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1、复习1.基因工程中基本工具有哪些？2.基本工具的作用和特点分别是什么？3.限制酶、DNA连接酶分别作用于DNA的什么部位？4.基因工程的基本步骤是什么？5.获得目的基因的方式有哪些？1课资参照 目的基因目的基因2课资参照1 1 1 1质粒是基因工程最常用的运载体，它的主要特点质粒是基因工程最常用的运载体，它的主要特点质粒是基因工程最常用的运载体，它的主要特点质粒是基因工程最常用的运载体，它的主要特点 是：是：是：是： ( )( )( )( ) 能自主复制能自主复制能自主复制能自主复制 不能自主复制不能自主复制不能自主复制不能自主复制 结构很小结构很小结构很小结构很小 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质
2、环状环状环状环状RNARNARNARNA 环状环状环状环状DNADNADNADNA 能能能能“ “友好友好友好友好” ”地地地地“ “借居借居借居借居” ” A A A AB B B B C C C CD D D D C2 2 2 2下列不是基因载体必须具备的条件的是下列不是基因载体必须具备的条件的是 ( )( ) A A、能自我复制、能自我复制 B B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C C、具有标记基因、具有标记基因 D D、它是环状、它是环状DNADNAD3课资参照4课资参照真核生物的基因结构真核生物的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNA聚合聚合酶结合位点酶
3、结合位点前体信使前体信使RNA成熟的信使成熟的信使RNA5课资参照第二节第二节基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序6课资参照（一）获得目的基因（一）获得目的基因（二）构建基因表达载体（二）构建基因表达载体形成重组形成重组DNA分子分子（三）将目的基因导入受体细胞（三）将目的基因导入受体细胞（四）目的基因的检测与鉴定（四）目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序7课资参照用用DNADNA合成仪人工合成合成仪人工合成利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增已知序列：已知序列：从基因文库获得从基因文库获得未知序列：未知序列：（一）目的基因的获取：（一）目的基因的获取：目的
4、基因即我们所需要的目的基因即我们所需要的 基因。基因。基因组文库：含某种生基因组文库：含某种生物的全部基因物的全部基因部分基因文库：含某种部分基因文库：含某种生物的部分基因生物的部分基因（如（如cDNAcDNA文库）文库）8课资参照cDNA文库文库基因组文库基因组文库从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因9课资参照鸟枪法：散弹射击法供体细胞DNA限限制制酶酶许多DNA片段载入载体导入受体细菌扩增产生特定性状分离目的基因构建基因组文库并获得目的基因：10课资参照 基因组基因组DNADNA文库的构建文库的构建 将将总总DNADNA经经过过酶酶解解，分分离离不不同同长长短短的的DNADNA
5、片片段段。包包含含的的基基因因组组片片段段分分别别克克隆隆在在质质粒粒或或噬噬菌菌体体载载体体上上，转转染染细细菌菌或或体体外外包包装装到到噬噬菌菌体体颗颗粒粒上上便便构构成成了了该该生生物物的的基因组文库。基因组文库。11课资参照目的基因的mRNA逆转录单链DNA合成双链DNA（目的基因）逆转录法构建构建cDNA文库并获得目的基因文库并获得目的基因载入载体导入受体细菌扩增产生特定性状分离目的基因12课资参照13课资参照14课资参照蛋白质氨基酸序列推测mRNA的核苷酸序列推测结构基因的核苷酸序列（单链）根据已知氨基酸序列直接合成DNA化学合成人工合成核苷酸序列已知，把将要合成的DNA序列输入到
6、DNA合成仪，用化学方法直接人工合成15课资参照聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction) Kary B. MullisKary B. MullisPCRPCR是由美国科学家是由美国科学家穆利斯提出的一种穆利斯提出的一种穆利斯提出的一种穆利斯提出的一种体外体外体外体外简化条件下模拟简化条件下模拟简化条件下模拟简化条件下模拟DNADNADNADNA体内复制的体内复制的体内复制的体内复制的DNADNADNADNA快速扩增的方法快速扩增的方法快速扩增的方法快速扩增的方法，此技术获得，此技术获得，此技术获得，此技术获得1993199319931993年诺
7、贝年诺贝年诺贝年诺贝尔化学奖。尔化学奖。尔化学奖。尔化学奖。16课资参照 PCR的反应体系的反应体系 模板：模板：DNA 原料：原料：四种四种 脱氧核苷酸；脱氧核苷酸； 酶：酶：Taq酶（酶（ TaqDNA聚合酶）聚合酶）嗜热细菌中分离嗜热细菌中分离得到得到 引物：引物：DNA片段片段 MgMg2+2+（维持酶活性所必需）（维持酶活性所必需） PCRPCR缓冲液：缓冲液：维持维持PH恒定，保护恒定，保护Taq酶酶 17课资参照PCRPCR反应过程可分为三步：反应过程可分为三步：变性、退火、延伸变性、退火、延伸1变性变性 双链模板双链模板DNA解离为单链结构。（解离为单链结构。（9095）DNA
8、双链双链DNA单链单链变性变性18课资参照2退火退火 引物与模板互补成双链。引物与模板互补成双链。 （5560） (由于引物浓度高，序列短，所以易与模板由于引物浓度高，序列短，所以易与模板结合。结合。)PCRPCR反应过程可分为三步：反应过程可分为三步：变性、退火、延伸变性、退火、延伸引物引物19课资参照PCRPCR反应过程可分为三步：反应过程可分为三步：变性、退火、延伸变性、退火、延伸3延伸延伸 在在Taq酶酶作用下，合成特异作用下，合成特异DNA序列。序列。7075延伸延伸20课资参照变性变性第二次循环第二次循环21课资参照退火退火第二次循环第二次循环22课资参照延伸延伸第二次循环第二次循
9、环23课资参照 PCRPCR反应曲线反应曲线 理论上，理论上，PCRPCR反应产物呈指数增长，但这种增长形式在扩增反应产物呈指数增长，但这种增长形式在扩增25-25-3030个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台。此时扩增产物个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台。此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。量不再随循环次数的增加而呈指数增长。24课资参照PCR仪程序设定仪程序设定25课资参照PCR的应用的应用PCRPCR具有省时、操作简便、特异性强、灵敏具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。度高、效率高、应用范围广等特点。PCRPCR技技术在术在分子生物学、医
10、学和案件侦破分子生物学、医学和案件侦破等领域等领域得到广泛应用。得到广泛应用。26课资参照实例 1：1、下列获取目的基因的方法中需要模板链是、下列获取目的基因的方法中需要模板链是（ ）A.从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因B.利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因C.反转录法反转录法D.通过通过DNA合成仪利用化学方法人工合成合成仪利用化学方法人工合成27课资参照（二）基因表达载体的构建（二）基因表达载体的构建形成重组形成重组DNA分子分子切割目的基因和质粒的限制酶是同一种限制酶吗？切割目的基因和质粒的限制酶是同一种限制酶吗？同一种同一种28课资参照目的：目的：使目的基因
11、在受体细胞中稳定存在，并遗传使目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，使目的基因表达和发挥作用。给下一代，使目的基因表达和发挥作用。29课资参照目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为定和表达的过程，称为转化转化。常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、 土土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞等壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞等 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞30课资参照常用的受体细胞：常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母有
12、大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。菌和动植物细胞等。菌和动植物细胞等。菌和动植物细胞等。主要借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。主要借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。导入方式：导入方式：（三）将重组（三）将重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞31课资参照导入微生物细胞导入微生物细胞将目的基因克隆到大肠将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：杆菌细胞中的操作步骤：1)1)获得目的基因和质粒载体；获得目的基因和质粒载体；2)2)形成重组质粒；形成重组质粒；3)3)制制备备感感受受态态细细胞胞，用用重重组组质质粒转化大肠杆菌细胞；粒转化大肠杆菌
13、细胞；4)4)培培养养大大肠肠杆杆菌菌，让让重重组组质质粒粒形成大量拷贝；形成大量拷贝；5)5)筛筛选选含含重重组组质质粒粒的的大大肠肠杆杆菌菌细胞。细胞。32课资参照导入植物细胞：导入植物细胞：土壤农杆菌转化法土壤农杆菌转化法土壤农杆菌：具有趋化性（酚），感染双子叶植物土壤农杆菌：具有趋化性（酚），感染双子叶植物和裸子植物和裸子植物33课资参照基基 因因 枪枪 法：法：单子叶植物常用的一单子叶植物常用的一种基因转化方法，但种基因转化方法，但成本较高。成本较高。花粉管通道法：花粉管通道法：十分简便经济的十分简便经济的方法。我国的转方法。我国的转基因抗虫棉就是基因抗虫棉就是用此方法获得。用此方法
14、获得。34课资参照 将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序： 重组重组DNA提纯提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 受精卵发育受精卵发育 新性状动物新性状动物35课资参照转基因动物转基因动物36课资参照1.1.筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是否导入受体细胞。否导入受体细胞。（1）抗药性筛选法：）抗药性筛选法：菌株为某种抗生素缺陷型，菌株为某种抗生素缺陷型， 而质粒上带有该抗而质粒上带有该抗性基因（如抗氨苄青霉素，抗卡拉霉素等）。性
15、基因（如抗氨苄青霉素，抗卡拉霉素等）。如何筛选出含有目的基因的受体细胞？如何筛选出含有目的基因的受体细胞？（这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基（这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。）上长出。）（四）目的基因的检测与鉴定（四）目的基因的检测与鉴定37课资参照pBR322质粒结构质粒结构如果外源如果外源DNA插入，插入，氨卞青霉素氨卞青霉素抗性基因失抗性基因失活活标记基因标记基因进行筛选进行筛选限制性内切酶限制性内切酶识别序列识别序列外源基因连接外源基因连接PStPSt自主复制自主复制38课资参照（2 2） DNA分子杂交分子杂交检测转基因生物染色体检测转基因生物染色体的的DNADN
16、A上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA用含目的基因的用含目的基因的DNA片段片段（单链）（单链）用放射性同用放射性同位素等作标记位素等作标记,以此做探针以此做探针使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂若显示出杂交带交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中过程过程:39课资参照利用利用DNA分子杂交筛选含有目的基因的细菌克隆分子杂交筛选含有目的基因的细菌克隆检测方法：检测方法： DNA分子杂交技术分子杂交技术40课资参照DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，
17、将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 41课资参照2.检测目的基因的表达检测目的基因的表达检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质目的基因成功表达的标志目的基因成功表达的标志体现特定性状体现特定性状检
18、测性状检测性状42课资参照 （3 3）鉴定（个体生物学水平）：）鉴定（个体生物学水平）：（1 1）检测目的基因是否转录出了）检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA（2 2）检测目的基因是否翻译成蛋白质）检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法: :分分 子子 杂杂 交交方法方法: :抗原抗原抗体杂交抗体杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若若出现杂交带出现杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA43课资参照44课资参照回答问题：回答问题：1、基因工程的别名：、基因工程的别名：2
19、、操作环境：、操作环境：3、操作对象：、操作对象：4、操作水平：、操作水平：5、基本过程：、基本过程：6、结果：、结果：基因拼接技术或重组基因拼接技术或重组DNA技术技术生物体外生物体外基因基因DNA分子水平分子水平人类需要的基因产物或新的性状人类需要的基因产物或新的性状45课资参照思考：思考：珠蛋白是珠蛋白是动物血物血红蛋白的重要蛋白的重要组成成分。成成分。当它的成分异常当它的成分异常时，动物有可能患某种疾物有可能患某种疾病，如病，如镰刀形刀形细胞胞贫血症。假如血症。假如让你用基你用基因工程的方法，使大因工程的方法，使大肠杆菌生杆菌生产出鼠的出鼠的珠蛋白，想一想，应如何进行设计？珠蛋白，想一想，应如何进行设计？46课资参照
