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1、分子荧光分析分子荧光分析 概述概述分子荧光发光的机理分子荧光发光的机理影响荧光发光的因素影响荧光发光的因素定量分析方法定量分析方法分子荧光分析法在医学检验中的应用分子荧光分析法在医学检验中的应用概述概述 发光分析是受激物质分子或原子以发射发光分析是受激物质分子或原子以发射辐射的形式释放能量，测量的是物质分子或辐射的形式释放能量，测量的是物质分子或原子自身发射辐射的强度，属于原子自身发射辐射的强度，属于发射光谱法发射光谱法。 发光分析法包括发光分析法包括荧光分析法荧光分析法，磷光分析，磷光分析，原子荧光分光光度法和化学发光分析。原子荧光分光光度法和化学发光分析。 分子吸收了光能而被激发到较高能态
2、，分子吸收了光能而被激发到较高能态，在返回基态时，发射出与吸收光波长相等或在返回基态时，发射出与吸收光波长相等或不等的辐射，这种现象称为不等的辐射，这种现象称为光致发光光致发光，分子，分子荧光分析是基于这类光致发光现象而建立起荧光分析是基于这类光致发光现象而建立起来的分析方法。来的分析方法。 分子分子荧光荧光分析分析 物质的基态分子受一激发光源的照射，被激发至激发态物质的基态分子受一激发光源的照射，被激发至激发态后，在返回基态时发射出波长与入射光相同或较长的光，称后，在返回基态时发射出波长与入射光相同或较长的光，称为为荧光荧光。一种物质分子能否发射出荧光取决于它本身的分子。一种物质分子能否发射
3、出荧光取决于它本身的分子结构和它所在的环境条件。结构和它所在的环境条件。 通常所指的荧光是指通常所指的荧光是指紫外紫外-可见光荧光可见光荧光，即利用某些物，即利用某些物质受到紫外质受到紫外-可见光照射后，发射出比吸收的紫外可见光照射后，发射出比吸收的紫外-可见光波可见光波长更长或相等的紫外长更长或相等的紫外-可见光荧光。可见光荧光。通过测定物质分子产生的通过测定物质分子产生的荧光强度进行分析的方法称为分子荧光分析。荧光强度进行分析的方法称为分子荧光分析。 荧光分析可应用于物质的荧光分析可应用于物质的定性定性及及定量定量，由于物质结构不，由于物质结构不同，所能吸收的紫外同，所能吸收的紫外-可见光
4、波长不同，所发射的荧光波长也可见光波长不同，所发射的荧光波长也不同，利用这个性质可鉴别物质。对于同一物质的稀溶液，不同，利用这个性质可鉴别物质。对于同一物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度呈线性关系，利用这个性质可以进其产生的荧光强度与浓度呈线性关系，利用这个性质可以进行定量测定。行定量测定。主要特点主要特点 ：1.1.灵敏度高灵敏度高 ：检出限为：检出限为1010-4-41010-6-6g/L g/L 。较紫。较紫外外- -可见分光光度法高可见分光光度法高1313个数量级。个数量级。 2.2.选择性强选择性强 ：能吸收光的物质并不一定能产：能吸收光的物质并不一定能产生荧光，且不同物质由于结构
5、不同，虽吸收生荧光，且不同物质由于结构不同，虽吸收同一波长的光，但产生的荧光波长也不尽相同一波长的光，但产生的荧光波长也不尽相同同 。3.3.用样量少、操作简便用样量少、操作简便 。 缺点缺点 : : 许多物质本身不会发射荧许多物质本身不会发射荧光光 应用不够广泛应用不够广泛 分子荧光发光的机理分子荧光发光的机理分子的去活化过程：当处于基态单重态（S0）的分子吸收波长为1和2的辐射后,分别被激发到第一激发单重态（S1*）和第二激发单重态(S2*)的任意振动能级上,而后发生以下过程： 振动弛豫: 在溶液中，受激的溶质分子与溶剂分子碰撞，而失去过剩的能量，以10-1310-11 s的极快速度，降至
6、同一电子态的最低能级上，这一过程属于无辐射跃迁。内转换:当两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，如第一激发单重态的较高振动能级与第二激发单重态的某一较低振动能级的位能相同，可发生电子由高电子能级以无辐射跃迁的方式跃迁至低能级上。此过程效率高，速度快，一般只需10-1310-11s。 荧光发射: 处于激发单重态的最低振动能级的分子，也存在几种可能的去活化过程。若以10-910-7s左右的时间发射光量子回到基态的各振动能级，这一过程就有荧光发生。激发光谱和荧光光谱: 任何荧光物质都具有两个特征光谱，即激发光谱和荧光光谱。 激发光谱:如果将激发光的光源用单色器分光，测定不同波长激发光照射下荧光
7、强度的变化，以激发波长（）为横坐标，荧光强度（IF）为纵坐标作图，便可得到荧光物质的激发光谱。 荧光光谱:固定激发光波长和强度，而让物质发出的荧光通过单色器测定不同波长的荧光强度。以荧光的波长（）为横坐标，荧光强度（IF）为纵坐标作图，便得荧光光谱。硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱 蒽的激发光谱和荧光光谱 荧光物质的最大激发波长和最大荧光波长是鉴定物质的根据，也是定量测定时最灵敏的条件。 影响荧光发光的因素影响荧光发光的因素分子结构影响荧光发光分子产生荧光的条件 ：物质必须具有能吸收一定频率紫外光的特定结构； 物质分子在吸收了一定频率的紫外能之后，必须具有较高的荧光效率，用F表示: F=发出荧光的
8、量子数/吸收激发光的量子数 荧光效率越高，荧光的发射强度越大，无辐射跃迁的几率就越小。当荧光效率等于零时就意味着不能发出荧光。因此荧光物质必须具有较大的荧光效率。 1 具有共轭双键体系的分子： 大多数荧光物质都具有芳香环或杂环，因为这些化合物都具有易发生*或n*跃迁的电子共轭结构， 电子的非定域性越大，就越容易被激发，分子的荧光效率越大，因此凡能提高电子共轭程度的结构，如对-苯基化、间-苯基化、乙烯化的作用都会增大荧光的强度。 2 苯环上取代基的类型： 给电子基团。如-OH、-NH2常使荧光增强。 与电子体系互相作用较小的取代基。如-SO3H对分子荧光影响不明显。 吸电子基团如-COOH、-C
9、O减弱甚至破坏荧光。 3 具有刚性平面结构的分子： 刚性的不饱和的平面结构具有较高的荧光效率，分子刚性及共平面性越大，荧光效率越高，酚酞和荧光素比较，荧光素中多一个氧桥，使分子的三个环成一个平面，其共平面性增加，使电子的共轭度增加，因而荧光素有强烈荧光，而酚酞的荧光很弱。 酚酞 荧光素环境对荧光的影响： 温度的影响：温度改变并不影响辐射过程，但非辐射去活的效率将随温度升高而增强，因此当温度升高时荧光强度通常会下降。 溶剂的影响：随溶剂极性的增加，荧光物质的*跃迁几率增加，荧光强度将增加。溶剂粘度减小，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁几率增加而使荧光强度减弱。若溶剂和荧光物质形成氢键或溶剂使
10、荧光物质的电离状态改变，则荧光波长与荧光强度也会发生改变。 溶液pH的影响：当荧光物质是弱酸或弱碱时，溶液的pH对荧光强度有较大影响。因为弱酸或弱碱在不同酸度中，分子和离子的电离平衡会发生改变，而荧光物质的荧光强度会因其离解状态发生改变。以苯胺为例：在pH712的溶液中会产生蓝色荧光，在pH13的溶液中都不产生荧光。pH13 无荧光 定量分析方法1.校准曲线法：2.标准对照法:3多组分混合物的荧光分析:校准曲线法：以已知量的标准物质，按试样相同方法处理后，配成一系列不同浓度的标准溶液，在仪器调零后再以浓度最大的标准溶液作基准，调节荧光强度读数为100；然后测出其他标准溶液的相对荧光强度和空白溶
11、液的相对荧光强度；扣除空白值后，以荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线；然后将处理后的试样配成一定浓度的溶液，在同一条件下测定其相对荧光强度，扣除空白值后，从校准曲线上求出其含量。分子荧光分析法在医学检验中的应用尿液中的色胺的测定 尿中色胺的含量是色氨酸代谢的一个标志。色胺有天然荧光，激发峰285nm，荧光峰360nm。把尿或组织液的色胺萃取出来，就可直接检测。在0.18g/15mL范围内，荧光强度与色胺浓度呈线性关系。 尿液中维生素B2的测定: 维生素B2（核黄素）在430440nm蓝光照射下会发出绿色荧光，em为535nm。它在pH67的溶液中荧光强度最大，而在pH11时荧光消失；但在碱性溶液经光线照射发生分解作用或在酸性KMnO4氧化下都会生成荧光强度比维生素B2强得多的黄光素，并可溶于氯仿。利用此性质可提高测定的灵敏度和选择性。 核黄素 黄光素 参考文献： 使用仪器分析（杨根元主编 北京大学出版社出版 ）
