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1、能源08第二小组组员：16号-30号 IL-18是一种新型细胞免疫调节因子，主要由激活的巨噬细胞产生，在体内分布广作用呈多样化、能诱导多种细胞因子产生、上调Fas配体的表达、介导T细胞及NK细胞的细胞毒活性、增强机体抗肿瘤机能，既能提高特异性免疫又能提高非特异性免疫。以下以IL-18重组基因转入大肠杆菌为例子： 目的基因为IL-18的编码序列（cDNA），采用RT-PCR技技术术从外周血细胞中获得。首先据Genebank报道序列设计引物，并在引物的5端引入EcoR I位点和启始密码子ATG，在3端引入Hind 位点。IL-18基因的RT-PCR扩增产物经EcoR I和Hind 双酶切插入表达载
2、体pBV220的相同位点即得IL-18的表达载体pBV220-IL-18。构建的表达载体pBV220-IL-18按常规方法转化大肠杆菌DH5株后即得IL-18基因的工程菌。 在基因工程菌的构建构成中，培养基是影响菌体生长及产物合成的主要因素之一，通过正交实验、均匀实验或RSM法优化培养基成份可使外源蛋白的表达量大大增加。培养基按用途可分为种子培养基和发酵培养基等. 种子培养基用于种子的逐级扩大培养，同时，为了保持菌种的稳定性，可在种子培养基中加入适量的相应抗生素作为选择性压力. 发酵培养基则应针对不同的工程菌筛选和优化，以维持菌体生长至较高密度和目的基因的高效表达，它一般应包括碳源、氮源、无机
3、盐等，对有些工程菌，还需要维生素等。基因工程菌中培养基基因工程菌中培养基 发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基，它不仅耗用大量的原材料，而且也是决定发酵生产成功与否的重要因素。（1）根据产物合成的特点来设计培养基： 对菌体生长与产物合成相偶联的发酵类型，充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。 对菌体生长与产物合成不相偶联的发酵类型，既要考虑前期细胞的生长繁殖，还要考虑后期目标产物的代谢合成，一般在产物合成时需要添加某些成分。（2）发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些，这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。（3）发酵培养基需耗用大量原料，因
4、此，原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。使用不同的碳源对菌体生长及外源基因表达有影响。葡萄糖和甘油相比，它们所导致的菌体比生长速率及呼吸强度相差不大，但甘油的菌体得率较大，而葡萄糖所产生的副产物较多。氮源的作用主要是提供氨基酸、蛋白质、核酸等合成所需的元素氮。不同的氮源对工程菌的生长及产物表达具有不同的影响。 无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子，如在DNA、RNA、蛋白质的合成，糖代谢、细胞呼吸及ATP水平的控制中。过量的无机磷会刺激葡萄糖利用、菌体生长和氧消耗。 Jensen等科学家在进行补料分批培养补料分批培养时，降低培养基中磷含量，使菌体生长受到抑制，再加大葡萄糖流
5、加速率，可进一步提高重组蛋白产量一倍。培养基中各成分浓度过低或过高都不利于菌体的生产和产品的表达。一般来说，下列物质当其浓度大于括号内值时均会抑制Ecoli的生长：葡萄糖(29L)、氨(39L)、铁(1159L)、镁(879L)、磷(109L)和锌(00389L)。 培养基的选择是影响IL-18基因工程菌的高效表达的重要因素之一。其中适合培养大肠杆菌工程菌的培养基大概有：LB培养基培养基 ，M9培培养基，养基，MBL培养基，培养基，2YT培养基培养基等等。 一个良好的培养基为菌体生长提供必要条件，但菌体对培养基的利用受培养条件的限制。影响菌体生长的培养条件包括：温度、PH、溶氧、比生长速率等。
6、LB培养基分为液体LB培养基和固体LB培养基。液体LB培养基配方： 胰蛋白胨(Tryptone) 10g、酵母提取物(Yeast extract) 5g、氯化钠(NaCl) 10g溶解于800ml水中，另外根经验值用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4，再定容至1000ml。 固体培养基： 1.配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉 2.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55的水浴中，待培养基温度降到55时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。 3.倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。 4
7、.保存：用封口胶封边，并倒置放于4保存，一个月内使用。LB培养基突出特点是营养成分丰富，其中含有丰富的氨基酸、小肽、小分子糖类和各种营养因素，有利于菌种的快速生长。含大量的大分子营养物， 要使细菌很好地利用， 必须首先动员菌体内酶系统（ 如蛋白水解酶） 对大分子营养物进行分解。该培养基较适于种子活化与种子扩增使用。M9培养基,一种培养大肠杆菌的已知培养基葡萄一矿物盐M9培养基配制：酸氢二钠69，磷酸二氢钠39，氯化钠059，氯化铵lg，加水至1000ml，高压灭菌，冷却后加入lmolL的硫酸镁2ml，lmolL的氯化钙01ml，20的葡萄糖lOml 培养基的特点 培养基是以小分子的蛋白水解产物
8、为主， 较易被细菌利用， 同时它含有以无机盐为主的各种营养元素（ 如 、 、 等） 。但当进行中高密度发酵时， 常常需要在发酵过程中补充营养物。发酵培养基(MBL 培养基)组成:葡萄糖 5 g/ L ,蛋白胨 20 g/ L ,酵母粉 10 g/ L ,KH2 PO4 3.5 g/ L , K2 HPO4 5 g/ L , (N H4 ) 2 HPO4 3.5 g/ L ,NaCl 5 g/ L ,MgSO4 7 H2O 1 g/ L ,微量元素混合液 3 ml/ L微量元素组成: FeCl3 6 H2O 0.162 g/ L ,ZnCl2 4 H2O 0.0144 g/ L ,CoCl2 6
9、 H2O 0.012 g/ L , Na2MoO4 2 H2O 0.012 g/ L , CaCl2 2H2O 0.006 g/ L , CuSO4 5 H2O 1.9 g/ L , H3BO3 0.5 g/ L ,加入无菌的氨苄青霉素 100 ug/ L。2YT培养基配方:将16g蛋白胨、 10g酵母提取物、 4ml氯化钠溶解在0.9L水中，搅拌溶解。 为了IL-18基因工程菌达到更高的表达量，再外界培养条件一样的前提下，对以上四种培养基进行比较以及筛选。对以上四种培养基的成分进行对比。LB培养基M9培养基MBL培养基2YT培养基胰蛋白胨(Tryptone)10g20 g16g酵母提取物(Yeast extract)5g10 g10g氯化钠(NaCl)10g0.5g4ml酸氢二钠6g磷酸二氢钠3g氯化铵1glmolL的硫酸镁2ml1 glmolL的氯化钙0.1ml5 g20的葡萄糖10ml5 gKH2 PO43.5 g(N H4 ) 2 HPO43.5 g微量元素混合液3 ml 分别四种培养基进行筛选： 分别用以上四种培养基作为发酵培养基，观察并分析菌落生长情况。并对发酵液菌体进行SDS-PA GE电泳测序, 用薄层扫描仪扫描测定 IL-18基因工程菌的表达量。分析比较四种培养基的结果，菌落生长较好的，表达量高的则是适合IL-18基因工程菌的。个人观点供参考，欢迎讨论
