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1、碱性磷酸酶Km值的测定 1 11.了解酶的了解酶的Km值测定原理值测定原理和方法和方法2掌握碱性磷酸酶掌握碱性磷酸酶（AKP）活性测定的原理和）活性测定的原理和方法方法 【实验目的】2 2在温度，在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随底物浓度酶促反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加，但当底物浓度）增大而增加，但当底物浓度增大到一定极限时，则反应速度趋增大到一定极限时，则反应速度趋于恒定，此最大反应速度于恒定，此最大反应速度Vmax，反应速度与底物浓度之间的关系可反应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示，即：用米氏方程来表示，即：【实验原理】3 3 V
2、maxS V= Km + S 其中其中Km为米氏常数，为米氏常数， Vmax为最大反应速度，为最大反应速度， 当当V=Vmax/2时，则时，则Km=s。 Km是酶的特征常数，测定是酶的特征常数，测定Km是研究酶的一种方法是研究酶的一种方法 4 4将米氏方程变形为双倒数方程，将米氏方程变形为双倒数方程，以以l/ v1s作图，将各点作图，将各点连线，在横轴截距为连线，在横轴截距为-km，据此可算出据此可算出Km值。值。1/V=Km/ VmaxS + 1/ Vmax 5 5S1/2VMAXOD510VMAXKm底物浓度与反应速度关系曲线底物浓度与反应速度关系曲线双倒数曲线双倒数曲线 1/s1/OD5
3、10-1/Km1/Vmax6本实验以碱性磷酸酶为例，用本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠磷酸苯二钠为其为其底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨一氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌红色醌的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。其反应式如下：其反应式如下： 磷酸苯二钠磷酸苯二钠+H2O AKP OH- 苯酚苯酚 苯酚苯酚+4-氨基安替比林氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物醌衍生物 （红（红色色）光密度与颜色，颜色与酚，酚与酶活性成正比，光密度与颜色，颜色与酚，酚
4、与酶活性成正比，故以故以1/A 取代取代1/v 作为纵坐标作图作为纵坐标作图7 71. 0.04 M(40mM) 磷酸苯二钠溶液（底物磷酸苯二钠溶液（底物液）液）2. 0.1 M 碳酸盐缓冲液（碳酸盐缓冲液（pH 10.0）3. 0.05 mg/ml 碱性磷酸酶溶液（碱性磷酸酶溶液（Ap）4. 0.5 M NaOH5. 0.3 % 4-氨基安替比林氨基安替比林6. 0.5% 铁氰化钾铁氰化钾【实验试剂】8 8【实验操作】管 号1 2 3 4 5 6 7 8底物底物液液(40mM)碳酸碳酸缓液液(pH=10)蒸蒸馏水水0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0.00
5、 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1.00混匀后混匀后37水浴，预温水浴，预温5分钟左右分钟左右 9 9酶酶液液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1加入酶液后立即混匀（保持加入酶液后立即混匀（保持37水浴），水浴），反应开始。反应开始。从加入酶液起计时至下一步从加入酶液起计时至下一步 加入碱性加入碱性溶液停止反应，溶液停止反应，各管反应时间应准确一各管反应时间应准确一致，为致，为15分钟。分钟。1010碱性溶碱性溶液液 1.0 1.0 1.0 1.0
6、 1.0 1.0 1.0 1.04-氨基氨基安安 替比替比林林铁氰化化钾 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混匀，室温放置混匀，室温放置10分钟左右分钟左右, 以以8号管为号管为空白，于空白，于5l0nm比色，记录各管的光密度比色，记录各管的光密度1111【实验结果】结果果记录 1 2 3 4 5 6 7 8 OD底物底物浓度度 mmol/L 1 3 5 6 8 12 16 0 1/S 1/OD1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 - 1、原始数据、原始数据1212以以1s为横轴，为横轴，1OD510为纵轴作图，观察曲线形状；为纵轴作图，观察曲线形状；查查Km 值值2、作图1313
