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1、16S rDNA基因的基因的PCR扩增扩增1课程章节PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长2课程章节PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物3课程章节PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的
2、设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶4课程章节PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明n n19711971年年，KhoranaKhorana提提出出：经经过过DNADNA变变性性，与与合合适适引引物物杂杂交交，用用DNADNA聚聚合合酶酶延延伸伸引引物物，并并不不断断重重复复该该过过程程便便可可克隆克隆
3、tRNAtRNA基因。基因。n n但但由由于于测测序序和和引引物物合合成成的的困困难难，以以及及7070年年代代基基因因工工程程技技术术的的发发明明使使克克隆隆基基因因成成为为可可能能，所所以以，KhoranaKhorana的的设想被人们遗忘了设想被人们遗忘了5课程章节PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明n n19851985年年，美美国国PE-CetusPE-Cetus公公司司的的MullisMullis等等人人发发明明了了聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）n n基本原理是在试管中模拟细胞内的基本原理是在试管中模拟细胞内的DNADNA复制复制n n最最初初采
4、采用用E-coli E-coli DNADNA聚聚合合酶酶进进行行PCRPCR，由由于于该该酶酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错n n耐耐热热DNADNA聚聚合合酶酶的的应应用用使使得得PCRPCR能能高高效效率率的的进进行行，随随后后PE-CetusPE-Cetus公公司司推推出出了了第第一一台台PCRPCR自自动动化化热热循循环仪环仪n n19931993年，年，MullisMullis等因此项技术获诺贝尔化学奖等因此项技术获诺贝尔化学奖6课程章节Kary B. Mullis 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比
5、喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。7课程章节生物样品生物样品生物样品生物样品DNADNA片段片段基基基基因因因因诊诊诊诊断断断断基基基基因因因因治治治治疗疗疗疗基基基基因因因因工工工工程程程程产产产产品品品品法法法法医医医医学学学学检检检检测测测测人人人人类类类类学学学学研研研研究究究究8课程章节基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA获取特定获取特定获取特定获取特定DNADNADNADNA片段片段片段片段扩扩扩扩增增增增特特特特定定定定D D D DN N N NA A A A片片片片段段段段9课程章节94949494变性变性变性变性50-6550
6、-65退火退火退火退火XX延伸延伸延伸延伸10课程章节949494945555373711课程章节Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性( ( ( (% % % %) ) ) )温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 2012课程章节7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环13课程章节PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的标准的标准的标准的PCRPCRPCRPCR反应体系反应体系反应体系反应体系4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200u
7、mol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0 0. . . .1 12ug2ugTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2 2. . . .5u5uMgMg2+ 2+ 1 1. . . .5mmol/L5mmol/L14课程章节1234522557294时间（min）温度（）PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍15课程章节PCRPCR的基本原理的基本原理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCR
8、PCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA9516课程章节PCRPCR的基本原理的基本原理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点50引物1引物2DNA引物17课程章节PCRPCR的基本原理的基本原理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶18
9、课程章节PCRPCR的基本原理的基本原理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点第1轮结束95第2轮开始19课程章节PCRPCR的基本原理的基本原理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点955072TaqTaqTaqTaq20课程章节PCRPCR的基本原理的基本原理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点72第2轮结束21课程章节PCRPCR的基本原理的基本原理n nPCRPCR反应条件反应条件n nPCRPCR过程过程n nPCRPCR的特点的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增22课程章节我们实验的反应体系我们实验的反应体系n n10Taq聚合酶反应缓冲液2.5Ln ndNTP(20mmol/L)2Ln n5端引物（25pmol/L）1Ln n3端引物（25pmol/L）1Ln n菌体DNA（约50ng/L）1Ln nTaq DNA聚合酶（5U/L）0.5Ln nH2O 补足总体积25L23课程章节n n反应条件为：首轮循环94变性2min；再接9430s，5030s，721min，30个循环；最后72延伸20min。n n取5ul反应液,1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果24课程章节
