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1、第四章第四章 药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证China Pharmaceutical U中国药科大学药物分析教研室中国药科大学药物分析教研室 第四章第四章 药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证定量分析样品前处理方法定量分析样品前处理方法 定量分析方法特点定量分析方法特点 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证1 12 23 3中国药科大学药物分析教研室一、定量分析样品前处理方法一、定量分析样品前处理方法 Pretreatment of sample used in quantitative analysis定量分析样品前处理方法定量分析样品前处理
2、方法 概概 述述12中国药科大学药物分析教研室泛影酸泛影酸碘番酸碘番酸碘苯酯碘苯酯 概概 述述中国药科大学药物分析教研室 概概 述述磺溴酞钠磺溴酞钠三氯叔丁醇三氯叔丁醇中国药科大学药物分析教研室酒石酸锑钾酒石酸锑钾富马酸亚铁富马酸亚铁 概概 述述中国药科大学药物分析教研室 概概 述述含金属有机药物含金属有机药物卡巴胂卡巴胂金属有机药物金属有机药物中国药科大学药物分析教研室定量分析样品前处理方法定量分析样品前处理方法直接测定法含金属或直接测定法含金属或C-MC-M不牢固的有机金属不牢固的有机金属经水解后测定法卤素联脂肪碳链（溶于适当溶剂再水解）经水解后测定法卤素联脂肪碳链（溶于适当溶剂再水解）
3、直接回流后测定直接回流后测定 碱化回流后测定碱化回流后测定 硫酸水解后测定硫酸水解后测定经氧化还原后测定法卤素联芳环牢固（一般用于测碘）经氧化还原后测定法卤素联芳环牢固（一般用于测碘） 碱性还原后测定法如泛影酸碱性还原后测定法如泛影酸 酸性还原后测定法如碘番酸酸性还原后测定法如碘番酸 利用药物中可利用药物中可游离游离的金属离子的氧化性测定含量的金属离子的氧化性测定含量不经有机破坏不经有机破坏的分析方法的分析方法: :中国药科大学药物分析教研室经有机破坏经有机破坏的分析方法的分析方法湿法破坏湿法破坏 HNO3-HClO4 HNO3-H2SO4 H2SO4-MSO4 金属以高价态存在金属以高价态存
4、在干法破坏：无水碳酸钠或氧化镁，注意温度干法破坏：无水碳酸钠或氧化镁，注意温度氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法中国药科大学药物分析教研室空心空心A.燃烧瓶燃烧瓶 B.铂丝网铂丝网 C.D.盛固体样品滤纸及其折叠法盛固体样品滤纸及其折叠法 E.F.G.称取液体样品方法称取液体样品方法7mm50mm30mm尾部尾部7mm13mm20mm25mm35 6mm16 6mm滤纸滤纸滤纸滤纸AGFEDCB氧瓶燃烧装置及称样方法氧瓶燃烧装置及称样方法中国药科大学药物分析教研室氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法 样品样品 吸收液吸收液 测定方法测定方法含含氟氟有机药物有机药物 H2O pH4.3 HAc-NaAc Buffer 茜素氟
5、蓝茜素氟蓝 分光光度法分光光度法含含氯氯有机药物有机药物 NaOH溶液溶液 银量法银量法 汞量法汞量法 分光法分光法含含溴溴有机药物有机药物 H2O2-NaOH液液 或或NaOH液液- 银量法银量法 分光法分光法 硫酸肼饱和液硫酸肼饱和液含含碘碘有机药物有机药物 NaOH液液- 银量法银量法 碘量法碘量法 硫酸肼饱和液硫酸肼饱和液 汞量法汞量法 分光法分光法中国药科大学药物分析教研室碘苯酯含量测定碘苯酯含量测定 取本品约取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用用NaOH T.S. 2ml与与H2O 10ml为吸收液，待吸收完全后，加为吸收液，
6、待吸收完全后，加溴醋酸溴醋酸溶液溶液10 ml，密塞，振摇放置数分钟，加密塞，振摇放置数分钟，加甲酸甲酸约约1ml，用水洗涤瓶口，并通入空气流约用水洗涤瓶口，并通入空气流约35min，以除去剩余的溴蒸以除去剩余的溴蒸气，加气，加KI 2g，密塞，摇匀，用密塞，摇匀，用Na2S2O3液液 (0.02mol/L)滴定，滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每定的结果用空白试验校正。每1ml的硫代硫酸钠液的硫代硫酸钠液(0.02mol/L)相当于相当于1.388mg的的C19H29IO2中国药科大学药物分
7、析教研室二、药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证p 指导原则指导原则p 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证p 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则指导原则p 药物稳定性试验药物稳定性试验指导原则指导原则p 缓释、控释制剂缓释、控释制剂指导原则指导原则p 微囊、微球与脂质体制剂微囊、微球与脂质体制剂指导原则指导原则p 细菌内毒素检查法应用细菌内毒素检查法应用指导原则指导原则中国药科大学药物分析教研室第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证 目的： 证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求证明所采用的分
8、析方法适合于相应的检测要求 效能指标： 评价分析方法的尺度评价分析方法的尺度 效能指标包括: 精密度精密度, , 准确度准确度, , 检测限检测限, ,定量限定量限, ,选择性选择性, , 线性与范围线性与范围, , 耐用性耐用性中国药科大学药物分析教研室(1)(1)准确度准确度（accuracyaccuracy）：）： 测量值与真实值接近的程度测量值与真实值接近的程度 表表 示示: 回收率回收率 测定方法：回收试验测定方法：回收试验 加样回收试验加样回收试验中国药科大学药物分析教研室(2)精密度精密度（precision precision ）：）：定定 义义: 同一样品多次测量值之间相互接
9、近的程度同一样品多次测量值之间相互接近的程度表表 示：示：标准偏差标准偏差(s), 相对标准偏差相对标准偏差(RSD) 重复性重复性: 同一实验室同一实验室,同一人多次测定的精密度同一人多次测定的精密度中间精密度中间精密度: 同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度 重现性重现性: 不同实验室，不同人测定的精密度不同实验室，不同人测定的精密度中国药科大学药物分析教研室(3)(3)专属性专属性（specificityspecificity）: : 指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出可
10、能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性被测物的特性) )。中国药科大学药物分析教研室(4) 检测限检测限（limit of detection， LOD）：）： 药物能被检出的最低浓度药物能被检出的最低浓度(g/ml) 测测 定定: 信噪比法信噪比法(S:N=3:1)(5) 定量限定量限（1imit of quantitation，LOQ）：）： 药物能被定量测出的最低浓度药物能被定量测出的最低浓度(g/ml) 测测 定定: 信噪比法信噪比法(S:N=10:1)第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证 -性能指标性能指标中国药科大学药物分析教研室(6) (6) 线
11、性与范围线性与范围（linearity and rangelinearity and range）：）： 待测物浓度与响应值成线性关系的浓度范围待测物浓度与响应值成线性关系的浓度范围 线性关系：线性关系：Y=a+Y=a+bxbx （r=0.9999)r=0.9999) 线性程度：相关系数线性程度：相关系数 (7) (7) 耐用性耐用性（robustnessrobustness）: : 测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度 影响因素：被测溶液的稳定性，流动相的组成和影响因素：被测溶液的稳定性，流动相的组成和pHpH，商品柱的品牌，柱温等商品柱的品牌，柱
12、温等第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证 -性能指标性能指标中国药科大学药物分析教研室检验项目和验证内容：检验项目和验证内容：项目内容项目内容 鉴别鉴别杂质测定杂质测定含量测定及溶出含量测定及溶出量测定量测定定量定量限度限度准确度准确度精密度精密度重复性重复性中间精密度中间精密度 专属性专属性检测限检测限 定量限定量限线性线性范围范围耐用性耐用性 已有重现已有重现性验证，性验证，不需验证不需验证中间精密中间精密度度 如一种方如一种方法不够专法不够专属，可用属，可用其他分析其他分析方法予以方法予以补充补充 视具体情视具体情况予以验况予以验证证中国药科大学药物分析教研室第
13、四节第四节 生物样品分析的基本步骤生物样品分析的基本步骤1. 药物从蛋白结合或缀合物中释出药物从蛋白结合或缀合物中释出 蛋白变性：如应用三氯醋酸、蛋白变性：如应用三氯醋酸、HClO4、有机溶剂有机溶剂(乙醇、丙酮、乙腈乙醇、丙酮、乙腈)使蛋白沉淀使蛋白沉淀 盐酸水解盐酸水解 酶消化法：最常使用蛋白水解酶中枯草菌溶素酶消化法：最常使用蛋白水解酶中枯草菌溶素(一种细菌性蛋白分解酶，可在一种细菌性蛋白分解酶，可在pH 7.011.0使肽使肽键降解键降解)中国药科大学药物分析教研室中国药科大学药物分析教研室定量分析方法的验证定量分析方法的验证 -生物样品分析生物样品分析（一）特异性（一）特异性内源性物
14、质不得干扰原药、代谢物内源性物质不得干扰原药、代谢物（二）标准曲线（二）标准曲线r0.9900，至少至少5个浓度，不许外延个浓度，不许外延（三）精密度和准确度（三）精密度和准确度RSD15、20相对回收率相对回收率85115（80120）中国药科大学药物分析教研室（四）最低定量限（四）最低定量限LOQLOQ3535倍倍t t1/21/2，或或1/101/101/201/20倍倍C Cmaxmax（五）样品稳定性五）样品稳定性室温、冻融、冰冻长期室温、冻融、冰冻长期（六）提取回收率（绝对回收率）（六）提取回收率（绝对回收率）一般低于一般低于100100，须稳定，须稳定（七）质控样品（七）质控样品
15、已知浓度样品均匀放入待测生物样品序列中，以已知浓度样品均匀放入待测生物样品序列中，以确保定量测定的准确度确保定量测定的准确度定量分析方法的验证定量分析方法的验证 -生物样品分析生物样品分析中国药科大学药物分析教研室样品样品 固相净化固相净化 及及 反相高效液相色谱法反相高效液相色谱法测定血浆中茶碱测定血浆中茶碱伍朝筼等伍朝筼等 药学学报药学学报,1989,24(10):769773中国药科大学药物分析教研室血浆样品血浆样品 净化后空白血浆净化后空白血浆 净化前空白血浆净化前空白血浆Column Zorbax C18 5m 2.5cm4.6mm 254nmPrecolumn YWG-ODS 9-11m 54.6mmMobile Phase:甲醇-醋酸钠(0.05mol/L pH3.0)500512 8 4 0min茶碱咖啡因12 8 4 0min12 8 4 0min中国药科大学药物分析教研室50 100 150 200252015105茶碱(g/ml)(min)五例病人血浆茶碱五例病人血浆茶碱浓度测定浓度测定6.412.8 19.225.6 3232.41.81.20.60茶碱(g/ml)标准曲线标准曲线Y=9.566 10-2X+6.153 10-3 r=0.9995
