.其溶血是由于红细胞膜的获得性缺陷,对激活补体异常敏感所致的一种慢性血管内溶血。v随着流式细胞仪的逐渐推行，流式细胞术检测CD55、CD59以能从病理上提供直接的证据而得到广泛的运用。正常人的红细胞、网织红细胞、粒细胞、血小板上CD55、CD59表达完全阳性，而PNH患者细胞那么分为三型根据CD55、CD59缺乏或减少的程度流式细胞术在PNH诊断中须留意的事项：1、尽量同时检测红细胞和粒细胞的CD55与CD59的表达情况。由于PNH克隆来源的红细胞在溶血后和输血后，红细胞中PNH克隆细胞会减少或检测不到，而对粒细胞那么影响很小。同时检测红细胞和粒细胞CD55和CD59可以区分小细胞
17、低色素性贫血和PNH，小细胞低色素性贫血只需红细胞上的CD55和CD59减少，粒细胞上CD55和CD59正常。2、在检测红细胞的CD55与CD59时，可以用全血标志，但必需稀释。而在检测粒细胞的CD55与CD59的表达时，必需先溶血再标志。由于红细胞数远远高于粒细胞，红细胞的存在会与粒细胞竞争对CD55与CD59的结合。7、多发性骨髓瘤MM 多发性骨髓瘤是浆细胞异常增生性疾病。正 常 浆 细 胞 为 CD38+/CD45dim/-， 运 用 CD38/CD45双标志检测外周血和骨髓标本，可以准确划定浆细胞群。通常运用CD38和CD45，结合轻链检查，对多发性骨髓瘤细胞进展分析。另外，正常浆细胞
18、的外表标志为CD19+/CD56-，而多发性骨髓瘤细胞通常为CD19-/CD56+。这样，运用流式细胞仪对外周血或骨髓标本进展多参数分析，并计算异常浆细胞含量，对于多发性骨髓瘤的诊断和治疗评价具有重要意义。 8、血液免疫性疾病1.本身免疫性溶血性贫血2.特发性血小板减少性紫癜ITP3.免疫性粒细胞减少症4. 以上疾病普通检测红细胞、血小板、粒细胞相关的IgG,IgM,IgD,补体C3等，用以鉴别诊断和辅助临床治疗。9、血液病的其它检查(1) 细胞凋亡的检查 Fas及FasL Apo 27 bcl-2 TUNEL Annexin Caspase(半胱氨酸蛋白酶)(2) 细胞DNA分析(3) 白血病残留病灶检查(MRD)
