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1、实实 验验 二二蛋白质的两性反应蛋白质的两性反应与与等电点测定等电点测定1n 了解蛋白质的两性解离性质了解蛋白质的两性解离性质n 掌握测定蛋白质等电点的方法掌握测定蛋白质等电点的方法实验目的实验目的2PCOOHNH2PCOO-NH3+PCOO-NH2PCOOHNH3+pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI兼性离子兼性离子 阳离子阳离子阴离子阴离子实验原理实验原理3u 在在等等电电点点时时蛋蛋白白质质颗颗粒粒上上的的净净电电荷荷为为零零，缺缺乏乏同同电电相相斥斥的的因因素素，蛋蛋白质溶解度最小，最容易析出沉淀白质溶解度最小，最容易析出沉淀u 维持蛋白质胶体稳定的因素：维持蛋白质胶体
2、稳定的因素：表面电荷、水化膜表面电荷、水化膜4u 本本实实验验配配制制了了各各种种不不同同pHpH值值的的缓缓冲冲液液，沉沉淀淀出出现现最最多多的的缓缓冲冲液液pHpH值即为酪蛋白的等电点值即为酪蛋白的等电点5实验器材与试剂实验器材与试剂 大试管、滴管、刻度吸量管大试管、滴管、刻度吸量管 0.5酪蛋白醋酸钠溶液酪蛋白醋酸钠溶液 0.01溴甲酚绿指示剂溴甲酚绿指示剂(指示范围指示范围: pH3.8-5.4) 0.02M HCL溶液溶液、 0.02M NaOH溶液溶液 0.01M醋酸溶液、醋酸溶液、0.10M醋酸溶液、醋酸溶液、 1.00M醋酸溶液醋酸溶液6 蛋白质的两性反应（蛋白质的两性反应（1
3、 1）实验步骤实验步骤取一干净试管取一干净试管酪蛋白液酪蛋白液10滴滴溴甲酚绿指示剂溴甲酚绿指示剂3滴滴观察溶液颜色观察溶液颜色并解释现象并解释现象7 蛋白质的两性反应（蛋白质的两性反应（2 2）滴加滴加0.02M HCL溶液溶液边滴加边混匀边滴加边混匀有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象继续滴加继续滴加0.02M HCL溶液溶液边滴加边混匀边滴加边混匀8 蛋白质的两性反应（蛋白质的两性反应（3 3）继续滴加继续滴加0.02M NaOH溶液溶液边滴加边混匀边滴加边混匀有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化
4、有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象继续滴加继续滴加0.02M NaOH溶液溶液边滴加边混匀边滴加边混匀9 溶液呈溶液呈蓝色蓝色n 蛋白质的两性反应蛋白质的两性反应(1)(1)实验结果实验结果 酪蛋白溶液呈碱性酪蛋白溶液呈碱性 (pH5.4)(pH5.4)，使溴甲酚绿，使溴甲酚绿指示剂显蓝色指示剂显蓝色10 H H+ + ，沉淀，沉淀 n 蛋白质的两性反应蛋白质的两性反应(2)(2) 出现最大量沉淀时出现最大量沉淀时, ,说说明到达了酪蛋白的等电点明到达了酪蛋白的等电点 溶液由溶液由蓝色蓝色变成变成浅绿色浅绿色（3.83.8pHp
5、H5.45.4）11 继续加酸，继续加酸，HH+ + 继续增继续增大，大，pHpHpIpI。酪蛋白所带。酪蛋白所带正电荷不断增加，同电相正电荷不断增加，同电相斥，沉淀溶解斥，沉淀溶解 沉淀完全溶解时，溶沉淀完全溶解时，溶液显液显黄色黄色(pH3.8)(pH3.8)12 OH OH- - ，沉淀，沉淀 n 蛋白质的两性反应蛋白质的两性反应(3)(3) 出现最大量沉淀时出现最大量沉淀时, ,说说明到达了酪蛋白的等电点明到达了酪蛋白的等电点 溶液由溶液由黄色黄色变成变成浅绿色浅绿色（3.83.8pHpH5.45.4）13 继续加碱，继续加碱，OHOH- - 继续继续增大，增大，pHpHpIpI。酪蛋
6、白所。酪蛋白所带负电荷不断增加，同电带负电荷不断增加，同电相斥，沉淀溶解相斥，沉淀溶解 沉淀完全溶解时，溶沉淀完全溶解时，溶液显液显蓝色蓝色(pH(pH5.4)5.4)14结论结论 1 1：n 酪蛋白的等电点在酪蛋白的等电点在pH3.8-5.4pH3.8-5.4之间之间n pH= pI pH= pI时，蛋白质溶解度最小时，蛋白质溶解度最小n 蛋白质是两性电解质蛋白质是两性电解质15 取取7 7支支同样规格同样规格的干燥试管，精确加入各试剂的干燥试管，精确加入各试剂试管号码试管号码1 12 23 34 45 56 67 7蒸馏水蒸馏水2.42.43.23.23.03.01.51.5 2.752.
7、75 3.383.381.00M1.00M醋酸醋酸1.61.60.80.80.1M0.1M醋酸醋酸4.04.01.01.00.01M0.01M醋酸醋酸2.52.5 1.251.25 0.620.62pHpH3.53.53.83.84.14.14.74.75.35.35.65.65.95.9 酪蛋白等电点的测定酪蛋白等电点的测定注：单位均为注：单位均为mL16 向向每每个个试试管管中中各各加加0.5%0.5%酪酪蛋蛋白白溶溶液液20滴滴， 加一管，立即混匀一管加一管，立即混匀一管 静置静置3030分钟后，以分钟后，以0 0、+ +、+、+、+表示各管的混浊度，并指出哪一种表示各管的混浊度，并指出
8、哪一种pHpH是酪蛋是酪蛋白的等电点白的等电点171 12 23 34 45 56 67 7沉淀量沉淀量0 0+ +0 00 0n 酪蛋白等电点的测定酪蛋白等电点的测定1234567实验结果实验结果18结论结论 2 2：n 4 4号号试管沉淀量最多试管沉淀量最多n 说明说明4 4号管溶液的号管溶液的pHpH值为酪蛋值为酪蛋白的等电点，即白的等电点，即pI=4.7pI=4.7u 什么是蛋白什么是蛋白质的等的等电点？点？u 在等在等电点点时，蛋白，蛋白质溶液溶液为什什么容易么容易发生沉淀？生沉淀？思考题思考题20 实验项目实验项目 实验原理实验原理 试剂和器材试剂和器材 操作方法（主要步骤）操作方法（主要步骤） 结果分析结果分析 思考题思考题 实验三实验三 凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾铁氰化钾预预 习习22
