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1、基因表达与调控真核表达_昆虫杆状病毒表达系统1向上教学真核表达系统的种类和常用载体真核表达系统的种类和常用载体1.真核表达系统的种类真核表达系统的种类酵母酵母丝状真菌丝状真菌昆虫昆虫哺乳动物细胞哺乳动物细胞转基因动物转基因动物植物反应器植物反应器2.真核表达载体真核表达载体质粒：真核表达元件、质粒：真核表达元件、真核抗性真核抗性病毒载体：改建后病毒载体：改建后SV40病毒病毒腺病毒腺病毒反转录病毒反转录病毒痘苗病毒痘苗病毒2向上教学SV40病毒SV40(Simian vacuolating virus 40 or Simian virus 40)是猴空泡病毒40，猿猴病毒40或猴病毒40的缩写
2、，多瘤病毒科，这是在人类和猴子都发现的致瘤病毒。SV40病毒的基因组是一种环形双链的DNA，基因组5.2kb，病毒的直径45nm，病毒成熟部位细胞核，无被膜，62个核壳粒亚单位，这种大小很适于基因操作。同时它也是第一个完成基因组DNA全序列分析的动物病毒。3向上教学以单纯疱疹病毒为例。（1）病毒与细胞结合；（2）病毒进入细胞，去包膜；（3）脱壳；（4）病毒DNA进入细胞核；（5）病毒基因组复制，合成子代病毒及病毒mRNA；（6）以病毒基因转录的mRNA进入细胞质；（7）病毒mRNA翻译病毒子代蛋白，包括早期蛋白和晚期蛋白；（8）装配子代病毒；（9）出核，同时披上包膜；（10）释放到胞外病毒复制
3、（SV40示例）4向上教学病毒基因组的结构特点病毒基因组的结构特点病毒基因组大小相差较大病毒基因组大小相差较大,与细菌或真核细胞相比，病毒与细菌或真核细胞相比，病毒的的基因组很小基因组很小 病毒基因组可以由病毒基因组可以由DNA组成，也可以由组成，也可以由RNA组成组成 多数多数RNA病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成 ，病，病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的 ，噬菌体（细胞病，噬菌体（细胞病毒）的基因是连续的；而真核细胞病毒的基因是不连续的毒）的基因是连续的；而真核细胞病毒的基因是不连续的 ，无内含子无内含子基因重叠基
4、因重叠即同一段即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子，病毒基因组分子，病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的基因序列中功能上相关的蛋白质的基因或或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位位,形成一个功能单位或转录单元形成一个功能单位或转录单元 ，多顺反子多顺反子除了反转录病毒以外，一切病毒基因组都是除了反转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体单倍体，每个，每个基因在病毒颗粒中只出现一次基因在病毒颗粒中只出现一次 5向上教学构建真核表达系统构建真核表达系统_细胞必需表达元件细胞必需表达元件原核原核D
5、NA序列序列启动子启动子 增强子增强子 拼接信号拼接信号终止子和多聚腺苷化信号终止子和多聚腺苷化信号筛选标记筛选标记动物病毒基因序列动物病毒基因序列6向上教学病毒载体优点病毒载体优点真核细胞可识别的启动子真核细胞可识别的启动子报告基因报告基因感染周期，可持续复制感染周期，可持续复制部分载体可整合入基因组部分载体可整合入基因组部分载体本身带有完整的部分载体本身带有完整的复制及表达元件复制及表达元件部分载体具有宿主细胞特部分载体具有宿主细胞特异性异性识别受体识别受体假病毒颗粒假病毒颗粒杆状病毒及其基因组模型7向上教学昆虫杆状表达系统简介杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群 ,发现最早 、研究最多且实
6、用意义很大的昆虫病毒。20世纪80年代以来由于杆状病毒表达载体系统（baculovirus expression vector system，BEVS）的建立 ,已被公认为是当今基因工程四大表达系统之一 。该系统具有许多优点,如多角体启动子控制下的高效表达 ,完善的转译后加工修饰 ,较易从无血清培养上清中纯化的蛋白,无内毒素污染等。杆状病毒载体系统主要分为两大类,一类是用于表达单个外源基因的载体,另一类是多元表达载体,用于插人并表达2个或多个外源基因8向上教学杆状病毒杆状病毒_昆虫表达系统昆虫表达系统杆状病毒基因组：闭环双链杆状病毒基因组：闭环双链DNA，88-166kb启动子：杆状病毒科核多
7、角体病毒的启动子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白强启动子多角蛋白强启动子表达系统（两种）表达系统（两种）杆状病毒表达系统（杆状病毒表达系统（BEVS）家蚕核型多角体病毒家蚕核型多角体病毒-家蚕表达系统家蚕表达系统宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、脉翅宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、脉翅目、毛翅目的目、毛翅目的600多种昆虫多种昆虫克隆基因方法：转移载体克隆基因方法：转移载体共转染共转染同源重组同源重组空斑筛选空斑筛选纯化纯化重组病毒重组病毒9向上教学昆虫杆状病毒表达系统的分子基础目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 (Ac MNPV)、 家蚕核
8、多角体病毒(BmNPV)、 黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒(OpMNPV)、 舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒( Ld MNPV)、 甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒( Se MNPV)、 棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)以及斜纹夜蛾核型多角体病毒( SplM t NPV)杆状病毒在其生活史中共有两种形式的表型存在,在感染的初期( 0 24h), 主要以细胞释放型病毒粒子( cell-released virus , CRV)为主, 也称为胞外型病毒( extracel lular vir us , ECV)或出芽型病毒 ( Budded vir us , BV); 在感染的晚期主要以包埋型病毒( oc
9、clude d vir us , OV)的形式存在。杆状病毒的这两种表型的形态、 蛋白组成、 病毒囊膜的来源、 感染组织特异性以及病毒入侵宿主细胞的方式都不相同。由于两种表型的病毒在结构组成上的差异, 所以杆状病毒在不同的时期需要表达不同类型的蛋白来满足病毒颗粒不同形式的组装。昆虫杆状病毒的基因表达共分为 4个时期: 极早期、 早期、 晚期、 迟晚期。4个时期的基因一环扣一环,按时间先后, 以级联方式严格制约。早期表达的基因有 ie- 1、 me53、 pe38、 ie- 2等, 晚期表达的基因有 vp39 、vp80、 polh、 p10等, 这些不同的基因所表达的蛋白各自具有不同的功能,
10、有些表达产物具有调控的功能, 而有些仅仅只具有结构蛋白的作用。在杆状病毒所表达的一系列蛋白中,有一类蛋白具有较高的表达量,并且均为病毒基因组复制所非必需, 其中最具代表性的有多角体蛋白与 P10蛋白, 均属于晚期表达的蛋白,受晚期启动子的调控。昆虫的杆状病毒表达系统正是利用了这类蛋白的优点, 从而提供了外源 DNA插入座位。10向上教学杆状病毒表达系统优点杆状病毒表达系统优点容量大：能插入容量大：能插入12kb的外源基因的外源基因高表达：采用的高表达：采用的polh基因启动子是目前所基因启动子是目前所知的最强的真核启动子；产物对宿主影响知的最强的真核启动子；产物对宿主影响小；产物可结晶小；产物
11、可结晶高效：可同时表达多个基因高效：可同时表达多个基因安全：杆状病毒对脊椎动物无病原性安全：杆状病毒对脊椎动物无病原性具加工修饰功能：昆虫细胞属较高等真核细具加工修饰功能：昆虫细胞属较高等真核细胞胞家蚕表达系统中，家蚕易饲养家蚕表达系统中，家蚕易饲养11向上教学表位标记与构建重组体注意事项表位标记与构建重组体注意事项表位：抗原决定簇即抗原表位：抗原决定簇即抗原分子于一特定抗体结合的分子于一特定抗体结合的化学基团，一般由少至几化学基团，一般由少至几个氨基酸的多肽组成个氨基酸的多肽组成用于重组用于重组DNA技术的示踪、技术的示踪、分析、纯化（亲和）分析、纯化（亲和）优点优点用一种抗体可鉴别不同重组
12、用一种抗体可鉴别不同重组蛋白蛋白不影响蛋白功能不影响蛋白功能有利于研究蛋白功能有利于研究蛋白功能常用表位：常用表位：6His；FLAG；LZ等等使用常用密码子使用常用密码子注意克隆位点（限制注意克隆位点（限制性酶切位点）相符性酶切位点）相符5端加上起始密码子端加上起始密码子ATG3端加上终止密码子端加上终止密码子可插入蛋白酶切位点可插入蛋白酶切位点基因，以利于产生天基因，以利于产生天然蛋白然蛋白其他常规构建载体的其他常规构建载体的注意点注意点12向上教学基因导入的各种方法基因导入的各种方法光穿孔法：激光；悬浮细胞光穿孔法：激光；悬浮细胞冲击波：活体局部的基因转移冲击波：活体局部的基因转移基因枪
13、法：即微粒轰击；动物细胞，更适用于植基因枪法：即微粒轰击；动物细胞，更适用于植物细胞物细胞穿孔法：脉冲电场；穿孔法：脉冲电场；Cytomix缓冲液；缓冲液；70%细胞细胞死亡时效率最高死亡时效率最高磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法脂质体法：脂质体法：Lipofectin；阳离子；阳离子抗体转染法：抗抗体转染法：抗CD3，CD34或表面免疫求蛋白或表面免疫求蛋白其他：超声波法；微注射法原生质体融合法；反其他：超声波法；微注射法原生质体融合法；反转录病毒感染法转录病毒感染法13向上教学表达产物的检测技术表达产物的检测技术Western印迹法印迹法免疫学方免疫学方法法抗原抗原-抗体反应抗体反应荧光显微镜
14、法荧光显微镜法表位标记的表位标记的抗体与直接抗体进行荧光标记抗体与直接抗体进行荧光标记免疫学方法免疫学方法Western印迹法印迹法蛋白样品制备蛋白样品制备 SDS-PAGE（按按分子量大小）分子量大小）电转移电转移一抗（特一抗（特异性）异性）二抗二抗显色显色敏感度：敏感度：1-5ng1-5ng14向上教学杆状病毒-昆虫表达系统技术路线BEVS通常由转移载体、亲本病毒和重组介质三部分组成,其技术路线分以下几步:先将外源片段克隆到载体质粒中, 置于杆状病毒启动子控制之下, 上下游各有一段与亲本病毒DNA 相匹配的侧翼序列, 构建成转移载体; 然后把转移载体和野生型病毒共转染入昆虫细胞,通过同源重
15、组将外源片段插入到病毒基因组,再以特定的筛选标记和方法获得重组病毒。由于病毒原来的非必需区段被外源片段取代, 当重组病毒在受体细胞内复制时,外源片段也得到了表达。最后空斑纯化重组病毒, 扩大培养,分离、 纯化所表达的外源蛋白。技术路线英文参考文献：CHRIS TOPHER D R. Baculovirus expression protocols M . Totowa: Humana Press Inc, 1995: 12-23.15向上教学重组杆状病毒表达载体的构建16向上教学杆状病毒表达系统的应用1，基础研究如为功能基因组学研究提供种类繁多、数量庞大的蛋白2.开发医用疫苗和药物HIV疫苗的
16、研究与开发，禽流感病毒疫苗生产；家蚕宿主BEVS生产重组多态药物，或生产鱼疫苗再用蚕蛹饲喂鱼，改善鱼类的食用品质3.农业生物杀虫剂家蚕重组NPV（核多角体病毒）用作生物杀虫剂的突出优点是对人体安全，不伤害害虫的天敌，不污染环境4.基因治疗最近几年来,杆状病毒在小鼠和大鼠肝骨骼肌和中枢神经系统的基因转移中取得成功基因治疗参考文献：（小鼠和大鼠肝）Hofmann C. ,Strauss M. Gene. Therapy, 1998,5(4): 531536.（小鼠骨骼肌）Pieroni L. ,Maione D. ,La Monica. N. Hum. Gene Therapy, 2001,12(
17、8): 871 881.（小鼠中枢神经系统）Sarkis C. , Serguera C. , Petres S. , Buchet D. ,Ridet J.L. et al. J.Proc. Natl. Acad. Sci.USA,2000,97(26):1463814643.17向上教学杆状病毒表达系统的局限性1.无法进行连续性（高）表达2.糖基化方式与哺乳动物存在一定差异3.糖侧链甘露糖的成分较高，而复合寡糖缺乏4.功能基因组学的研究仍然比较薄弱5.有关病毒晚期的高表达和调控机制等仍不够明了6.酵母筛选系统比昆虫细胞重组介质相对更有优势，重组病毒与原病毒的混合增加筛选难度18向上教学杆状
18、病毒表达系统的部分改进1.用病毒早期启动子与晚期启动子以及嵌合与修饰启动子，让杆状病毒系统持续表达2.通过亲本病毒的线性化，非必需基因的缺失以增加外源基因表达途径来大大提高重组病毒筛选效率与稳定性3.杆状病毒穿梭载体bacmid（Baculovirus plasmid，杆状病毒质粒）的构建，可被修饰并在原核细胞与真核细胞之间穿梭表达。 Bac-to-Bac system。这一方法利用了转座酶将外源基因转座到病毒基因组的特异性位点, 重组后的病毒基因组现在被俗称为 Bacmid 。在 Bacmid中, 外源基因被核多角体启动子控制, 并包含了不同的抗性基因及 LacZ缺失标记, 极大地方便了重组病毒的筛选及鉴定。4.病毒滴度测定方法的改进，传统的病毒滴度测定方法是利用噬菌斑试验, 这一方法极为突出的缺点是所需时间较长，报告蛋白来进行滴度的测定, 如绿色荧光蛋白及半乳糖苷酶等。这些方法共有的缺点是需要额外表达一个蛋白。用western印迹法，荧光显微镜法19向上教学双穿梭载体bacmid 的制作（Recombinant_Baculovirus_Generation）（利用Bac-to-Bac系统表达棉蚜的乙酰胆碱酯酶，董双林，韩召军，动物学研究，2006，27（1），75-80）20向上教学
