【生物课件】第六章发酵生产染菌及治

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1、发酵生产染菌及防治 第六章第六章发酵生产染菌及防治第一节 染菌对发酵的影响 第二节 发酵异常现象及原因分析 第三节 杂菌污染的途径和防治 第一节 染菌对发酵的影响 尽管染菌对发酵过程的影响是很大的，但由于生产的产品不同、污染杂菌的种类和性质不同、染菌发生的时间不同以及染菌的途径和程度不同，染菌造成的危害及后果也是不相同的。 一、染菌对不同发酵过程的影响一、染菌对不同发酵过程的影响 由于各种发酵过程所使用的微生物菌种、培养基以及发酵的条件、产物的性质不同，染菌造成的危害程度也不同。如青霉素的发酵过程，由于许多杂菌都能产生青霉素酶，因此不管染茵是发生在发酵前期、中期或后期，都会使青霉素迅速被分解破

2、坏，使目的产物最终产率降低，危害十分严重。 第一节 染菌对发酵的影响 对于核苷或核苷酸的发酵过程，由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物，其生长能力差，所需的培养基营养丰富，因此更容易受到杂菌的污染，而且染菌后，培养基中的营养成分迅速被消耗，更加不利于生产菌的生长和代谢产物的生成。对于柠檬酸等有机酸的发酵过程，一般在产酸后，发酵液的pH值降低，此时杂菌的生长变得困难，在发酵中、后期就较少发生染茵，因此对于有机酸的发酵主要是要预防发酵前期染菌。第一节 染菌对发酵的影响 但是，不管是对于哪种发酵过程，一旦发生染菌，都会由于培养基中的营养成分被消耗或代谢产物被分解，严重影响到产物的生成，使发酵产品

3、的产量大为降低。谷氨酸发酵周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的威胁非常大。 二、染菌发生的不同时间对发酵的影响二、染菌发生的不同时间对发酵的影响 从发生染菌的时间来看，染菌可分为种子培养期染菌、发酵前期染菌、发酵中期染菌和发酵后期染菌等四个不同的染菌时期，不同的染菌时期对发酵所产生的影响也是有区别的。第一节 染菌对发酵的影响 1 1种种子子培培养养期期染染菌菌 种子培养的目的主要是使微生物细胞生长与繁殖，增加微生物的数目，为发酵做准备。一般种子罐中的微生物菌体浓度较低，而其培养基的营养又十分丰富，容易发生染菌。若将污染的种子带入发酵罐，则会造成更大

4、的危害。因此应严格控制种子染菌情况的发生。一旦发现种子受到杂菌的污染，应经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。 第一节 染菌对发酵的影响 2 2发发酵酵前前期期染染菌菌 在发酵前期，微生物菌体主要是处于生长、繁殖阶段，这段时期代谢的产物很少，相对而言这个时期也容易发生染菌，染菌后的杂菌将迅速繁殖，与生产菌争夺培养基中的营养物质，严重干扰生产菌的正常生长、繁殖及产物的生成，甚至会抑制或杀灭生产菌。 3 3发发酵酵中中期期染染菌菌 发酵中期染菌将会导致培养基中的营养物质大量消耗，并严重干扰生产菌的生长和代谢，影响产物的生成。有的杂菌在染菌后大量繁殖，产生酸性物质，使pH值下降，糖

5、、氮等的消耗加速，菌体发生自溶，致使发酵液发黏，并产生大量的泡沫，最终导致代谢产物的积累减少或停止；有的染菌后会使已生成的产物被利用或破坏。从目前的情况来看，发酵中期染菌一般较难挽救，危害性较大，在生产过程中应尽力做到早发现，快处理。第一节 染菌对发酵的影响 4 4发发酵酵后后期期染染菌菌 由于到了发酵后期，培养基中的糖、氮等营养物质已接近耗尽，且发酵的产物也已积累较多，如果染菌量不太大，对发酵的影响相对来说就要小一些，可继续进行发酵。对发酵产物来说，发酵后期染菌对不同的产物的影响也是不同的，如抗生素、柠檬酸的发酵，染菌对产物的影响不大；肌苷酸、谷氨酸、氨基酸等的发酵，后期染菌也会影响产物的产

6、量、提取和产品的质量。第一节 染菌对发酵的影响 三、染菌程度对发酵的影响三、染菌程度对发酵的影响 染菌的程度对发酵的影响是很大的。染菌程度愈严重，即进入发酵罐内的杂菌数量愈多，对发酵的危害也就愈大。当生产菌在发酵过程已有大量的繁殖，并已在发酵液中占优势，污染极少量的杂茵，对发酵不会带来太大的影响，因为进入发酵液的杂菌需要有一定的时间才能达到危害发酵的程度，而且此时环境对杂菌繁殖已相当不利。当然如果染菌程度严重时，尤其是在发酵的前期或发酵的中期，对发酵将会产生严重的影响。第一节 染菌对发酵的影响 染菌的后果随污染的杂菌种类，数量和发酵阶段而有所不同。一般，从染菌的种类大致可以判断其来源。染芽孢杆

7、菌有可能是灭菌不透所致；染大肠杆菌则怀疑是否有脏水污染，如蛇管穿孔；染球菌、短杆菌有可能来自空气。对抗生素发酵前期染菌比较麻烦，控制不当，杂菌生长比生产菌快，则容易倒罐。遇到早期染菌，原则上可适当改变生长参数，使有利于生产菌而不利于杂菌的生长，如降低发酵温度等。加入某些抑制杂菌的化合物也不失为一种应急办法，条件是这种化合物对生产菌无害，对生产影响不大和在下游精制阶段能被完全去除。中后期染菌除非是噬菌体否则后果不会那么严重，这时发酵液中已产生一定浓度的抗生素，对杂菌已有一定抑制作用。实际生产中常采用大接种量的原因之一是即使不慎污染了极少量杂菌，生产菌也能很快占优势。第二节 发酵异常现象及原因分析

8、 一、种子培养和发酵的异常现象一、种子培养和发酵的异常现象 发酵过程中的种子培养和发酵的异常现象是指发酵过程中的某些物理参数、化学参数或生物参数发生与原有规律不同的改变，这些改变必然影响发酵水平，使生产蒙受损失。对此，应及时查明原因，加以解决。 1 1种子培养异常种子培养异常 种子培养异常表现在培养的种子质量不合格。种子质量不合格会给发酵带来较大的影响，然而种子内在质量常被忽视。由于种子培养的周期短，可供分析的数据较少，因此种子异常的原因一般较难确定，也使得由种子质量引起的发酵异常原因不易查清。种子培养异常的表现主要有菌体生长缓慢、菌丝结团、茵体老化以及培养液的理化参数变化。第二节 发酵异常现

9、象及原因分析 （1）菌体生长缓慢 种子培养过程中菌体数量增长缓慢的原因很多。培养基原料质量下降、菌体老化、灭菌操作失误、供氧不足、培养温度偏高或偏低、酸碱度调节不当等都会引起菌体生长缓慢。此外，接种物冷藏时间长或接种量过低而导致菌体量少，或接种物本身质量较差等也都会使菌体数量增长缓慢。 第二节 发酵异常现象及原因分析 （2）菌丝结团 在培养过程中有些丝状菌容易产生菌丝团，菌体仅在表面生长，菌丝向四周伸展，而菌丝团的中央结实，使内部菌丝的营养吸收和呼吸受到很大影响，从而不能正常地生长。菌丝结团的原因很多，诸如通气不良或停止搅拌导致溶解氧浓度不足；原料质量差或灭菌效果差导致培养基质量下降；接种的孢

10、子或菌丝保藏时间长而菌落数少，泡沫多；罐内装料小、菌丝粘壁等会导致培养液的菌丝浓度比较低；此外接种物种龄短等也会导致菌体生长缓慢，造成菌丝结团。 第二节 发酵异常现象及原因分析 （3）代谢不正常 代谢不正常表现为糖、氨基氮等变化不正常，菌体浓度和代谢产物不正常。造成代谢不正常的原因很复杂，除与接种物质量和培养基质量差有关外，还与培养环境条件差、接种量小、杂菌污染等有关。 2 2发酵异常发酵异常 不同种类的发酵过程所发生的发酵异常现象，形式虽然不尽相同，但均表现出菌体生长速度缓慢、菌体代谢异常或过早老化、耗糖慢、pH值的异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液颜色的异常变化、代谢产物含量的异常

11、下跌、发酵周期的异常拖长、发酵液的黏度异常增加等。第二节 发酵异常现象及原因分析 （1）菌体生长差 由于种子质量差或种子低温放置时间长导致菌体数量较少、停滞期延长、发酵液内菌体数量增长缓慢、外形不整齐。种子质量不好、菌种的发酵性能差、环境条件差、培养基质量不好、接种量太少等均会引起糖、氮的消耗少或间歇停滞，出现糖、氮代谢缓慢现象。 （2）pH值过高或过低 发酵过程中由于培养基原料质量差、灭菌效果差、加糖、加油过多或过于集中，将会引起pH值的异常变化。而pH值变化是所有代谢反应的综合反映，在发酵的各个时期都有一定规律，pH值的异常变化就意味着发酵的异常。 第二节 发酵异常现象及原因分析 （3）溶

12、解氧水平异常 可以根据发酵过程中出现的异常现象如溶解氧（DO）、pH值、排气中的CO2含量以及微生物菌体酶活力等的异常变化来检查发酵是否染菌。对于特定的发酵过程要求一定的溶解氧水平，而且在不同的发酵阶段其溶解氧的水平也是不同的。如果发酵过程中的溶解氧水平发生了异常的变化，一般就是发酵染菌的表现。 第二节 发酵异常现象及原因分析 在正常的发酵过程中，发酵初期菌体处于适应期，耗氧量很少，溶解氧基本不变；当菌体进入对数生长期，耗氧量增加，溶解氧浓度很快下降，并且维持在一定的水平，在这阶段中操作条件的变化会使溶解氧有所波动，但变化不大；而到了发酵后期，菌体衰老，耗氧量减少，溶解氧又再度上升；当感染噬菌

13、体后，生产菌的呼吸作用受抑制，溶解氧浓度很快上升。发酵过程感染噬菌体后，溶解氧的变化比菌体浓度更灵敏，因此就能更准确地预见染菌的发生。第二节 发酵异常现象及原因分析 由于污染的杂菌好氧性不同，产生溶解氧异常的现象也是不同的。当杂菌是好氧性微生物时，溶解氧的变化是在较短时间内下降，直到接近于零，且在长时间内不能回升；但并非一旦染菌溶氧就下降，当杂菌是非好氧性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧量减少，溶解氧反而升高。一般，补料或加油也会引起溶解氧迅速下降，在低谷处维持1-3h即回升。这与染菌使溶氧变化是不同的。 红霉素发酵过程中污染噬菌体或其他不明原因会出现发酵液变稀，溶氧迅速回升。如第

14、23批的发酵液在发酵90h后短时间内下降到比接种后的发酵液的黏度还要低。与此同时，溶氧迅速上升，图6-1显示红霉素发酵生产溶氧实际监测情况。第二节 发酵异常现象及原因分析第二节 发酵异常现象及原因分析 污染噬菌体常表现在发酵液变稀，溶氧迅速回升。如图6-2所示，谷氨酸发酵在正常情况下溶氧在1218h下降到最低点，约在10%20%空气饱和度的水平，维持到放罐前约5h开始上升，到放罐时溶氧处在50%以上。这是很有规律的变化。菌的生长，其OD（光密度）值在过了短暂适应期后便上升，在12h后随菌的浓度的增加而减缓，维持到放罐。而污染噬菌体后发现溶氧提前在15h上升，但OD此时还在上升。这是由于当时的菌

15、已受侵袭，其呼吸强度下降的缘故，直到23h后OD才开始下降。因此溶氧可以比OD提前23 h预报发酵异常情况。 第二节 发酵异常现象及原因分析第二节 发酵异常现象及原因分析 对于特定的发酵过程，工艺确定后，排出的气体中CO2含量的变化是规律的。染菌后，培养基中糖的消耗发生变化，引起排气中CO2含量的异常变化，如杂菌污染时，糖耗加快，CO2含量增加，噬菌体污染后，糖耗减慢，CO2含量减少。因此，可根据CO2含量的异常变化来判断是否染菌。 （4）泡沫过多 一般在发酵过程中泡沫的消长是有一定的规律的。但是，由于菌体生长差、代谢速度慢、接种物嫩或种子未及时移种而过老、蛋白质类胶体物质多等都会使发酵液在不

16、断通气、搅拌下产生大量的泡沫。除此之外，培养基灭菌时温度过高或时间过长，葡萄糖受到破坏后产生的氨基糖会抑制菌体的生长，也会使泡沫大量产生，从而使发酵过程的泡沫发生异常。第二节 发酵异常现象及原因分析 （5）菌体浓度过高或过低 在发酵生产过程中菌体或菌丝浓度的变化是按其固有的规律进行的。但如果罐温长时间偏高，或停止搅拌时间较长造成溶氧不足，或培养基灭菌不当导致营养条件较差，种子质量差、菌体或菌丝自溶等均会严重影响到培养物的生长，导致发酵液中菌体浓度偏离原有规律，出现异常现象。第二节 发酵异常现象及原因分析 二、染菌的检查和判断二、染菌的检查和判断 发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果为依据进行判断

17、。在发酵过程中，如何及早发现杂菌的污染并及时采取措施加以处理，是避免染菌造成严重经济损失的重要手段。因此，生产上要求能准确、迅速的检查出杂菌的污染。目前常用于检查是否染茵的无菌试验方法主要有显微镜检查法、肉汤培养法、平板(双碟)培养法、发酵过程的异常观察法等。第二节 发酵异常现象及原因分析 1 1显微镜检查法（镜检法）显微镜检查法（镜检法） 用革兰氏染色法对样品进行涂片、染色，然后在显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌与杂菌的特征进行区别、判断是否染菌。如发现有与生产菌形态特征不一样的其他微生物的存在，就可判断为发生了染菌。此法检查杂菌最为简单、最直接，也是最常用的检查方法之一。必要时还可

18、进行芽孢染色或鞭毛染色。 但在染菌的初期，要从显微镜检中发现是很难的，如能从视野中发现杂菌时，染菌已很严重。第二节 发酵异常现象及原因分析 2 2肉汤培养法肉汤培养法 通常用组成为0.3%牛肉膏、0.5%葡萄糖、0.5%氯化钠、0.8%蛋白胨、0.4%的酚红溶液（pH=7.2）的葡萄糖酚红肉汤作为培养基，将待检样品直接接入经完全灭菌后的肉汤培养基中，分别于37、27进行培养，随时观察微生物的生长情况，并取样进行镜检，判断是否有杂菌。肉汤培养法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，同时此法也可用于噬菌体的检查。第二节 发酵异常现象及原因分析 3 3平板划线培养或斜面培养检查法平板划线培养或斜面培养

19、检查法 将待检样品在无菌平板上划线，分别于37、27进行培养，一般24h后即可进行镜检观察，检查是否有杂菌。有时为了提高平板培养法的灵敏度，也可以将需要检查的样品先置于37条件下培养6h，使杂菌迅速增殖后再划线培养。无菌试验时，如果肉汤连续三次发生变色反应（由红色变为黄色）或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项参数确有可疑染菌，并经镜检等其他方法确认连续三次样品有相同类型的异常菌存在，也应该判断为染菌。一般来讲，无菌试验的肉汤或培养平板应保存并观察至本批（罐）放罐后12h，确认为无杂菌后才能弃去。无菌试验期间应每6h

20、观察一次无菌试验样品，以便能及早发现染菌。 第二节 发酵异常现象及原因分析 三、发酵染菌原因分析三、发酵染菌原因分析 发酵染菌后，一定要找出染菌的原因，以总结防治发酵染菌的经验教训，积极采取必要措施，把杂菌消灭在发生之前。如果对已发生的染菌不作具体分析，不了解染菌原因，未采取相应的措施来防止染菌，将会对生产造成严重的后果。造成发酵染菌的原因有很多，且常因工厂不同而有所不同，但设备渗漏、空气净化达不到要求、种子带菌、培养基灭菌不彻底和技术管理不善等是造成各厂污染杂菌的普遍原因。表6-1是日本工业技术院发酵研究所对抗生素发酵染菌原因分析，表6-2为某厂链霉素发酵染菌分析，表6-3是上海天厨味精厂谷

21、氨酸发酵染菌分析。第二节 发酵异常现象及原因分析表6-1 日本工业技术院发酵研究所对抗生素的发酵染菌原因分析染菌原因染菌百分率/%染菌原因染菌百分率/%种子带菌或怀疑种子带菌9.64接种管穿孔0.39接种时罐压跌零0.19阀门渗漏1.45培养基灭菌不透0.79搅拌轴密封渗漏2.09总空气系统有菌19.9发酵罐盖漏1.54泡沫冒顶0.48其他设备渗漏10.13夹套穿孔12.0操作问题10.15盘管穿孔5.89原因不明24.91第二节 发酵异常现象及原因分析 由表中可以看出，由于不同厂家的设备渗漏几率、技术管理好坏不同，而使各种染菌原因的百分率有所不同，其中尤以设备渗漏和空气带菌而染菌较为普遍且严

22、重。值得注意的是，不明原因的染菌，分别达24.91%、35.00%和35.13%。这表明，目前分析染菌原因的水平还有待于进一步提高。第二节 发酵异常现象及原因分析表6-2 某厂链霉素发酵染菌原因分析染菌原因染菌百分率/%染菌原因染菌百分率/%外界带入杂菌（取样、补料等带入）8.20蒸汽压力不够或蒸汽量不足0.60设备穿孔7.60管理问题7.09空气系统有菌26.00操作违反规则1.60停电罐压下跌1.60种子带菌0.60接种11.00原因不明35.00第二节 发酵异常现象及原因分析表6-3 上海天厨味精厂谷氨酸发酵染菌原因分析染菌原因染菌百分率/%染菌原因染菌百分率/%空气系统染菌32.05补

23、料、取样带菌4.30设备问题15.46种子带菌1.72管理和操作不当11.34环境污染及原因不明35.13第二节 发酵异常现象及原因分析 1 1染菌的杂菌种类分析染菌的杂菌种类分析 对于每一个发酵过程而言，污染的杂菌种类的影响是不同的。如在抗生素的发酵过程中，青霉素的发酵污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害更大；链霉素的发酵污染细短杆菌、假单胞杆菌和产气杆菌比污染粗大杆菌更有危害；四环素的发酵过程最怕污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌；柠檬酸的发酵最怕青霉菌的污染；谷氨酸发酵最怕噬菌体污染。因噬菌体蔓延迅速，难以防治，容易造成连续污染。若污染的杂菌是耐热的芽孢杆菌，可能是由于培养基或设备灭菌不彻底、设

24、备存在死角等引起；若污染的是球菌、无芽孢杆菌等不耐热杂菌，可能是由于种子带菌、空气过滤效率低、除菌不彻底、设备渗漏和操作问题等引起；若污染的是真菌，就可能是由于设备或冷却盘管的渗漏、无菌室灭菌不彻底或无菌操作不当、糖液灭菌不彻底（特别是糖液放置时间较长）而引起。第二节 发酵异常现象及原因分析 2 2发酵染菌的规模分析发酵染菌的规模分析 从染菌的规模来看，主要有三种。 （1）大批量发酵罐染菌 如发生在发酵前期，可是种子带菌或连消设备引起染菌；如果染菌发生在发酵中期、后期，且这些杂菌类型相同，则一般是空气净化系统存在诸如空气系统结构不合理、空气过滤器介质失效等问题；如果空气带菌量不多，无菌试验的显

25、现时间较长，这就使分析防治空气带菌增加了难度。 第二节 发酵异常现象及原因分析 （2）部分发酵罐染菌 如果染菌发生在发酵前期，就可能是种子染菌、连消系统灭菌不彻底；如果是发酵后期染菌，则可能是中间补料染菌，如补料液带菌、补料管渗漏。 （3）个别发酵罐连续染菌 此时如果采用间歇灭菌工艺，一般不会发生连续染菌。个别发酵罐连续染菌，大都是由于设备渗漏造成，应仔细检查阀门、罐体，或罐器是否清洁等。一般设备渗漏引起的染菌，会出现每批染菌时间向前推移的现象。第二节 发酵异常现象及原因分析 3 3不同污染时间分析不同污染时间分析 从发生染菌的时间来分析，也是三种情况。 （1）染菌发生在种子培养阶段 或称种子

26、培养基染菌。此时通常是由种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及接种操作不当或设备因素等原因而引起染菌。 （2）在发酵过程的初始阶段发生染菌 或称发酵前期染菌。此时大部分染菌也是由种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及接种操作不当或设备因素、无菌空气带菌等原因而引起。 （3）发酵后期染菌 大部分是由空气过滤不彻底、中间补料染菌、设备渗漏、泡沫顶盖以及操作问题而引起染菌。第三节 杂菌污染的途径和防治 从技术上分析，染菌的途径不外有以下几方面：种子包括进罐前菌种室阶段出问题；培养基的配制和灭菌不彻底；设备上特别是空气除菌不彻底和过程控制操作上的疏漏。遇到染菌首先要监测杂菌的来源。对顽固的染菌，应对种

27、子、消后培养基和补料液、发酵液及无菌空气取样作无菌试验以及设备试压检漏，只有系统、严格监测和分析才能判断其染菌原因，做到有的放矢。第三节 杂菌污染的途径和防治 种子带菌的检查可从菌种室保藏的菌种、斜面、摇瓶直到种子罐。保藏菌种定期作复壮、单孢子分离和纯种培养；斜面、摇瓶和种子罐种子作无菌试验，可以用肉汤和斜面或平板培养基检查有无杂菌。显微镜检观察菌形是否正常，应注意在显微镜检不出杂菌时不等于真的无杂菌，需作无菌试验才能最后肯定。 培养基和设备没消透的原因有多方面，如蒸汽压力或灭菌时间不够，培养基配料未混合均匀，存在结块现象，设备未清洗干净，特别是罐冲洗不到的犄角处，有结痂而未铲除干净。 第三节

28、 杂菌污染的途径和防治 设备方面特别是老设备也常会遇到各种问题，如夹层或盘管、搅拌轴密封封和管道的渗漏，空气除菌的效果差，管道安装不合理，存在死角等是造成染菌的重要原因。 过程控制主要包括接种、过程加糖补料和取样操作等是否严密规范。一级种子罐的接种可分为血清瓶针头或管道方式或火焰敞口式接种，罐与罐之间的移种前管道冲洗或灭菌不当也会出问题。第三节 杂菌污染的途径和防治 一、种子带菌及其防治一、种子带菌及其防治 由于种子带菌而发生的染菌率虽然不高，但它是发酵前期染菌的重要原因之一，是发酵生产成败的关键，因而对种子染菌的检查和染菌的防治是极为重要的。种子带菌的原因主要有保藏的斜面试管菌种染菌、培养基

29、和器具灭菌不彻底、种子转移和接种过程染菌以及种子培养所涉及的设备和装置染菌等。针对上述染菌原因，生产上常用以下的一些措施予以防治。第三节 杂菌污染的途径和防治 （1）严格控制无菌室的污染 根据生产工艺的要求和特点，建立相应的无菌室，交替使用各种灭菌手段对无菌室进行处理。除常用的紫外线灭菌外，如发现无菌室已污染较多的细菌，可采用石碳酸或土霉素等进行灭菌；如发现无菌室有较多的霉菌，则可采用制霉菌素等进行灭菌；如果污染噬菌体，通常就用甲醛、双氧水或高锰酸钾等灭菌剂进行处理。 （2）在制备种子时对沙土管、斜面、三角瓶及摇瓶均严格进行管理，防止杂菌的进入而受到污染。为了防止染菌，种子保存管的棉花塞应有一

30、定的紧密度，且有一定的长度，保存温度尽量保持相对稳定，不宜有太大变化。第三节 杂菌污染的途径和防治 （3）对每一级种子的培养物均应进行严格的无菌检查，确保任何一级种子均未受杂菌感染后才能使用。 （4）对菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理，保证在利用灭菌锅进行灭菌前，先完全排除锅内的空气，以免造成假压，使灭菌的温度达不到预定值，造成灭菌不彻底而使种子染菌。 二、空气带菌及其防治二、空气带菌及其防治 无菌空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。要杜绝无菌空气带菌，就必须从空气的净化工艺和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。 第三节 杂菌污染的途径和防治 加强生产

31、环境的卫生管理，减少生产环境中空气的含菌量，正确选择采气口，如提高采气口的位置或前置粗过滤器，加强空气压缩前的预处理，如提高空压机进口空气的洁净度。 设计合理的空气预处理工艺，尽可能减少生产环境中空气带油、水量，提高进入过滤器的空气温度，降低空气的相对湿度，保持过滤介质的干燥状态，防止空气冷却器漏水，防止冷却水进入空气系统等。第三节 杂菌污染的途径和防治 设计和安装合理的空气过滤器，防止过滤器失效。选用除菌效率高的过滤介质，在过滤器灭菌时要防止过滤介质被冲翻而造成短路，避免过滤介质烤焦或着火，防止过滤介质的装填不均而使空气走短路，保证一定的介质充填密度。当突然停止进空气时，要防止发酵液倒流入空

32、气过滤器，在操作过程中要防止空气压力的剧变和流速的急增。 第三节 杂菌污染的途径和防治 三、操作失误导致染菌及其防治三、操作失误导致染菌及其防治 曾经有一位对灭菌很有经验的工程师被邀请到一经常发生染菌事故的发酵工厂协助解决染菌问题。他在较短时间内对设备几乎没有什么改造的情况下便将该厂的染菌率从70%80%降到10%以下，其成功的经验只有一条，即加强生产技术管理，严格按工艺规程操作，分清岗位责任事故，奖罚分明。有些厂忽视车间的清洁卫生，跑、冒、滴、漏随处可见，这样的厂的染菌就时常发生。由此可见，即使有好的设备，没有科学严密的管理，染菌照样难以收拾。因此，要克服染菌，生产技术和管理应同时并重。第三

33、节 杂菌污染的途径和防治 四、设备渗漏或四、设备渗漏或“死角死角”造成的染菌及其防治造成的染菌及其防治 设备渗漏主要是指发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，由于化学腐蚀（发酵代谢所产生的有机酸等发生腐蚀作用）、电化学腐蚀（如氧溶解于水，使金属不断失去电子，加快腐蚀作用）、磨蚀（如金属与原料中的泥沙之间磨损）、加工制作不良等原因形成微小漏孔后发生渗漏染菌。 由于操作、设备结构、安装及其他人为因素造成的屏障等原因，使蒸汽不能有效到达预定的灭菌部位，而不能达到彻底灭菌的目的。生产上常把这些不能彻底灭菌的部位称为“死角”。第三节 杂菌污染的途径和防治 盘管是发酵过程中用于通冷却水或蒸汽进行冷却或加热

34、的蛇形金属管。由于存在温差（内冷却水温、外灭菌温度），温度急剧变化，或发酵液的pH值低、化学腐蚀严重等原因，使金属盘管受损，因而盘管是最易发生渗漏的部件之一，渗漏后带菌的冷却水进入罐内引起染菌。生产上可采取仔细清洗，检查渗漏，及时发现及时处理，杜绝污染。第三节 杂菌污染的途径和防治 空气分布管一般安装于靠近搅拌桨叶的部位，受搅拌与通气的影响很大，易磨蚀穿孔造成“死角”，产生染菌。尤其是采用环形空气分布管时，由于管中的空气流速不一致，靠近空气进口处流速最大，离进口处距离越远流速越小，因此，远离进口处的管道常被来自空气过滤器中的活性炭或培养基中的某些物质所堵塞，最易产生“死角”而染菌。通常采取频繁

35、更换空气分布管或认真洗涤等措施。 发酵罐体易发生局部化学腐蚀或磨蚀，产生穿孔渗漏。罐内的部件如挡板、扶梯、搅拌轴拉杆、联轴器、冷却管等及其支撑件、温度计套管焊接处等的周围容易积集污垢，形成“死角”而染菌。采取罐内壁涂刷防腐涂料、加强清洗并定期铲除污垢等是有效消除染菌的措施。第三节 杂菌污染的途径和防治 发酵罐的制作不良，如不锈钢衬里焊接质量不好，使不锈钢与碳钢之间不能紧贴，导致不锈钢与碳钢之间有空气存在，在灭菌加温时，由于不锈钢、碳钢和空气这三者的膨胀系数不同，不锈钢会鼓起，严重者还会破裂，发酵液通过裂缝进入夹层从而造成“死角”染菌。采用不锈钢或复合钢可有效克服此弊端。同时发酵罐封头上的人孔、

36、排气管接口、照明灯口、视镜口、进料管口、压力表接口等也是造成“死角”的潜在因素，一般通过安装边阀，使灭菌彻底，并注意清洗是可以避免染菌的。第三节 杂菌污染的途径和防治 除此之外，发酵罐底常有培养基中的固形物堆积，形成硬块，这些硬块包藏有脏物，且有一定的绝热性，使藏在里面的脏物、杂菌不能在灭菌时候被杀死而染菌，通过加强罐体清洗、适当降低搅拌桨位置都可减少罐底积垢，减少染菌。发酵罐的修补焊接位置不当也会留下“死角”而染菌。 管路的安装或管路的配置不合理易形成“死角”染菌。发酵过程中与发酵罐连接的管路很多，如空气、蒸汽、水、物料、排气、排污管等，一般来讲，管路的连接方式要有特殊的防止微生物污染的要求

37、，对于接种、取样、补料和加油等管路一般要求配置单独的灭菌系统，能在发酵罐灭菌后或发酵过程中进行单独的灭菌。 第三节 杂菌污染的途径和防治 发酵工厂的管路配置的原则是使罐体和有关管路都可用蒸汽进行灭菌，即保证蒸汽能够达到所有需要灭菌的部位。在实际生产过程中，为了减少管材，经常将一些管路汇集到一条总的管路上，如将若干只发酵罐的排气管汇集在一条总的排气管上，在使用中会产生相互串通、相互干扰，一只罐染菌往往会影响其他罐，造成其他发酵罐的连锁染菌，不利于染菌的防治。采用单独的排气、排水和排污管可有效防止染菌的发生。第三节 杂菌污染的途径和防治 生产上发酵过程的管路大多数是以法兰连接，但常会发生诸如垫圈大

38、小不配套、法兰不平整、安装未对中、法兰与管子的焊接不好、受热不均匀使法兰翘曲以及密封面不平等现象，从而形成“死角”而染菌。因此，法兰的加工、焊接和安装要符合灭菌的要求，务必使各衔接处管道畅通、光滑、密封性好，垫片的内径与法兰内径匹配，安装时对准中心，甚至尽可能减少或取消连接法兰等措施，以避免和减少管道出现“死角”而染菌。第三节 杂菌污染的途径和防治 管件的渗漏易造成染菌。实际上管件的渗漏主要是指阀门的渗漏，目前生产上使用的阀门不能完全满足发酵工程的工艺要求，是造成发酵染菌的主要原因之一。采用加工精度高、材料好的阀门可减少此类染菌的发生。 五、噬菌体污染及其防治五、噬菌体污染及其防治 利用细菌或

39、放线菌进行的发酵生产容易受噬菌体的污染，由于噬菌体的感染力非常强，传播蔓延迅速，且较难防治，对发酵生产有很大威胁。噬菌体是一种病毒，其直径约0.1m，可以通过环境污染、设备的渗漏或“死角”、空气系统、培养基灭菌过程、补料过程及操作过程等环节进入发酵系统。第三节 杂菌污染的途径和防治 由于发酵过程中噬菌体侵染的时间、程度不同以及噬菌体的“毒力”和菌株的敏感性不同，所表现的症状也不同。比如氨基酸的发酵过程，感染噬菌体后，常使发酵液的光密度在发酵初期不上升或回降；pH值逐渐上升，可到8.0以上，且不再下降或pH值稍有下降，停滞在pH=77.2之间，氨的利用停止；糖耗、温升缓慢或停止；产生大量的泡沫，

40、有时使发酵液呈现黏胶状；谷氨酸的产量很少、增长缓慢或停止；镜检时可发现菌体数量显著减少，甚至找不到完整的菌体；CO2排出量异常，产物含量急剧下降；发酵周期延长，培养时间延长；发酵液发红、发灰，泡沫很多、难中和，提取分离困难，收率很低等。第三节 杂菌污染的途径和防治 噬菌体在自然界中分布很广，在土壤、腐烂的有机物和空气中均有存在，一般来说，造成噬菌体污染必须具备有噬菌体、活菌体、噬菌体与活菌体接触的机会和适宜的环境等条件。噬菌体是专一性的活菌寄生体，脱离寄主噬菌体不能自行生长繁殖，由于作为寄主的菌体的大量存在，并且噬菌体对于干燥有相当强的抗性，同时噬菌体有时也能脱离寄主在环境中长期存在。在实际生

41、产中，常由于空气的传播，使噬菌体潜入发酵的各个环节，从而造成污染。因此，环境污染噬菌体是造成噬菌体感染的主要根源。第三节 杂菌污染的途径和防治 至今最有效的防治噬菌体染菌的方法是净化环境为中心的综合防治法，主要有净化生产环境、消灭污染源、改进提高空气的净化度、保证纯种培养、做到种子本身不带噬菌体、轮换使用不同类型的菌种、使用抗噬菌体的菌种、改进设备装置、消灭“死角”、药物防治等措施。噬菌体的防治是一项系统工程，从培养基的制备、培养基灭菌、种子培养、空气净化系统、环境卫生、设备、管道、车间布局及职工工作责任心等诸多方面，分段检查把关，才能做到根治噬菌体的危害。 第三节 杂菌污染的途径和防治 具体

42、归纳以下几点： （1）严格活菌体排放，切断噬菌体的“根源” ； （2）做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌； （3）严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内； （5）抑制罐内噬菌体的生长。 生产中一旦污染噬菌体，可采取下列措施加以挽救。 （1）并罐法 利用噬菌体只能在处于生长繁殖细胞中增殖的特点，当发现发酵罐初期污染噬菌体时，可采用并罐法。即将其他罐批发酵1618h左右的发酵液，以等体积混合后分别发酵，利用其活力旺盛的种子，不进行加热灭菌，亦不需另行补种，便可正常发酵。但要肯定，并入罐的发酵液不能染杂菌，否则两罐都将染菌。第三节 杂菌污染的途径和防治 （2）轮换使用菌种或使用抗性菌株 发现噬菌体后，停止

43、搅拌，小通风，降低pH值，立即培养要轮换的菌种或抗性种子，培养好后接入发酵罐，并补加1/3正常量的玉米浆（不调pH值）、磷盐和镁盐。如pH值仍偏高，不开搅拌，适当通风，至pH值正常OD值增长后，再开搅拌正常发酵。 （3）放罐重消法 发现噬菌体后，放罐，调pH值（可用盐酸，不能用磷酸），补加1/2正常量的玉米浆和1/3正常量的水解糖，适当降低温度重新灭菌，不补加尿素，接入2的种子，继续发酵。第三节 杂菌污染的途径和防治 （4）罐内灭噬菌体法 发现噬菌体后，停止搅拌，小通风，降低pH值，间接加热到7080，并自顶盖计量器管道（或接种，加油管）内通入蒸汽，自排气口排出。因噬菌体不耐热，加热可杀死发酵

44、液内的噬菌体，通蒸汽杀死发酵罐及管道内的噬菌体。冷却后，如pH值过高，停止搅拌，小通风，降低pH值，接入2倍量的原菌种，至pH值正常后开始搅拌。 当噬菌体污染情况严重，上述方法无法解决时，应调换菌种，或停产全面消毒，待空间和环境噬菌体密度下降后，再恢复生产。第三节 杂菌污染的途径和防治 六、杂菌污染的挽救与处理六、杂菌污染的挽救与处理 发酵过程一旦发生染菌，应根据污染微生物的种类、染菌的时间或杂菌的危害程度等进行挽救或处理，同时对有关设备也进行相应的处理。 1 1种种子子培培养养期期染染菌菌的的处处理理 一旦发现种子受到杂菌的污染，该种子不能再接入发酵罐中进行发酵，应经灭菌后弃之，并对种子罐、

45、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。同时采用备用种子，选择生长正常无染菌的种子接入发酵罐，继续进行发酵生产。如无备用种子，则可选择一个适当菌龄的发酵罐内的发酵液作为种子，进行“倒种”处理，接入新鲜的培养基中进行发酵，从而保证发酵生产的正常进行。第三节 杂菌污染的途径和防治 2 2发发酵酵前前期期染染菌菌的的处处理理 当发酵前期发生染菌后，如培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基加热至规定温度，重新进行灭菌处理后，再接人种子进行发酵；如果此时染菌已造成较大的危害，培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，则可放掉部分料液，补充新鲜的培养基，重新进行灭菌处理后，再接种进行发酵。也可采取降温培养、

46、调节pH值、调整补料量、补加培养基等措施进行处理。第三节 杂菌污染的途径和防治 3 3发发酵酵中中、后后期期染染菌菌 处理发酵中、后期染菌或发酵前期轻微染菌而发现较晚时，可以加入适当的杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长速度，也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等其他措施，进行处理。当然如果发酵过程的产物代谢已达一定水平，此时产品的含量若达一定值，只要明确是染菌也可放罐。对于没有提取价值的发酵液，废弃前应加热至120以上、保持30min后才能排放。 4 4染染菌菌后后对对设设备备的的处处理理 染菌后的发酵罐在重新使用前，必须在放罐后进行彻底清洗，空罐加热灭菌后至120以上、30min后，才能使用。也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等方法进行处理。