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1、 分子肿瘤概论分子肿瘤概论重庆医科大学病理教研室重庆医科大学病理教研室 王娅兰王娅兰 教授教授( (博士生导师博士生导师) )v一、有关肿瘤的根本概念复习一、有关肿瘤的根本概念复习v肿瘤肿瘤tumor, neoplasm)v 基因水平基因水平 v 调控失常调控失常 v 异常增生异常增生 v 新生物新生物v肿瘤生物学行为肿瘤生物学行为-浸润、转移能力浸润、转移能力v 浸润浸润 (invasion)：起源处迁移：起源处迁移v 侵入周围邻近组织侵入周围邻近组织转移(metastasis)：从原发部位血管、淋巴管、体腔它处继续生长与原发瘤同样类型肿瘤 转移瘤或继发瘤 转移的途径转移的途径浸润生长是恶性
2、肿瘤生长的特点，浸润生长是恶性肿瘤生长的特点，也是肿瘤转移过程必经的第一步。也是肿瘤转移过程必经的第一步。v肿瘤的组织结构肿瘤的组织结构 v实质实质 parenchyma)v间质间质 mesenchyma, stroma) v肿瘤间质的主要成分肿瘤间质的主要成分v1 血管血管v毛细血管，小动、静脉毛细血管，小动、静脉v血窦样血管血窦样血管v血管球样增生血管球样增生v血管内皮增生肿胀血管内皮增生肿胀v新的肿瘤血供模式新的肿瘤血供模式v-血管生成拟态血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)v1999年，美国学者年，美国学者Maniotis等等v一种完全不同于经典血管生成的微循
3、环模式一种完全不同于经典血管生成的微循环模式v-管壁主要由基底膜管壁主要由基底膜(PAS阳性)围成，外衬围成，外衬以肿瘤细胞以肿瘤细胞v-腔内有血浆和红细胞流动腔内有血浆和红细胞流动, 管道与内皮性管道与内皮性血管相血管相v多存在于高度恶性肿瘤多存在于高度恶性肿瘤v2 结缔组织间质结缔组织间质v 1纤维和基质纤维和基质v 胶原纤维胶原纤维 v 常规常规 HE - 红红v 特殊化学染色特殊化学染色v VG 改进法改进法- 红红 v Masson- 兰色兰色v v构成成分构成成分 I II III型胶原原纤维型胶原原纤维v 又由相应原纤维分子构成又由相应原纤维分子构成v 免疫组化或分子生物学方法可
4、区别免疫组化或分子生物学方法可区别v弹力纤维弹力纤维v 常规常规 HE-HE-淡红色淡红色v 特殊化学染色特殊化学染色v WeigertWeigert或或Verhceff-Verhceff-暗兰或黑色，暗兰或黑色，弹力酶消化后阴性弹力酶消化后阴性 v网状纤维网状纤维v 银染银染-黑色，故也称嗜银纤维。黑色，故也称嗜银纤维。v PAS -强阳性强阳性v 成分成分 胶原蛋白为主要成分胶原蛋白为主要成分 v 细胞间质网状纤维细胞间质网状纤维v- 型胶原蛋白型胶原蛋白 v基底膜网状纤维基底膜网状纤维v- 型胶原蛋白型胶原蛋白v-层黏连蛋白层黏连蛋白laminin v纤维黏连蛋白纤维黏连蛋白 Fibro
5、nectinFNv 作用作用v A. 连接基质中各种成分连接基质中各种成分v B. 介导细胞外基质成分与细胞外表连接介导细胞外基质成分与细胞外表连接v黏蛋白黏蛋白v 又称蛋白多糖又称蛋白多糖proteoglycanv 如透明质酸，硫酸肝素等如透明质酸，硫酸肝素等 v骨黏素骨黏素 osteonectin v2基底膜基底膜 (basement membrane , BM) v 多种成分多种成分 v 与肿瘤浸润关系密切与肿瘤浸润关系密切 v 型胶原型胶原 v v 层黏连蛋白层黏连蛋白 laminin ,LMv v 3 3细胞成分细胞成分 v 固有的细胞成分固有的细胞成分v - -成纤维细胞和纤维细胞
6、成纤维细胞和纤维细胞v-肌成纤维细胞肌成纤维细胞 v-间充质细胞间充质细胞 v-巨噬细胞巨噬细胞v-树突状细胞树突状细胞 v反响性细胞成分反响性细胞成分v 各种细胞浸润各种细胞浸润 v - 淋巴细胞淋巴细胞 最常见最常见 v -浆细胞浆细胞v -巨噬细胞巨噬细胞 v 都属免疫活性细胞都属免疫活性细胞 v二、肿瘤浸润、转移的分子机制二、肿瘤浸润、转移的分子机制v一肿瘤细胞的浸润转移一肿瘤细胞的浸润转移 v 1.肿瘤细胞增殖和扩展肿瘤细胞增殖和扩展v 浸润转移的前提和根底浸润转移的前提和根底 v2.肿瘤血管生成肿瘤血管生成(tumor angiogenesis)v 肿瘤浸润转移的必要条件肿瘤浸润转
7、移的必要条件v3.3.肿肿瘤瘤细细胞胞别别离离脱脱落落，与与细细胞胞外外基基质质黏黏附附v 1 1瘤细胞外表负电荷增加瘤细胞外表负电荷增加 v 2 2瘤细胞黏附力的改变瘤细胞黏附力的改变v 瘤细胞自身结构异常瘤细胞自身结构异常 v 瘤细胞同质黏附力下降瘤细胞同质黏附力下降 v 指同种瘤细胞之间的黏附力指同种瘤细胞之间的黏附力 瘤细胞异质黏附力增加 指肿瘤细胞与其它不同细胞及间质的黏附力细胞外表的黏附分子介导 通过配-受体之间的识别和结合实现 v 3 肿 瘤 黏 附 因 子 (adhesion molecules) v细胞外表结构v 钙黏蛋白(cadherin) v 又称为钙连接素，钙黏素 v
8、v 据分布不同 E-钙黏蛋白v P-钙黏蛋白v N-钙黏蛋白 H-cad v 整合素整合素(integrin)(integrin)v-细胞外表糖蛋白细胞外表糖蛋白 ，约有，约有20 20 多个亚型多个亚型 v-各种肿瘤细胞外表整合素种类不同各种肿瘤细胞外表整合素种类不同v-肿瘤生长各个阶段表达水平也不同肿瘤生长各个阶段表达水平也不同 v作用作用 v a.a.介导细胞与细胞外基质的黏附介导细胞与细胞外基质的黏附 v b. b.参与不同细胞之间的黏附连接参与不同细胞之间的黏附连接 v C. C.扮演细胞信号传递的角色扮演细胞信号传递的角色v 免免 疫疫 球球 蛋蛋 白白 超超 基基 因因 家家 族
9、族(immunoglobulin superfamily)(immunoglobulin superfamily)v 主要参与细胞与细胞间的连接主要参与细胞与细胞间的连接v ICAM-1 ICAM-1 细胞间黏附分子细胞间黏附分子-1-1 v VCAM-1 VCAM-1 血管黏附因子血管黏附因子 v NCAM NCAM 神经细胞黏附因子神经细胞黏附因子v 其它其它 包括包括CEA CEA 、DCCDCCv选择素选择素(selectin) (selectin) v内源性植物凝血素凝集素内源性植物凝血素凝集素v 作用作用 介导内皮细胞、血小板与瘤细胞介导内皮细胞、血小板与瘤细胞黏附黏附v 选择素家
10、族包括：选择素家族包括：v P-selectin P-selectin v E-selectin E-selectin v L-selectin L-selectinv CD44 CD44 及其它及其它 v CD 44( CD 44(透明质酸受体透明质酸受体) ) v 路易斯寡糖路易斯寡糖SLEXSLEX，,s-LewisX ,s-LewisX v 跨膜超级家族基因蛋白跨膜超级家族基因蛋白TM4STTM4ST v 4.4.瘤细胞的迁移瘤细胞的迁移(migration)及化学趋向性及化学趋向性v (1)(1)瘤细胞的运动瘤细胞的运动v 黏附；肌动蛋白、微管、中间丝黏附；肌动蛋白、微管、中间丝v
11、(2)(2)瘤细胞运动的调节瘤细胞运动的调节据其作用，大致可分为两大类：据其作用，大致可分为两大类：v既影响运动又影响生长的因子既影响运动又影响生长的因子v仅影响运动的因子仅影响运动的因子肿瘤细胞运动和增殖肿瘤细胞运动和增殖 AMF ( AMF (自分泌运动因子自分泌运动因子) ) 1986 1986年年Liotta Liotta 等首先发现并命名等首先发现并命名 它它源源于于肿肿瘤瘤细细胞胞本本身身且且作作用用于于肿肿瘤细胞瘤细胞. . HGF/SFHGF/SF肝肝细细胞胞生生长长因因子子/ /分分散散因因子子) ) 生物学作用存在多态性生物学作用存在多态性 HGF HGF 和和AMFAMF
12、是是近近期期发发现现的的最最强强大大的的动力因子动力因子 v(3)(3)瘤细胞的化学趋向性瘤细胞的化学趋向性v 21KD 21KD 的蛋白质的蛋白质 v 骨吸收因子骨吸收因子 v5.细胞外基质的降解细胞外基质的降解v(1)肿瘤浸润细胞外基质的步骤肿瘤浸润细胞外基质的步骤v Liotta 1986年提出年提出 v 第一步第一步 黏附于基底膜或其他间质成分黏附于基底膜或其他间质成分 v 第二步第二步 分泌蛋白酶并激活分泌蛋白酶并激活, 降解瘤细胞降解瘤细胞v 邻近的细胞外基质邻近的细胞外基质v 第三步第三步 进入受蛋白酶降解的基质区域内进入受蛋白酶降解的基质区域内 v(2)肿瘤细胞产生的蛋白水解酶
13、肿瘤细胞产生的蛋白水解酶v丝氨酸蛋白酶类及其抑制因子丝氨酸蛋白酶类及其抑制因子v纤溶酶纤溶酶 (纤维蛋白溶解酶纤维蛋白溶解酶) v 纤溶酶原纤溶酶原 v a. 降解基质降解基质 v b. 激活胶原酶激活胶原酶 胶原降解胶原降解v尿激酶型纤溶酶原激活剂尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator , u-PA系统系统 v Au-PA：v 介导细胞周围基质蛋白的降解介导细胞周围基质蛋白的降解v Bu-PA 受体受体u-PAR及纤溶酶原及纤溶酶原受体受体v v 活化活化u-PA 原酶形原酶形式的式的u-PAv纤溶酶原纤溶酶原+纤溶酶原受体纤溶酶原受
14、体 纤纤溶酶溶酶vuPA与与u-PAR还能激活信号传导系统，还能激活信号传导系统，vCPAI PA 抑制剂抑制剂v PAI1 是是u-PA 的主要抑制剂的主要抑制剂 v PAI2 不同肿瘤表达意义不一不同肿瘤表达意义不一v PAI3 功能不清功能不清v基质金属蛋白酶matrix metalloproteinases, MMPv 需钙、锌离子作辅助因子 v MMP 分类v 胶原酶：如间质胶原酶 Collagenasev 明胶酶：如明胶酶A (gelatinase A) v 间质溶素：如间质溶素1 、2v 膜型基质金属蛋白酶：、型 v 可分别降解可分别降解ECM中各种不同成分中各种不同成分v EC
15、M降解的主要蛋白水解酶类降解的主要蛋白水解酶类v金属蛋白酶抑制物金属蛋白酶抑制物 v TIMP-1 ，TIMP-2 v 浸润与否取决于浸润与否取决于MMP与与TIMP的比照的比照v v胱氨酸蛋白酶类胱氨酸蛋白酶类v Cathepsin B v作用作用v 降解降解ECM中各种胶原、中各种胶原、LM、 FN、黏蛋白、黏蛋白v 激活间质胶原酶和激活间质胶原酶和IV型胶原酶型胶原酶v天门冬氨酸蛋白酶天门冬氨酸蛋白酶v 包括组织蛋白酶包括组织蛋白酶D,E ( cathepsin D, E ) v CD ： v在肿瘤浸润转移中的作用在肿瘤浸润转移中的作用 v CD 表达的调节表达的调节 v 不同组织调节因
16、素不完全一致不同组织调节因素不完全一致v CEv 在肿瘤在肿瘤 v6.瘤细胞以主动方式入循环管道并形成栓子瘤细胞以主动方式入循环管道并形成栓子v 微小淋巴管、微小静脉壁微小淋巴管、微小静脉壁 缝隙缝隙v瘤细胞存在形式瘤细胞存在形式 v 单个单个v 成团成团 同类癌栓同类癌栓 v 异类癌栓异类癌栓v 黏附分子对其发挥调节作用黏附分子对其发挥调节作用v v7.在在特特定定器器官官的的毛毛细细血血管管滞滞留留并并黏黏着着，再再次次穿过血管壁并定居、增殖穿过血管壁并定居、增殖v 器关特异性选择性机制器关特异性选择性机制v (1) 黏附分子的作用黏附分子的作用v (2) 化学趋化因子化学趋化因子v (3
17、) 微环境不适合微环境不适合v (4) 与免疫状态有关与免疫状态有关v 二机体免疫状态与肿瘤浸润转移v 参与控制转移的免疫细胞主要有 v NK 细胞v 巨噬细胞v T 淋巴细胞v 三肿瘤浸润转移相关基因v 转移相关基因v四肿瘤表观遗传改变与肿瘤浸润转移四肿瘤表观遗传改变与肿瘤浸润转移v表观遗传学表观遗传学(Epigenetics) v-与遗传学与遗传学(genetic)相对应的概念相对应的概念v-表型状态改变，基因型不改变表型状态改变，基因型不改变 v-没有没有DNA序列变化的情况下，序列变化的情况下， 可遗传的可遗传的基因表达改变，导致的基因产物的变化。基因表达改变，导致的基因产物的变化。v
18、 DNA的的“后天性修饰如甲基化修饰、后天性修饰如甲基化修饰、组蛋白的各种修饰等组蛋白的各种修饰等v五肿瘤干细胞五肿瘤干细胞(tumor stem cell, TSC)v 2001年由年由Reya等提出等提出v 2006年美国癌症研究协会年美国癌症研究协会AACR定义定义v 存在于肿瘤组织中具有无限自我更新能力并存在于肿瘤组织中具有无限自我更新能力并能产生不同分化程度的肿瘤细胞的细胞能产生不同分化程度的肿瘤细胞的细胞 v 特征特征 v (1) 无限增殖和多向分化无限增殖和多向分化 v (2)存在自我更新的信号传导途径存在自我更新的信号传导途径v (3)具不同表型，异质性，对放化疗不敏感具不同表
19、型，异质性，对放化疗不敏感v (4)具有端粒酶活性具有端粒酶活性 v (5)能转移到各种不同的组织能转移到各种不同的组织 v六肿瘤微环境与肿瘤浸润转移六肿瘤微环境与肿瘤浸润转移 v肿瘤细胞肿瘤细胞v间质细胞间质细胞 v细胞外基质细胞外基质v间质细胞所分泌的活性介质细胞因子间质细胞所分泌的活性介质细胞因子v 共同构成的局部内环境共同构成的局部内环境 v微环境改变微环境改变v肿瘤细胞肿瘤细胞v-自分泌和旁分泌自分泌和旁分泌 v全身和局部组织全身和局部组织v-代谢、分泌、免疫代谢、分泌、免疫v 结果：结果： 限制或促进肿瘤的发生和开展限制或促进肿瘤的发生和开展 v三三.肿瘤学研究中常用的分子生物学根
20、本技术及其应肿瘤学研究中常用的分子生物学根本技术及其应用用v(一一)基因扩增的检测基因扩增的检测v1.过量的蛋白表达过量的蛋白表达v-免疫组化荧光定位免疫组化荧光定位 v-ELISA和和Western blot 定量定量抗原抗原抗体抗体标标记记标标记记抗原抗原标标记记标标记记抗原抗原标标记记标标记记抗原抗原标标记记v2.基因拷贝数的增加、转录产物基因拷贝数的增加、转录产物mRNA的增加的增加 - 核酸分子生物学方法进行检测核酸分子生物学方法进行检测v核酸变性、复性根本性质核酸变性、复性根本性质v常用方法常用方法 (1)核酸分子杂交核酸分子杂交nucleic acid molecular hyb
21、ridisation技术技术最常用的根本技术最常用的根本技术根本原理：根本原理： -标记的碱基序列标记的碱基序列DNA或或RNA单链片段单链片段探针探针probe 同位素同位素P32 I125 非同位素非同位素 生物素生物素 地高辛地高辛 荧光素荧光素 -检测靶核酸待测核酸中是否存在与之检测靶核酸待测核酸中是否存在与之 同源的序列同源的序列 v1.原位杂交原位杂交 ISHv2.荧光原位杂交荧光原位杂交 FISH，v3.双色多色银染原位杂交双色多色银染原位杂交DSISHv3.Southern blot (DNA 杂交杂交)v4.Northern blot (RNA 杂交杂交)v2聚合酶链反响聚合
22、酶链反响polymerase chain reaction , PCR技术技术 v又称体外基因扩增又称体外基因扩增v利用利用DNA变性和复性原理变性和复性原理v体外进行体外进行v特定的特定的DNA 片段高效扩增片段高效扩增 v获得或放大特异基因信号的重要手段获得或放大特异基因信号的重要手段v扩增产物的检测扩增产物的检测 凝胶电泳分析凝胶电泳分析 v琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 (最常用最常用) 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 单一条带单一条带v Real Real-time PCRtime PCRv 原位原位PCRPCRv RT RT-PCRPCRv3.3.基因芯片技术基因芯片技术v(
23、(二二) )基因突变的检测方法基因突变的检测方法v1.1.聚合酶链反响聚合酶链反响- -单链构象多态性分析单链构象多态性分析Single Single strand conformation polymorphism analysis strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products , of polymerase chain reaction products , PCR-SSCPPCR-SSCPv长度相同，但碱基序列不同的单链长度相同，但碱基序列不同的单链DNA DNA v构象不同
24、构象不同v在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳v迁移率泳动率不同迁移率泳动率不同v根本方法根本方法v 作作PCRPCRv 将产物变性而成为单链将产物变性而成为单链v 进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 v 显示结果显示结果v 可用同位素可用同位素/ /荧光素标记荧光素标记 v 非同位素标记非同位素标记 v2.PCR-限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性restrection fragment length polymorphisms , RFLP分析分析技术技术v根本原理根本原理 v-序列中一个碱基发生改变序列中一个碱基发生改变 v-使原来的内切酶
25、位点消失使原来的内切酶位点消失v或产生新的酶切位点或产生新的酶切位点v-用限制性内切酶消化用限制性内切酶消化PCRv扩增出来的扩增出来的DNA片段片段v -检测其酶切片段长度的差异检测其酶切片段长度的差异v3.变性梯度凝胶电泳法变性梯度凝胶电泳法denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)v根本原理根本原理v 电泳时，不同浓度凝胶温度不同电泳时，不同浓度凝胶温度不同v DNA链中有一个碱基改变链中有一个碱基改变v 在不同的温度发生解链在不同的温度发生解链v 电泳迁移率改变电泳迁移率改变v v 4. DNA 序列分析序列分析DNA sequenci
26、ng v 5. 荧光原位杂交荧光原位杂交 ( FISH) v 6 DNA 芯片技术芯片技术DNA chip v三肿瘤的微卫星不稳定性分析三肿瘤的微卫星不稳定性分析v微卫星不稳定性微卫星不稳定性microsatellite instability , MI, 是指简单重复序列的增加或丧失是指简单重复序列的增加或丧失 v检测方法检测方法v PCR + DNA 序列凝胶电泳序列凝胶电泳v四肿瘤易感性检测四肿瘤易感性检测v 遗传癌症综合征与易感性遗传癌症综合征与易感性v 癌症综合征癌症综合征 易感基因易感基因v视网膜母细胞瘤视网膜母细胞瘤 Rb1vWilms 瘤瘤 WT1vLi-Fraumeni 综合
27、征综合征 p53v家家族族性性腺腺瘤瘤性性息息肉肉FAP APCv遗遗传传性性非非息息肉肉性性结结肠肠癌癌HNPCC hMSH2, hMSH1v乳腺癌乳腺癌 BRCA1v卵巢癌卵巢癌 BRCA1v v采用相应基因变异方法进行检测采用相应基因变异方法进行检测五肿瘤相关病毒五肿瘤相关病毒 核酸杂交技术与核酸杂交技术与PCR技术技术 (六六) 基因重组技术基因重组技术 主要目的是获得某一基因或主要目的是获得某一基因或DNA片段的大片段的大 量拷贝量拷贝 (七七) 基因转染基因转染gene transfection技术技术八八RNA干预干预(RNA interference 核酸杂交核酸杂交/PCR技
28、术与免疫组化技术与免疫组化/荧光、荧光、WB方法结合方法结合 v免疫组化免疫组化/荧光荧光 在翻译水平上定位研究基因表达在翻译水平上定位研究基因表达 v核酸杂交核酸杂交/PCR技术技术 检测检测DNA/RNA， 在基因或转录在基因或转录水平研究基因表达水平研究基因表达 v九九 激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术(Laser capture microdissection，LCM) v-显微镜直视下显微镜直视下v-组织切片组织切片v-确定、别离、纯化单一类型细胞群或单个确定、别离、纯化单一类型细胞群或单个细胞细胞 v十共聚焦激光扫描显微镜技术十共聚焦激光扫描显微镜技术(Confocal (Confocal Laser Scanning MicroscopeLaser Scanning Microscope，CLSM) CLSM) v细胞细胞“CT“CT ，上世纪，上世纪8080年代年代v-组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态改变水平上观察生理信号及细胞形态改变 v v应用应用 v能观察各种荧光标记的能观察各种荧光标记的v-组织包括活组织组织包括活组织v-培养细胞培养细胞v-粘附细胞粘附细胞v-细胞涂片细胞涂片v-石蜡切片石蜡切片v-冰冻切片冰冻切片
