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1、生物芯片是八十年代末在生命科学生物芯片是八十年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要是指通过微加工技术和微电子它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、质、DNADNA以及其他生物组分的准确、快以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。速、大信息量的检测。 世世界界著著名名商商业业杂杂志志财财富富对对基基因因生生物物芯芯片片领领域域非非常常看看好好，它它在在其其19971997年年的的3 3月月3131刊刊中中讲讲到到：
2、“微微处处理理器器使使我我们们的的经经济济发发生生了了根根本本改改变变、给给人人类类带带来来了了巨巨大大的的财财富富、改改变变了了我我们们的的生生活活方方式式。然然而而，生生物物芯芯片片给给人人类类带带来来的的影影响响可可能能会更大会更大.”酵酵母母全全基基因因组组基基因因芯芯片片第一节第一节 生物芯片简介生物芯片简介1.1生物芯片的定义生物芯片的定义生物芯片生物芯片是指通过机器人自动印迹或光引是指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列，根据分子间的膜上制造的生物分子微阵列，根据分子间的特异性相互作用的原理，
3、将生命科学领域中特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现对细胞、蛋白对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的准确、快速、大信息量的检测。的检测。基因芯片基因芯片又称又称DNA芯片或芯片或DNA阵列，阵列，是生物芯片的一种类型，它是将是生物芯片的一种类型，它是将DNA分子分子固定于支持物上，并与标记的样品杂交，固定于支持物上，并与标记的样品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知样品中断样品中靶分子的数量，进而得知样
4、品中mRNA的表达量，也可以进行基因突变体的表达量，也可以进行基因突变体的检测和基因序列的测定。的检测和基因序列的测定。1.2基因芯片分析流程基因芯片分析流程 基因芯片分析的过程主要包括样品及其标记基因芯片分析的过程主要包括样品及其标记处理、芯片制作、分子杂交、信号的检测和数据处理、芯片制作、分子杂交、信号的检测和数据处理及分析等几个步骤。处理及分析等几个步骤。基因芯片的理论基础：基因芯片的理论基础：传统的传统的Southern blot和和Northern blot是将受检测是将受检测的样本固定在尼龙膜上，再利用特定的已知探针的样本固定在尼龙膜上，再利用特定的已知探针来检测样本中是否存在互补
5、的来检测样本中是否存在互补的DNA序列。序列。基因芯片的核心原理与基因芯片的核心原理与Southern blot和和Northern blot相同，只是相反将各种探针固化到基质上，用相同，只是相反将各种探针固化到基质上，用以检测受检样品中与各种探针互补的核酸物质的以检测受检样品中与各种探针互补的核酸物质的变化。变化。1 1 样品制备样品制备2 DNA2 DNA提取提取3 3 荧光标记荧光标记4 4 分子杂交分子杂交5 5 信号检测信号检测6 6 点阵分析点阵分析1.3基因芯片技术的特点基因芯片技术的特点1、基因芯片的优点、基因芯片的优点1 1）高通量高通量性性：可同时并行分析成千上万种分子。：
6、可同时并行分析成千上万种分子。节省时间，并减少系统误差。节省时间，并减少系统误差。2 2）微型化微型化3 3）高度高度自动化自动化4 4）结果重现性和准确性更高结果重现性和准确性更高（基因芯片能在同（基因芯片能在同一张芯片上同时对实验组和对照组材料进行杂一张芯片上同时对实验组和对照组材料进行杂交分析，这样就实现了交分析，这样就实现了平行化平行化操作，避免了各操作，避免了各种误差，使实验结果具有可比性）种误差，使实验结果具有可比性）2、基因芯片的缺点、基因芯片的缺点基因芯片技术体系的建立和使用需要较基因芯片技术体系的建立和使用需要较大的投入。大的投入。（但是，相对于传统的表达分析技术而（但是，相
7、对于传统的表达分析技术而言，单个基因分析的成本仍是较低的。）言，单个基因分析的成本仍是较低的。）第二节第二节 生物芯片的分类生物芯片的分类2.1按载体材料分类按载体材料分类玻璃芯片玻璃芯片硅芯片硅芯片陶瓷芯片陶瓷芯片玻璃芯片具有易得、荧光背景低、应用玻璃芯片具有易得、荧光背景低、应用方便等优点，目前在国际上广泛使用。方便等优点，目前在国际上广泛使用。2.2按点样方式分类按点样方式分类1、原位合成芯片原位合成芯片（将半导体中的光蚀刻技术运用（将半导体中的光蚀刻技术运用到到DNA合成化学中，以单核苷酸或其他分子大分合成化学中，以单核苷酸或其他分子大分子为底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸）子为底物
8、，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸）2、微矩阵芯片微矩阵芯片（目前应用最广泛的基因芯片之一。目前应用最广泛的基因芯片之一。具有高密度、制作简便的特点。其是将用具有高密度、制作简便的特点。其是将用PCR或或化学合成等方法得到的化学合成等方法得到的DNA或寡核苷酸片段用针或寡核苷酸片段用针点或喷点的方法直接排列到玻片等载体上，从而点或喷点的方法直接排列到玻片等载体上，从而制备成芯片。）制备成芯片。）3、电定位芯片电定位芯片（利用静电吸附的原理将（利用静电吸附的原理将DNA快快速定位在硅基质、导电玻璃上。）速定位在硅基质、导电玻璃上。）2.3按芯片固定的生物分子类型分类按芯片固定的生物分子类型分类（1）
9、基因芯片或）基因芯片或DNA芯片芯片（2）蛋白质芯片）蛋白质芯片（3）芯片实验室（）芯片实验室（lab-on-chip）将一个实验的各个步骤微缩于一个芯片上将一个实验的各个步骤微缩于一个芯片上芯片实验室（Lab-on-a-chip）或称微全分析系统（Miniaturized Total Analysis System,-TAS）是指把生物把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检测等基本操作单位集成或基本集成一块几平方厘米的芯片上，测等基本操作单位集成或基本集成一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对
10、其产物进行分析的用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种一种技术技术。 芯片实验室的特点: 其一、集成性。集成性。目前一个重要的趋势是：集成的单元部件越来越多，且集成的规模也越来越大。所涉及到的部件包括：和进样及样品处理有关的透析、膜、固相萃取、净化；用于流体控制的微阀（包括主动阀和被动阀），微泵（包括机械泵和非机械泵）；微混合器，微反应器，另外还有微通道和微检测器等。 其二、分析速度极快。分析速度极快。Mathies研究小组在一个半径仅为8厘米长的园盘上集成了384个通道的电泳芯片。他们在325秒内检测了384份与血色病连锁的H63D 突变株（在人HFE基因上）样品，每个样
11、品分析时间不到一秒钟。 其三、高通量。高通量。 其四、能耗低，物耗少，污染小。能耗低，物耗少，污染小。每个分析样品所消耗的试剂仅几微升至几十个微升，被分析的物质的体积只需纳升级或皮升级。 其五、廉价，安全。廉价，安全。无论是化学反应芯片还是分析芯片由于上述特点随着技术上的成熟，其价格将会越来越廉价。针对化学反应芯片而言，由于化学反应在微小的空间中进行，反应体积小，分子数量少，反应产热少，又因反应空间体表面积大，传质和传热的过程很快，所以比常规化学反应更安全。 2.4按芯片使用功能分类按芯片使用功能分类（1）测序芯片）测序芯片（2）表达谱芯片）表达谱芯片（3）基因差异表达分析芯片）基因差异表达分
12、析芯片一组寡核苷酸探针一组寡核苷酸探针TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由杂交位置确定的一组由杂交位置确定的一组核酸探针序列核酸探针序列GTTAGATC杂交探针组杂交探针组TATGCAATCTAG重组的互补序列重组的互补序列靶序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC ATACGTTA测序芯片测序芯片基因表达谱芯片基因表达谱芯片基基因因差差异异表表达达分分析析芯芯片片第三节第三节 基因芯片的制作基因芯片的制作固相介质固相介质 硅片、二氧化硅、玻璃、尼龙膜、塑料等。硅片、二氧化硅、玻璃、
13、尼龙膜、塑料等。靶片段靶片段 DNADNA、寡核苷酸、寡核苷酸、RNARNA等。等。探探 针针 mRNAmRNA，或是以，或是以mRNAmRNA为模板合成的为模板合成的cDNAcDNA。标记物标记物 常采用常采用荧光剂荧光剂（如（如Cy3Cy3、Cy5Cy5）；）；同位素同位素等。等。3.1用于芯片制作的用于芯片制作的DNA样品的来源样品的来源（1）从细胞或组织中提取）从细胞或组织中提取mRNA后反转录成后反转录成cDNA文库，经测序及生物信息学分析得到代表文库，经测序及生物信息学分析得到代表各个基因的各个基因的DNA序列，用序列，用PCR扩增技术或扩增技术或DNA固相结合技术来获取人们所期望
14、的各种基因片段；固相结合技术来获取人们所期望的各种基因片段；（2）利用基因组测序数据，经生物信息学分析）利用基因组测序数据，经生物信息学分析得到代表各个基因的数据，在利用得到代表各个基因的数据，在利用PCR技术或技术或DNA固相结合技术来获取人们所期望的各种基因固相结合技术来获取人们所期望的各种基因片段。片段。3.2生物芯片的制作方法生物芯片的制作方法生物芯片生物芯片微阵列的微阵列的制作技术制作技术按照按照制作方制作方法法可分为：可分为：原位合成原位合成和和预合成后点样预合成后点样。原位合成法原位合成法是由点样系统将探针的组成是由点样系统将探针的组成部分逐步转移到基体上，同时实现探针合成部分逐
15、步转移到基体上，同时实现探针合成和转移的目的。和转移的目的。预合成后点样预合成后点样是指制备芯片微阵列前，是指制备芯片微阵列前，要固定的探针已经合成好，点样系统需要做要固定的探针已经合成好，点样系统需要做的就是把这些合成好的样品涂印或喷涂在基的就是把这些合成好的样品涂印或喷涂在基体上。体上。1、原位合成、原位合成光刻光刻DNA合成法合成法（将半导体工业中的光刻技术（将半导体工业中的光刻技术和和DNA化学合成相结合，把光不稳定保护基团保化学合成相结合，把光不稳定保护基团保护的护的4种种DNA模块固定在玻片上，通过光脱保护，模块固定在玻片上，通过光脱保护，用少量的保护寡核苷酸和试剂按照设计的序列进
16、行用少量的保护寡核苷酸和试剂按照设计的序列进行DNA合成。）合成。） 优点：优点：合成的密度和精度优于后两种方法。合成的密度和精度优于后两种方法。缺点：缺点：需要花费大量的时间去设计和制造需要花费大量的时间去设计和制造价格很高的照相掩蔽网。价格很高的照相掩蔽网。1 1 通过光刻掩膜曝光通过光刻掩膜曝光2 2 去保护区域被激活去保护区域被激活3 3 固相化合成固相化合成1 1个碱基个碱基4 4 通过另一个光刻掩膜曝光通过另一个光刻掩膜曝光5 5 引入另一个碱基引入另一个碱基6 6 重复这一步骤重复这一步骤2、预合成后点样、预合成后点样（1）接触点样法）接触点样法（将样品直接点在基体（将样品直接点
17、在基体上）上） 优点：优点：仪器结构简单、容易研制，是仪器结构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器。一种快速、经济、多功能的仪器。缺点：缺点：每个样品都必须是合成好、经每个样品都必须是合成好、经过纯化、事先保存的。过纯化、事先保存的。22022202芯片点样仪芯片点样仪生产商生产商 Bio-RadBio-Rad性能介绍性能介绍 分辨率：分辨率：1.25um(x1.25um(x，y y轴轴) )和和0.25um(Z0.25um(Z轴轴) ) ， 重复性：重复性：3um3um 球面精确性：球面精确性：l0uml0um。一次制成芯片数：一次制成芯片数：126126块芯片块芯片 每块玻片点样
18、量每块玻片点样量82,00082,000个点个点（2）喷墨法）喷墨法（通过压电晶体或其他推进（通过压电晶体或其他推进式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。）璃载体上。）该法所需的样品都必须是合成好的该法所需的样品都必须是合成好的纯样品（纯样品（cDNA、染色体、染色体DNA和抗体）。和抗体）。与接触点样法不同之处在于喷嘴不与接触点样法不同之处在于喷嘴不与芯片接触。与芯片接触。点样法首先按常规方法制备点样法首先按常规方法制备cDNAcDNA（或寡核苷酸）探针库，（或寡核苷酸）探针库，然后通过特殊的针头和微喷头然后通过特殊的针头和微喷头, , 分别把不同的探
19、针溶液，分别把不同的探针溶液，逐点分配在玻璃、尼龙或者其它固相基底表面上不同位点逐点分配在玻璃、尼龙或者其它固相基底表面上不同位点, ,并通过物理和化学的结合使探针被固定于芯片的相应位点。并通过物理和化学的结合使探针被固定于芯片的相应位点。 玻璃基质玻璃基质基因芯片基因芯片微微 点点 阵阵制备系统制备系统3.3DNA分子在刚性表面的固定分子在刚性表面的固定制作生物芯片的载体材料必须符合下列要制作生物芯片的载体材料必须符合下列要求：求：（1）载体表面必须适应透射或反射光的）载体表面必须适应透射或反射光的测量；测量；（2）使单位载体上结合的生物分子达到）使单位载体上结合的生物分子达到最佳容量；最佳
20、容量；（3）载体应当是惰性的和有足够的稳定）载体应当是惰性的和有足够的稳定性。性。基因芯片制作的关键就是如何将大量的探基因芯片制作的关键就是如何将大量的探针分子固定于支持物上，并保持探针分子针分子固定于支持物上，并保持探针分子的构像处于自然状态，使探针的构像处于自然状态，使探针 DNA DNA 分子能分子能自由地与样品分子进行杂交。自由地与样品分子进行杂交。第四节第四节 基因芯片的杂交及结果分基因芯片的杂交及结果分析析4.1探针的标记探针的标记标记的方法通常是在反转录的底物中加标记的方法通常是在反转录的底物中加入带有标记基团的寡核苷酸单体，通过反入带有标记基团的寡核苷酸单体，通过反转录将标记分
21、子渗入转录将标记分子渗入cDNA分子中。分子中。mRNA反转录标记方法直接影响反转录标记方法直接影响DNA芯芯片分析结果的准确性及重现性。片分析结果的准确性及重现性。4.2杂交杂交在一定条件下，分子间氢键的断裂在一定条件下，分子间氢键的断裂与恢复是与恢复是DNA/DNA、DNA/RNA分分子间选择性结合的根本动力，这一过子间选择性结合的根本动力，这一过程称之为程称之为杂交杂交。与经典分子杂交的区别：与经典分子杂交的区别：1.杂交时间短，杂交时间短，30分钟内完成分钟内完成2.可同时平行检测许多基因序列可同时平行检测许多基因序列影响杂交反应的因素：影响杂交反应的因素：靶分子浓度、探针浓度、靶分子
22、和探靶分子浓度、探针浓度、靶分子和探针的序列组成、盐浓度及杂交温度和时间针的序列组成、盐浓度及杂交温度和时间等。等。4.3芯片结果读取与扫描仪芯片结果读取与扫描仪生物芯片的扫读生物芯片的扫读（扫描）是指将与目的（扫描）是指将与目的DNA（或（或RNA）杂交后、或与目的抗原、抗）杂交后、或与目的抗原、抗体、或受体等目的靶分子反应结合后的生物体、或受体等目的靶分子反应结合后的生物芯片上成千上万个点阵的生物反应结果阅读芯片上成千上万个点阵的生物反应结果阅读出来，转变成为可供计算机处理的数据。出来，转变成为可供计算机处理的数据。荧光标记的生物芯片扫描仪按其原理与结构荧光标记的生物芯片扫描仪按其原理与结
23、构可以分为可以分为激光系统扫描仪激光系统扫描仪和和CCD系统扫描仪系统扫描仪。基因芯片杂交结果要用专用的扫描系统基因芯片杂交结果要用专用的扫描系统读取。读取。BBACDE放大器放大器数模转数模转换器换器计算机计算机A:激光器激光器 B:滤光片滤光片 C:二色镜二色镜 D:反光镜反光镜 E:关栅关栅 基因芯片扫描结果基因芯片扫描结果不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记的核酸分子数的差异。红的核酸分子数的差异。红黄黄绿绿兰兰紫紫基因芯片荧光侦测仪基因芯片荧光侦测仪 高密度微点阵检测扫描系统高密度微点阵检测扫描系统高密度微点阵分析软件高密度微点阵分析软
24、件 图象分析系统图象分析系统4.4生物芯片的软件系统与数据处理生物芯片的软件系统与数据处理 当从芯片发出的荧光转换成数字输当从芯片发出的荧光转换成数字输出后，数据文件就被定量和翻译，通过出后，数据文件就被定量和翻译，通过重叠芯片像线栅，软件对芯片上的每个重叠芯片像线栅，软件对芯片上的每个点计算平均密度值，从而完成定量，通点计算平均密度值，从而完成定量，通过对芯片上实验点和对照点的比较，过对芯片上实验点和对照点的比较，选选出杂交点，并定量。出杂交点，并定量。 一个完整的生物芯片配套软件应一个完整的生物芯片配套软件应该包括该包括生物芯片扫描仪的硬件控制软生物芯片扫描仪的硬件控制软件件、生物芯片的图
25、像处理软件生物芯片的图像处理软件和和数据数据提取或统计分析软件提取或统计分析软件，以及，以及芯片表达芯片表达基因的国际互联网上检索基因的国际互联网上检索和和表达基因表达基因数据库分析和积累数据库分析和积累。第五节第五节 基因芯片的应用基因芯片的应用1、基因表达分析、基因表达分析2、基因型及多态性分析、基因型及多态性分析3、杂交测序、杂交测序4、核酸和蛋白质相互作用的研究、核酸和蛋白质相互作用的研究5、疾病的诊断与治疗、疾病的诊断与治疗6、药物开发、药物开发7、在营养与食品卫生领域的应用、在营养与食品卫生领域的应用8、在环境科学领域中的应用、在环境科学领域中的应用基因芯片在医学领域的应用基因芯片
26、在医学领域的应用一、基因芯片可应用于疾病诊断一、基因芯片可应用于疾病诊断1 1）肿瘤的基因诊断）肿瘤的基因诊断 例：例：AffymetrixAffymetrix公司，把公司，把P53P53基因全长序列基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53P53基基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。2 2）用于诊断遗传性疾病）用于诊断遗传性疾病例：上海联合基因公司开发了例：上海联合基因公司开发了-地中海性贫地中海性贫血的检测芯片血的检测芯片3 3）用于病原体的检出和确定）用于病原体的检出和确定例：西安联尔公司开发了呼吸道病原体
27、诊断例：西安联尔公司开发了呼吸道病原体诊断芯片，可检出多种引起呼吸道感染的病原芯片，可检出多种引起呼吸道感染的病原体。体。二、用于组织配型二、用于组织配型例：上海复旦长江生物医药股份有限公司开例：上海复旦长江生物医药股份有限公司开发了发了HLAHLA分型芯片，目前已在国内各大血站分型芯片，目前已在国内各大血站投入应用。投入应用。三、药物研究三、药物研究检测与疾病相关的基因检测与疾病相关的基因, , 进而用于疾病诊断进而用于疾病诊断目前主要涉及：目前主要涉及：癌症、癌症、心血管疾病、心血管疾病、血液病、血液病、遗传性疾病、遗传性疾病、神经系统疾病、神经系统疾病、部分感染性疾病、部分感染性疾病、免
28、疫反应相关性疾病免疫反应相关性疾病毒物引起的损伤等。毒物引起的损伤等。基因功能分析研究基因功能分析研究 将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同个体不同组织不同细胞周一块芯片上，对来源于不同个体不同组织不同细胞周期不同发育阶段不同分化阶段不同病变不同刺激（包期不同发育阶段不同分化阶段不同病变不同刺激（包括不同诱导不同治疗手段）下细胞内的括不同诱导不同治疗手段）下细胞内的mRNAmRNA或逆转录或逆转录所得的所得的cDNAcDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特异性。进异性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特异性。进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立。行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立。
