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1、PCR技技术及其及其应用用生物化学实验技术1目录PCR的反的反应原理原理PCR的的类型和型和应用用PCR示例示例2 多聚多聚酶链式反式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction) Kary B. MullisKary B. Mullis PCR是由美国科学家是由美国科学家穆利斯提出的一种穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟体外简化条件下模拟DNADNA体内复制的体内复制的DNADNA快速扩增的方法，此技术获得快速扩增的方法，此技术获得19931993年诺贝年诺贝尔化学奖。尔化学奖。3体内体内DNA的复制体系的复制体系DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶（I II
2、 IIII II IIII II IIII II III）拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶解旋酶类解旋酶类解旋酶类解旋酶类SSBSSBSSBSSB 引物引物引物引物dNTP MgdNTP MgdNTP MgdNTP Mg2+2+2+2+5 5 3 3 4Mullis的的PCR构思构思引物引物引物引物DNADNA聚合聚合酶酶DNADNA聚合聚合酶酶特定特定DNADNA片段片段5TaqTaq DNADNA聚合聚合酶酶（thermus aquaticus)thermus aquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性( (%) )温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 1001
3、00 80 60 40 20耐耐热DNA聚合聚合酶Saiki（1988）将耐热）将耐热DNA聚合酶引入聚合酶引入PCR，使利用热变性解链，使利用热变性解链DNA模板可行。模板可行。6PCR反应循环反应循环729494949455PCRPCR循环循环循环循环变性变性变性变性退火退火退火退火延伸延伸延伸延伸7 PCR PCR的指数扩增（的指数扩增（2 2n n）引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5 5 5 5 3 3 3 3 变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火延伸延伸延伸延伸8TaqTaqP1P1P
4、2P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：模板：DNA引物：引物：P1 +P2DNA聚合酶：聚合酶：TaqE原料：原料：dNTP反应缓冲液反应缓冲液10xBuffer辅助因子：辅助因子：Mg2+91）PCR反反应成分成分（1 1）模板）模板）模板）模板单、双、双链DNA均可。均可。不能混有蛋白不能混有蛋白酶、核酸、核酸酶、DNA聚合聚合酶抑制抑制剂、DNA结合蛋白合蛋白类。DNA模板一般模板一般100ng /100 L。模板模板浓度度过高会高会导致反致反应的非特异性增加。的非特异性增加。 PCR反应条件10（2 2）引物）引物）引物）引物浓浓度度度度0.1-0.5 mo
5、l/L 浓度度过高易高易导致模板与引物致模板与引物错配配,反反应特异性下降。特异性下降。（3 3）TaqTaq DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反量增加使反应特异性下降特异性下降;酶量量过少影响反少影响反应产量。量。11（4 4）dNTPdNTP（10mM or 2.5mM 10mM or 2.5mM ）含四种核苷酸含四种核苷酸dATPdATP、dGTPdGTP、dCTPdCTP、dTTPdTTP dNTP浓度取决于度取决于扩增片段的增片段的长度度浓度度过高易高易产生生错误碱基的碱基的掺入入,浓度度过低低则降低反降低反应产量量dNTP可与可与Mg2+结合
6、合,使游离的使游离的Mg2+浓度下降度下降,影响影响DNA聚合聚合酶的活性。的活性。12（5 5） Mg2+ Mg2+是是DNA聚合聚合酶的激活的激活剂。浓度度为0.5-2.5mmol/L。Mg2+浓度度过低会使低会使Taq酶活性活性丧失、失、PCR产量下降；量下降； Mg2+过高影响反高影响反应特异性。特异性。Mg2+可与可与负离子离子结合合,所以反所以反应体系中体系中dNTP、EDTA等的等的浓度影响反度影响反应中游离的中游离的Mg2+浓度。度。132 2）循）循）循）循环环参数参数参数参数(1)(1)变变性性性性 使双使双链DNA解解链为单链94， 30-60秒秒(2) (2) 退火退火
7、退火退火温度由引物温度由引物长度和度和GC含量决定。含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性增加温度能减少引物与模板的非特异性结合合;降降低温度可增加反低温度可增加反应的灵敏性。的灵敏性。14引物引物设计设计：（1)1)序列序列应应位于高度保守区位于高度保守区, ,与非与非扩扩增区无同源增区无同源序列。序列。（2 2）引物）引物长长度以度以15-40 bp15-40 bp为为宜。宜。（3 3）碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布,G+C,G+C占占40-60%40-60%。（4 4）引物内部避免形成二）引物内部避免形成二级结级结构。构。（5 5）两引物）两引物间间避免有互避免有互补补序列。
8、序列。（6 6）引物）引物3 3 端端为为关关键键碱基；碱基；5 5 端无端无严严格限制。格限制。15（3 3）延伸）延伸）延伸）延伸70-75,一般一般为72 延伸延伸时间由由扩增片段增片段长度决定度决定（4 4）循）循）循）循环环次数次数次数次数主要取决于模版主要取决于模版DNA的的浓度度一般一般为25-35次次次数次数过多：多：扩增效率降低增效率降低错误掺入率增加入率增加16 PCR PCR的应用的应用 1、特定、特定DNA片段（基因、片段（基因、调控序列）的控序列）的鉴定、分定、分离或制离或制备。A、DNA B、cDNA 2、基因表达分析（原位、离体）、基因表达分析（原位、离体）A、基
9、因是否表达、基因是否表达B、基因表达水平高低、基因表达水平高低3、基因突、基因突变17基因克隆（）基因克隆（）逆转录酶逆转录酶聚合酶聚合酶mRNAcDNA杂交双链杂交双链PCRPCR扩增扩增181. 细胞胞或或组织固固定定：细胞胞经固固定定和和乙乙醇醇通通透透化化处理理后后便适于一般便适于一般PCR试剂（包括引物和（包括引物和Taq酶）进入入2. PCR扩增增细胞内目的片段胞内目的片段3. 原位原位杂交交检测扩增增产物物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达原位分析基因表达的组织特异性原位分析基因表达的组织特异性原位分析基因表达的组织特异性原位分析基因表达的组织特异性19荧光定量荧光
10、定量荧光定量荧光定量 PCRPCRPCRPCR（real-time PCR)real-time PCR)real-time PCR)real-time PCR)分析基因表达水平分析基因表达水平分析基因表达水平分析基因表达水平 通通过荧光染料或光染料或荧光光标记的特异性的探的特异性的探针,对PCR产物物进行行标记跟踪跟踪,实时在在线监控反控反应过程程,结合合相相应的的软件可以件可以对结果果进行分析行分析,计算待算待测样品的初品的初始模板量。始模板量。内掺式染料内掺式染料SYBR GreenSYBR Green I序列特异性探针序列特异性探针Taqman Taqman Molecular Beac
11、onsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特异性探针引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) Amplifluor (Intergen)205353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I 21反向反向反向反向PCR (reverse PCR) PCR (reverse PCR) 扩扩增已知序列两增已知序列两增已知序列两增已知序列两侧侧的未知序列的未知序列的未知序列的未知序列 用反向的互用反向的互补引物来引物来扩增两引物以外的增两引物以外的D
12、NA片段，片段，对某个已知某个已知DNA片段两片段两侧的未知序列的未知序列进行行扩增。增。未知序列未知序列未知序列未知序列已知序列已知序列22已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶23 实时荧光定量实时荧光定量PCR仪仪梯度梯度PCR仪仪普通普通PCR仪仪24251 1、材料：含、材料：含0.3Kb0.3Kb插入片段的克隆载体插入片段的克隆载体2 2、仪器：微量移液器及吸头、仪器：微量移液器及吸头、PCRPCR仪及仪及PCRPCR管管 琼脂糖凝胶电泳设备琼脂糖凝胶电泳设备3 3、试剂：、试剂：1010X XPCRPCR 反应缓冲液反应缓冲液 25m
13、mol/L MgCl25mmol/L MgCl2 2 10mmol/L dNTP10mmol/L dNTP 10 10mol/L mol/L 引物引物1 1和引物和引物2 2二、实验材料、仪器和二、实验材料、仪器和试剂试剂261.1.反应体系（反应体系（5050l l体系）：体系）： 10 X PCR反应缓冲液反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10mol/L 引物引物1 10mol/L引物引物2 模板模板DNA TaqE 补充水补充水 三、操作步骤三、操作步骤10 X B10 X P1 P210 X T10 X E 272.2.按照如下体积向按照如下体积向P
14、CRPCR管中按顺序加入各试剂管中按顺序加入各试剂 并混匀：并混匀： 三、操作步骤三、操作步骤10 X Buffer 2.5 L10 X P1 2.5 L10X T 2.5 L10 X E 2.5 L25 L水水 12.5 L10 X P2 2.5 L283.PCR3.PCR扩增程序：扩增程序： 9494 5-10min（预变性）（预变性） 94 30S 55 30S 72 30S 72 5-10min（后延伸）（后延伸） 4 保温保温30Cycles29屏幕显示方式屏幕显示方式30MainRun Enter List Edit File Lid运行已运行已有程序有程序已有程已有程序菜单序菜单
15、删除已删除已有程序有程序新建反新建反应程序应程序编辑已编辑已有程序有程序热盖关热盖关闭调节闭调节31EnterEnter abcdefghi# jklmnopqr# Name #stuvwxyz#In Use! .,-+/():=#Enter PCR1Control MethodBLOCK Sim-Tube输入文件名输入文件名,满满8个字个字符自动生成程序名符自动生成程序名,不不满满8个字符时用个字符时用#终止终止BLOCK:屏幕显示样品台屏幕显示样品台温度温度(样品台温控方式样品台温控方式)Sim-Tube:屏幕显示反应屏幕显示反应液温度液温度(模拟管温控方式模拟管温控方式)Enter PC
16、R1Segment #1 Hold Cycle END选择预变性保温选择预变性保温32循环内第一步温度和时间循环内第一步温度和时间Enter PCR1Hold at 94CHold for 5m0s预变性温度和时间预变性温度和时间Enter PCR1Segment #2Hold Cycle END 3 step PCR循环参数设置循环参数设置Step #194.0C Hold 0m30s循环内步骤数循环内步骤数33Step #1Option？ No yes不需要拓展功能不需要拓展功能Step #255.0C Hold 0m40s循环内第二步温度和时间循环内第二步温度和时间Step #2Opti
17、on？ No yes不需要拓展功能不需要拓展功能Step #372.0C Hold 0m30s循环内第三步温度和时间循环内第三步温度和时间34不需要拓展功能不需要拓展功能设置循环数设置循环数后延伸保温后延伸保温后延伸温度和时间后延伸温度和时间Step #3Option？ No yesTotal Cycle= 35Segment #3Hold Cycle ENDHold at 72.0CHold for 10m0s35Segment #4Hold Cycle END选择反应完后保温选择反应完后保温Hold at 4.0CHold for 99m0s设置反应完后的保温温度设置反应完后的保温温度和时
18、间和时间Segment #5Hold Cycle END终止参数设置终止参数设置Enter PCR1Estimated Run Time：1h53m05sSave？ YES no预计反应时间，程序是否预计反应时间，程序是否保存保存36LidLIDTurn off heatedLid below 9C当当温温度度低低于于9度度时时，热盖自动关闭热盖自动关闭37RunPCR1 PCR2RUN PCR1Use heated lid? Yes NoRUN PCR1Vessel: 0.2TUBE0.5tube plateRUN PCR1Volume(Ul) 50 KRUN PCR1Lid temperature: 19 384.4.反应完成后反应完成后, ,将反应液与凝胶电泳缓冲液按将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀比例混匀, ,上样电泳。上样电泳。三、操作步骤三、操作步骤39The End！40
