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1、核酸生物化学核酸生物化学南开大学生命科学学院南开大学生命科学学院赵立青赵立青20261032lqzhaonankai.edu核酸核酸DNA、RNA是是遗传信息的信息的载体体生命活生命活动中居中心位置中居中心位置基因工程引基因工程引领现代生物技代生物技术基于核酸研基于核酸研讨成就成就基因基因组测序、功能基因序、功能基因组研研讨现代生命代生命科学一切分支科学一切分支第一章第一章 核酸的构造核酸的构造一、概述一、概述1.核酸构造研核酸构造研讨的作用的作用1865，GregorMendel创建建遗传学学基因基因1911，ThomasH.Morgan美美染色体染色体遗传实际：基因在染色体上呈：基因在染色
2、体上呈线状状陈列列TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1933作用作用生物生物进化化；农业、医、医药问题基因基因组成？基因控制功能？基因复制？成？基因控制功能？基因复制？MendelMorgan基因的物理性质？基因的物理性质？1918，MDelbrck徳徳“论基因突基因突变和基因和基因构造的性构造的性质，噬菌体，噬菌体团队，基因复制，基因复制亲代噬菌体代噬菌体颗粒如何在半小粒如何在半小时内内产生上百个子代生上百个子代颗粒粒TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine19691944，ErwinSchrodinger奥奥：基因是：基因是
3、遗传信息信息携携带者；由延者；由延续的几种符号反复的几种符号反复组成成DelbrckSchrodinger基因的化学本质？基因的化学本质？1868，FriedrichMiescher瑞从瑞从脓细胞核中胞核中分分别出了一出了一种含磷酸的有机物，核素种含磷酸的有机物，核素nuclein核酸核酸nucleicacid1877，AlbrechtKossel徳徳细胞核中的非蛋白胞核中的非蛋白组分分核酸，分核酸，分别出各种出各种嘌呤、呤、嘧啶，核糖，核糖TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1910MiescherKosselDNA是遗传物质是遗传物质1944，Oswald
4、Avery美美细菌菌转化化实验1952，AlfredHershey美美&MarthaChase美美Hershey-Chaseexperiments噬菌体侵染噬菌体侵染实验HersheyTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine19691953，JamesWatson美美&FrancisCrick英英DNA双螺旋构造双螺旋构造TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962Waston美美&Crick英英JamesDeweyWatson，1928FrancisHarryComptonCrick，19162004Happy Birthday
5、,Double Helix 爱尔兰科学家爱尔兰科学家Maurice Wilkins 为为DNA构造确立作出奉献的其他几位科学家构造确立作出奉献的其他几位科学家英国女科学家英国女科学家RosalindFranklin美国化学家美国化学家Linus Pauling DNA纤维纤维X-衍射图谱衍射图谱WilkinsFranklinWaston&Crick发表在发表在nature上上的文章的文章DNAdoublehelix核酸研讨进展核酸研讨进展1957，MathewMeselson&FranklinStahlDNA的半保管复制的半保管复制1958，FrancisCrick中心法那么中心法那么1972
6、，PaulBerg美美recombinantDNANobelPrizeinChemistry19521973，S.Cohen&H.Boyer美美genecloning1975-1977，FrederickSanger英英DNASequencingNobelPrizeinChemistry19801990，HumanGenomeProjectRNA世界世界1980，ThomasR.Cech美美RibozymetheNobelPrizeinChemistry19891986，BenneRNAeditingRNAinterference(RNAi)：1995，康乃，康乃尔大学的大学的SuGuo&Ke
7、mphues秀秀丽线虫；虫；1998，华盛盛顿卡卡耐基研耐基研讨院的院的AndrewFire和和马萨诸塞大学癌症中塞大学癌症中心的心的CraigMelloNobelPrizeinphysiologyormedicine2006microRNA&piRNA：1993，LeeRC,FeinbaumRL,AmbrosV.线虫虫Lin-4TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2021TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2021jointlytoElizabethH.Blackburn(USA),CarolW.Greider(USA)an
8、dJackW.Szostak(USA)forthediscoveryofhowchromosomesareprotectedbytelomeresandtheenzymetelomeraseElizabethH.BlackburnUniversityofCaliforniaSanFrancisco,CA,USACarolW.GreiderJohnsHopkinsUniversitySchoolofMedicineBaltimore,MD,USAJackW.SzostakHarvardMedicalSchool;MassachusettsGeneralHospitalBoston,MA,USA复
9、制的半不延续性复制的半不延续性semi-discontinuous replication3 5 3 5 解链方向解链方向35335领头链领头链/前导链前导链(leadingstrand)随从链随从链/滞后链滞后链(laggingstrand)冈崎片段冈崎片段okazakifragmentDNA两条链都可作模板两条链都可作模板DNA链合成方向：链合成方向：53 5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 真核生物染色体真核生物染色体DNA呈线状，复制呈线状，复制在末端停顿。在末端停顿。5 功能功能 维持染色体的持染色体的稳定性定性 维持持DNADNA复制生殖复制生殖细胞的完好
10、性胞的完好性TTTTGGGGTTTTGGGG端粒端粒(telomere)真核生物染色体线性真核生物染色体线性DNA分子末端的构造。分子末端的构造。构造特点构造特点由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。末端末端DNA序列是多次反复的富含序列是多次反复的富含G/C碱基的短碱基的短序列进化上高度保守，人序列进化上高度保守，人TTAGGG。端粒端粒Telomere端粒酶端粒酶(telomerase)组成成含有含有RNA的的DNA聚合聚合酶端粒端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒端粒酶协同蛋白同蛋白(human telomerase assoc
11、iated protein 1, hTP1)端粒端粒酶逆逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 四膜虫四膜虫拟南芥拟南芥 端粒酶的作用端粒酶的作用DNADNA聚合酶复制子链聚合酶复制子链进一步加工进一步加工2021NobelPrizeinChemistryVenkatramanRamakrishnan、ThomasA.SteitzandAdaE.YonathwillshareTheNobelPrizeinChemistry2021forstudiesofthestructureandfunctionoftheribosome。2.核
12、酸构造研讨的主要方法核酸构造研讨的主要方法X-光晶体构造分析：利用晶体构成的光晶体构造分析：利用晶体构成的X射线衍射，射线衍射，对物质进展内部原子在空间分布情况的构造分对物质进展内部原子在空间分布情况的构造分析方法。将具有一定波长的析方法。将具有一定波长的X射线照射到结晶性射线照射到结晶性物质上时，物质上时，X射线因在结晶内遇到规那么陈列的射线因在结晶内遇到规那么陈列的原子或离子而发生散射，散射的原子或离子而发生散射，散射的X射线在某些方射线在某些方向上相位得到加强，从而显示与结晶构造相对向上相位得到加强，从而显示与结晶构造相对应的特有的衍射景象。应的特有的衍射景象。核磁共振核磁共振nucle
13、armagneticresonance)：半数以：半数以上的原子核具有自旋，旋转时产生一小磁场。当上的原子核具有自旋，旋转时产生一小磁场。当加一外磁场，这些原子核的能级将分裂。假设以加一外磁场，这些原子核的能级将分裂。假设以某特定频率的射频脉冲激发该自旋系统，那么原某特定频率的射频脉冲激发该自旋系统，那么原子核就能吸收能量从低能态跃迁到高能态。这种子核就能吸收能量从低能态跃迁到高能态。这种跃迁称为核磁共振。检测电磁波被吸收的情况就跃迁称为核磁共振。检测电磁波被吸收的情况就可得到该核磁共振波谱可得到该核磁共振波谱(1D-NMR谱谱)。二、二、DNA的构造的构造1.核苷酸残基中各基核苷酸残基中各基
14、团的性的性质影响核酸的特性影响核酸的特性磷酸基磷酸基团的的pK1，使核酸呈酸性在，使核酸呈酸性在细胞中以胞中以“盐的方式存在；的方式存在；呋喃核糖或脱氧核糖的构象影响核酸喃核糖或脱氧核糖的构象影响核酸链的空的空间构造；构造；RNA的的2-羟基使基使RNA比比DNA具有更活具有更活泼的化学的化学性性质；2.Chargaff定律及定律及DNA纤维X射射线衍射衍射分析分析Waston-Crick模型模型X射射线衍射衍射图照片由两区域照片由两区域组成：碱基的有成：碱基的有规那么空那么空间陈列；列；链的空的空间构型构型十字形十字形螺旋方式螺旋方式顶端端-底部黑色区域底部黑色区域碱基相距碱基相距0.34n
15、m，规那么那么叠加，垂直于螺旋叠加，垂直于螺旋轴两种周期：两种周期：0.34nm；3.4nm两条两条链Watson-Crick模型模型3.DNA半晶体半晶体X射射线衍射衍射更准确更准确的构造信息的构造信息Waston-Crick模型：一周螺旋模型：一周螺旋10bp，核苷酸，核苷酸间夹角角36度度DNA构造的平均特征构造的平均特征Dickerson：脱氧核糖核苷酸十二聚体：脱氧核糖核苷酸十二聚体X射射线衍射衍射一周螺旋平均一周螺旋平均10.4bp，核苷酸，核苷酸间夹角角28-42度；碱基度；碱基对非共平面非共平面碱基对的螺旋桨扭曲碱基对的螺旋桨扭曲Dickerson：螺旋：螺旋桨扭曲扭曲提高碱基
16、堆提高碱基堆积力力4.DNA的构造可受的构造可受环境条件的影响而改境条件的影响而改动DNA能以多种不同的构象存在能以多种不同的构象存在Watson-Crick构造：生理条件下具随机构造：生理条件下具随机顺序序DNA的最的最稳定构造定构造B型型DNA生理条件下生理条件下RNA双螺旋和双螺旋和DNA-RNA杂合双螺合双螺旋中有与旋中有与A型型DNA类似的构造。似的构造。类型类型结晶形状结晶形状ANa盐，相对湿度盐，相对湿度75%时结晶时结晶BNa盐，相对湿度盐，相对湿度92%时结晶时结晶C锂盐，相对湿度锂盐，相对湿度66%时结晶时结晶B-DNA与与A-DNAB-DNA与与A-DNA的区别的区别糖糖
17、环折叠方式不同折叠方式不同呋喃糖喃糖环非平面，非平面，A：C3内；内；B：C2内内碱基碱基对倾角和位移碱基角和位移碱基对至螺旋至螺旋轴的的间隔隔不同不同A：碱基：碱基对倾角大、偏向螺旋角大、偏向螺旋轴边缘、大沟深小沟浅；大沟深小沟浅；B碱基碱基对倾角小、螺旋角小、螺旋轴穿穿过碱基碱基对、大小沟同深、大小沟同深糖环折叠糖环折叠突出原子与突出原子与5-C在一在一侧内内突出原子与突出原子与5-C在异在异侧外外A-DNAB-DNA Z-DNA1979年美国年美国AlexanderRich等人等人atMIT发现了左手了左手DNA双螺旋构造双螺旋构造Z型型DNA易构成易构成Z型构造的碱基序列：型构造的碱基
18、序列：d(CpGpCpGpCpGp)1981Rich：anti-Z-DNA果果蝇唾液腺染色唾液腺染色体体天然天然DNA左旋形状左旋形状某些植物某些植物细胞核、人胞核、人类胎儿球蛋白基因胎儿球蛋白基因Z-DNAZDNA存在的条件存在的条件Pu,Py相相间陈列列Z-DNA比比B-DNA不不稳定，体外高定，体外高盐：NaCl2mol/L,MgCl20.7mol/LZ-DNA结合蛋白，构成部分高合蛋白，构成部分高盐浓度和微度和微环境。境。负超螺旋的存在超螺旋的存在左旋左旋Z-DNA减低减低负超超转绕的的扭力。扭力。5-甲基胞甲基胞嘧啶m5C,甲基周甲基周围部分的疏水区，部分的疏水区，低低盐浓度下可度下
19、可产生生Z-DNA。乙乙酰氨基芴氨基芴AFF，致癌物，致癌物促促进Z-DNA生成。生成。多胺化合物，与磷酸基因多胺化合物，与磷酸基因结合，使合，使B-DNA转变成成Z-DNA。Z-DNAZ-DNA生物学意义生物学意义能能够与与基基因因表表达达调控控相相关关: : 出出现于于基基因因55端端调控控区区人人类肌肌动蛋蛋白白基基因因；促促进染染色色体体重重构构；甲基化区域甲基化区域基因抑制造用基因抑制造用病病毒毒等等微微生生物物侵侵染染宿宿主主识别区区： 痘痘病病毒毒蛋蛋白白E3LE3L结合合Z-DNAZ-DNA干干扰宿主防御系宿主防御系统治治疗靶点靶点在在SV40SV40的加的加强子中有三段子中有
20、三段8bp8bp的的Z-DNAZ-DNA存在。存在。A-DNAZ-DNAB-DNAB-DNA、A-DNA是是DNA的根本构象，的根本构象，Z-DNA为特殊构象为特殊构象DNA构造改动反响构造改动反响了分子中了分子中3个部分的个部分的协调变化协调变化 磷酸磷酸-戊糖主链中单戊糖主链中单键的旋转键的旋转*脱氧核糖脱氧核糖5元元环的折叠：与的折叠：与C-5同同侧内；异内；异侧外外碱基对脱氧核糖的取向碱基对脱氧核糖的取向*A-DNAB-DNAZ-DNAZ-DNA的顺式鸟嘌呤核苷的顺式鸟嘌呤核苷A、B型型DNA糖苷键构象均为糖苷键构象均为反式；反式；Z-DNA中嘧啶反式，中嘧啶反式，而嘌呤为正式而嘌呤为
21、正式B型与型与Z型型DNA中的脱氧鸟苷中的脱氧鸟苷5.特殊的二级构造特殊的二级构造十字型构造十字型构造cruciformstructure三链三链DNA构造构造triplexDNAstructure脱链脱链DNAslipped-strandDNA，S-DNADNA解旋元件解旋元件DNAunwindingelements，DUEs十字型构造十字型构造回文构造回文构造palindromicstructure也称反向反复也称反向反复invertedrepeats：从任何一条：从任何一条链的的53方向方向碱基序列一碱基序列一样的的DNA序列序列链内互内互补落落鹤岛上上岛落落鹤，垂柳岸，垂柳岸边岸柳垂岸
22、柳垂发夹形和十字形构造发夹形和十字形构造液相原子显微镜下的十字型构造液相原子显微镜下的十字型构造十字构造只在低十字构造只在低盐条件下条件下维持持磷酸根磷酸根间斥力斥力生理生理盐溶液溶液X型构造型构造真核真核细胞中，反向反复序列通常接近基因胞中，反向反复序列通常接近基因调控区控区三链三链DNA构造构造镜象反复镜象反复mirrorrepeatH-DNA三螺旋三螺旋DNA液相原子显微镜下的三链构造液相原子显微镜下的三链构造Hoogsteen碱基配对碱基配对三链三链DNA的碱基配对方式的碱基配对方式双链双链DNA的碱基配对方式的碱基配对方式三链三链DNA可在一条双链和第三条寡核苷酸链间可在一条双链和第
23、三条寡核苷酸链间构成构成三链也可在超螺旋三链也可在超螺旋DNA分子内嘌呤分子内嘌呤-嘧啶镜像反嘧啶镜像反复序列之间构成复序列之间构成人类基因组中，大约每人类基因组中，大约每50000bp出现一次可构成出现一次可构成三链的序列；三链的序列；E.coli中很少上述序列中很少上述序列脱链脱链DNAslipped-strandDNA，S-DNADNA区域内几个核苷酸片段多次反复，能区域内几个核苷酸片段多次反复，能够以以“滑脱的方式配滑脱的方式配对DNA解旋元件解旋元件DNAunwindingelements，DUEs30-100bp富含富含AT扭曲力作用下，扭曲力作用下，AT区双螺旋松弛区双螺旋松弛6
24、.DNA可变构象的生物学功能可变构象的生物学功能DNA结合蛋白作用部位合蛋白作用部位超螺旋超螺旋调控：出控：出现于基因于基因调控区，在超螺旋构控区，在超螺旋构造特定部位构成造特定部位构成导致部分超螺旋松弛致部分超螺旋松弛核小体排除：核小体的构成与十字构造、核小体排除：核小体的构成与十字构造、H-DNA、Z-DNA等相斥等相斥DNA序列暴露序列暴露分子开关：超螺旋化分子开关：超螺旋化导致双螺旋上致双螺旋上间隔隔远的部的部位彼此接近位彼此接近同源重同源重组、启、启动子、加子、加强子相子相互作用互作用7.DNA超螺旋超螺旋superhelix/supercoilingDNA双螺旋链再环绕双螺旋链再环
25、绕/螺旋即构成超螺旋构造。螺旋即构成超螺旋构造。DNA的拓扑学的拓扑学(topology)构造构造噬菌体噬菌体T2DNA长约50mE-coliDNA长约1mm人生殖人生殖细胞胞DNA长约1m细胞核最小缺乏胞核最小缺乏1m，植，植物物14m，动物物为10m左左右。右。 拓扑学拓扑学topology: 拓扑学用于拓扑学用于研讨一种物体在不断变形情况下的某些研讨一种物体在不断变形情况下的某些不变的性质。如：一个闭合环形不变的性质。如：一个闭合环形DNA分分子在不切断子在不切断DNA主链的情况下，不论这主链的情况下，不论这个个DNA分子怎样变形或弯曲，它的拓扑分子怎样变形或弯曲，它的拓扑学性质是不变的
26、。学性质是不变的。 细胞内细胞内DNA以超螺旋方式存在以超螺旋方式存在超螺旋构造超螺旋构造环形环形DNA的超螺旋构造的超螺旋构造DNA复制或转录过程中能够涉及超螺旋复制或转录过程中能够涉及超螺旋 真核细胞染色体真核细胞染色体DNA包装好象是一次缠包装好象是一次缠绕再接一次更高级的缠绕绕再接一次更高级的缠绕超螺旋的超螺旋。超螺旋的超螺旋。意义意义 细胞内细胞内DNA都是以超螺旋方式存在都是以超螺旋方式存在的，超螺旋是的，超螺旋是DNA三级构造的重要特征。三级构造的重要特征。 DNA超螺旋构造整体或部分的拓扑超螺旋构造整体或部分的拓扑学变化及其调控对于学变化及其调控对于DNA复制和复制和RNA转转
27、录过程具有关键作用。录过程具有关键作用。关于超螺旋构造的根本概念关于超螺旋构造的根本概念 超螺旋超螺旋DNA DNA是以双螺旋的方是以双螺旋的方式围绕着同一个轴缠绕的。式围绕着同一个轴缠绕的。当双螺旋当双螺旋DNA的这个轴再的这个轴再弯曲缠绕时，弯曲缠绕时，DNA就处于就处于超螺旋形状，超螺旋形状，DNA超螺旋超螺旋形状是构造张力的表现，形状是构造张力的表现，即双螺旋的螺旋。即双螺旋的螺旋。 大多数大多数细细胞内胞内DNA处处于欠旋形状于欠旋形状闭环闭环DNAclosed-circularDNA分子接近分子接近B型构造型构造时时10.5bp/圈圈为为松弛形状。松弛形状。生物学来源的生物学来源的
28、闭环闭环DNA通常通常为为非松弛形状。非松弛形状。细细胞胞调调理的理的张张力力诱导诱导DNA超螺旋超螺旋闭环闭环DNA通常通常处处于欠旋形状于欠旋形状欠旋引起欠旋引起张力力的的缓解方式解方式构构成超螺旋；易于引成超螺旋；易于引起起DNA链间的分的分别构成超螺旋构成超螺旋约约10bp双链分别双链分别84bp欠旋有利于欠旋有利于维维持十字形构造、构成持十字形构造、构成Z-DNA连系数连环数连系数连环数linkingnumberL，Lk 一个闭合环形DNA分子的连系数，严厉地等于没有任何超螺旋情况的DNA两条链以右手方向相互缠绕的次数。连系数具有拓扑学性质，是个整数。不论一闭合环形DNA分子如何缠绕
29、或变形，只需两条DNA链不被切开，它的值不变。右手螺旋，连系数定义为正值+，左手螺旋，连系数定义为负值-。Lk与比与比连连系差系差Lk=LkLk0=(LkLk0)/Lk0=Lk/Lk0Lk0为为DNA分子分子处处于松弛形状于松弛形状时连时连系数，系数，Lk0=碱基碱基对对数数/10(每圈碱基每圈碱基对对数数)，Lk为实为实践践连连系数。系数。值值也称超螺旋密度，用于比也称超螺旋密度，用于比较较不同不同长长度度DNA分子的超螺旋程度分子的超螺旋程度拓扑异构体：同一分子，拓扑异构体：同一分子，L值值不同；欠旋与不同；欠旋与过过渡渡缠绕缠绕互互为镜为镜像像2100bp=-0.1L的含义的含义负超螺旋
30、与正超螺旋负超螺旋与正超螺旋负超螺旋：由螺旋缺乏超螺旋：由螺旋缺乏LkLk0，Lk0，0所所导致的超螺旋称正超螺旋左致的超螺旋称正超螺旋左手螺旋。手螺旋。 螺旋数与超螺旋数螺旋数与超螺旋数 螺旋数螺旋数twist,T:可近似地看成可近似地看成DNA双链的双链的相互缠绕数。螺旋改动数相互缠绕数。螺旋改动数numberofhelicalturn超螺旋数超螺旋数/环绕数环绕数writhe,W：可近似地看成是：可近似地看成是螺旋轴的缠绕数。螺旋轴的缠绕数。连系数、螺旋数、超螺旋数连系数、螺旋数、超螺旋数三者的关系可用下式三者的关系可用下式表示：表示：L=T+W无环绕，大改动无环绕，大改动大环绕，小改动
31、大环绕，小改动T与与W值可以是小数，但值可以是小数，但L值必需是整数。值必需是整数。L值一样的值一样的DNA之间可以不经链的断裂而之间可以不经链的断裂而相互转变。相互转变。T与与W两项值不具有拓扑学性质，由于它两项值不具有拓扑学性质，由于它们在一个闭合环形们在一个闭合环形DNA分子的变形中可以分子的变形中可以改动。改动。 DNA超螺旋构造的构成DNA拓扑异构酶 DNA拓扑异构拓扑异构酶：在每个：在每个细胞内含有一些胞内含有一些专门使使DNA超螺旋或松弛超螺旋或松弛DNA超螺旋的超螺旋的酶类，这些添加些添加或减少或减少DNA超螺旋程度的超螺旋程度的酶，或者，或者说能改能改动DNA分子拓扑分子拓扑
32、连系数的系数的酶叫做叫做DNA拓扑异构拓扑异构酶。DNA拓扑异构拓扑异构酶主要分两大主要分两大类，I 型和型和II 型。型。在在DNA复制、折叠中复制、折叠中发扬重要作用。重要作用。I型酶：暂时性地切开双链型酶：暂时性地切开双链DNA中的一条链，中的一条链，使切口的一端围绕未切割链旋转一圈，并重新使切口的一端围绕未切割链旋转一圈，并重新衔接切口。这类衔接切口。这类DNA拓扑酶每次作用改动拓扑酶每次作用改动DNA分子的拓扑连系数为分子的拓扑连系数为1。II型酶：二型型酶：二型DNA拓扑异构酶同时切开拓扑异构酶同时切开DNA的的两条链，一次作用改动两条链，一次作用改动DNA分子的拓扑连系数分子的拓
33、扑连系数为为2。I类类和和II类类酶酶的的综综合活性决合活性决议细议细菌菌DNA超螺旋程度超螺旋程度大大肠杆菌中至少存在杆菌中至少存在4种种IIV拓扑异构拓扑异构酶：I类拓扑异构拓扑异构酶I、III去除去除负超螺旋松弛超螺旋松弛DNA拓扑异构拓扑异构酶IIDNA促旋促旋酶为II类拓扑拓扑酶，利，利用用ATP提供的能量引入提供的能量引入负超螺旋超螺旋真核真核细胞亦含胞亦含I类和和II类拓扑异构拓扑异构酶：I类：酶I、酶IIIII类：II、II松弛正、松弛正、负超螺旋；不引入超螺旋；不引入负超螺旋超螺旋拓扑异构酶拓扑异构酶I的作用的作用大肠杆菌拓扑异构酶大肠杆菌拓扑异构酶IIDNA促旋酶的作用促旋
34、酶的作用酶结合于合于DNADNA分子中分子中2区域在区域在结合复合体中以特定构合复合体中以特定构象重叠象重叠正正结节、负结节一片段双一片段双链断裂，断裂，另一片段另一片段穿穿过断口断口2负结节拓扑异构酶催化的连系数变化拓扑异构酶催化的连系数变化图图中一切中一切DNA具有一具有一样样碱基数，碱基数，但超螺旋程度不但超螺旋程度不同。同。-+8.DNA在真核生物细胞核内的组装在真核生物细胞核内的组装核小体是染色质的根本构造核小体是染色质的根本构造真真核核生生物物染染色色体体由由DNA和和蛋蛋白白质质构构成成，其根本单位是其根本单位是核小体核小体(nucleosome)。核小体的组成核小体的组成:DN
35、A：约：约200bp组组蛋蛋白白：H1，H2A，H2B，H3，H4组组蛋白是和染色体相蛋白是和染色体相联联的最主要的蛋白的最主要的蛋白质质组蛋白是比蛋白是比较小的碱性蛋白，富含小的碱性蛋白，富含Lys和和Arg；在在细胞正常胞正常pH值时，组蛋白蛋白带有正有正电荷，可以和荷，可以和DNA结合，在合，在DNA组装中起重要作用，保守；装中起重要作用，保守；组蛋白的蛋白的总分量和分量和DNA的的总分量大致相等；分量大致相等；组蛋白的修蛋白的修饰作用有磷酸化、甲基化、乙作用有磷酸化、甲基化、乙酰化、化、泛素化、泛素化、ADP-核糖基化等。核糖基化等。表表观遗传学学组蛋白的甲基化修饰组蛋白的甲基化修饰组
36、蛋白甲基化修饰参与异染组蛋白甲基化修饰参与异染色质构成、基因印记、色质构成、基因印记、X染染色体失活和转录调控等多种色体失活和转录调控等多种主要生理功能，主要生理功能，组蛋白甲基化的异常与肿瘤组蛋白甲基化的异常与肿瘤发生等多种人类疾病相关，发生等多种人类疾病相关，可以特异性地激活或者抑制可以特异性地激活或者抑制基因的转录活性。基因的转录活性。甲基化位点：赖氨酸和精氨甲基化位点：赖氨酸和精氨酸酸核小体组蛋白的乙酰化和脱乙酰化核小体组蛋白的乙酰化和脱乙酰化 组蛋白乙酰基转移酶组蛋白乙酰基转移酶(HAT)： 胞质胞质B型，核型，核A型型乙酰化部位：乙酰化部位：Lys作用：降低核小体对作用：降低核小体
37、对DNA的亲和力；阻止或促进的亲和力；阻止或促进核小体与其他转录或调理蛋白的相互作用核小体与其他转录或调理蛋白的相互作用脱乙酰化：染色质恢复无转录活性形状，基因沉脱乙酰化：染色质恢复无转录活性形状，基因沉默默组蛋白八聚体的组装组蛋白八聚体的组装H1中心颗粒：中心颗粒：DNA:146bp组蛋白：组蛋白：2x(H2A,H2B,H3,H4)衔接部：衔接部：DNA54bp,组蛋白组蛋白H1串珠状核小体电子显微镜图串珠状核小体电子显微镜图 核小体在核小体在DNA上的定位是动态的上的定位是动态的DNA双螺旋环绕组蛋白八聚体时紧缩双螺旋中小双螺旋环绕组蛋白八聚体时紧缩双螺旋中小沟，富含沟，富含AT小沟较富含
38、小沟较富含GC小沟易于紧缩小沟易于紧缩一些与一些与DNA严密结合的蛋白能够影响核小体在严密结合的蛋白能够影响核小体在DNA上的定位上的定位细胞需求时，核小体的定位可迅速发生变化细胞需求时，核小体的定位可迅速发生变化核小体包装的高级方式核小体包装的高级方式30nm核小体纤维是核小体纤维是核小体的高级组装核小体的高级组装双螺旋双螺旋DNA染色质方式：核小体链染色质方式：核小体链螺线管：螺线管：(每圈每圈6个核小个核小体体)，30nm核小体纤维核小体纤维突环：与核骨架相连。突环：与核骨架相连。玫瑰花结：玫瑰花结：18环环，30梅花结为一个螺旋圈梅花结为一个螺旋圈染色体：染色体：每个染色单体每个染色单
39、体含含10个螺旋圈个螺旋圈三、三、RNA的高的高级构造构造1.RNA分子构象的多样性分子构象的多样性2.tRNA的高级构造的高级构造tRNA普通含有普通含有73-94核苷酸，核苷酸，单链20左右位置上左右位置上为保守核苷酸保守核苷酸含含1020%稀有碱基稀有碱基/修修饰碱基碱基3末端末端为CCA-OH；5末端大多数末端大多数为G，少数，少数为CtRNA二二级构造构造为典型的典型的发卡构造，互卡构造，互补链相接近构成双螺旋区，在相接近构成双螺旋区，在氢键的作的作用下，分子呈三叶草形。用下，分子呈三叶草形。链内碱基配内碱基配对：A-U、G-C、G-UtRNA的二的二级构造构造三叶草形三叶草形tRN
40、A的三的三级构造构造倒倒L形形3.rRNA的高级构造的高级构造 原核生物原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNA真核生物真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNArRNA均有其根本的特点均有其根本的特点G-C碱基碱基对与与A-U碱基碱基对的的总量不等量不等;单股股rRNA链可自行折叠，构成螺旋区和可自行折叠，构成螺旋区和环区，一区，一切螺旋区的碱基都是保守的切螺旋区的碱基都是保守的;一切来源一切来源rRNA均能构成均能构成4个构造域个构造域、和和，构造域均含，构造域均含许多茎、多茎、环，它，它们经过无无间隔隔碱基碱基对的相互反响彼此接近的相互反响彼此接近;绝大多数
41、的大多数的rRNA碱基的特异功能尚不清楚。不配碱基的特异功能尚不清楚。不配对碱基碱基环区或区或单股区能股区能够涉及涉及rRNA与其它与其它RNA的的结合合16S的的3端与端与mRNASD顺序构成碱序构成碱基配基配对。E.Coli 16S rRNA古细菌古细菌4.mRNA的二的二级级构造构造2006年耶年耶鲁鲁大学研大学研讨组发现讨组发现一个大的、高度保守一个大的、高度保守的的RNAmotif，这这种种RNAmotif通常存在于极端革通常存在于极端革兰兰氏阳性氏阳性细细菌的一种多基因菌的一种多基因mRNA的一个非的一个非编码编码部分。部分。重重组组基因基因mRNA翻翻译译起始区二起始区二级级构造
42、构造四、四、 DNA的变性的变性1.变性的根本概念变性的根本概念DNA分子量不变、氢键破坏、双螺旋部分解体；双螺分子量不变、氢键破坏、双螺旋部分解体；双螺旋分别成两条旋分别成两条DNA单链，分子量单链，分子量2分化。分化。温度、温度、pH、离子强度、有机试剂等均能导致、离子强度、有机试剂等均能导致DNA变变性。性。变性变性DNA粘度降低、沉降系数添加、浮力密度添加、粘度降低、沉降系数添加、浮力密度添加、增色效应、旋光度降低、细菌转化活性下降。增色效应、旋光度降低、细菌转化活性下降。沉降系数：沉降系数：sedimentationcoefficient用离心用离心法法时，大分子沉降速度的量度，等于
43、每，大分子沉降速度的量度，等于每单位离心位离心场的速度。或的速度。或s=v/2r。s是沉降系数，是沉降系数，是离心是离心转子的角速度弧度子的角速度弧度/秒，秒，r是到旋是到旋转中心的中心的间隔，隔，v是沉降速度。沉降系数以每是沉降速度。沉降系数以每单位重力的沉降位重力的沉降时间表示，并且通常表示，并且通常为120010-13秒范秒范围，10-13这个因子叫做沉降个因子叫做沉降单位位S，即，即1S=10-13秒，如血秒，如血红蛋蛋白的沉降系数白的沉降系数约为410-13秒或秒或4S。大多数蛋白。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在和核酸的沉降系数在4S和和40S之之间，核糖体及其，核糖体及其亚基在基在
44、30S和和80S之之间。DNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱变性引起紫外吸收值的改动变性引起紫外吸收值的改动增色效应：增色效应：DNA变性时其溶液变性时其溶液A260增高的景象。增高的景象。核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收 由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外光有剧烈吸收，最大吸收峰在光有剧烈吸收，最大吸收峰在260nm附近，利附近，利用这一特性可进展核酸的定量测定及纯度分析。用这一特性可进展核酸的定量测定及纯度分析。紫外吸收法中紫外吸收法中DNA或或RNA的定量的定量A260=1.0相当于相当于:50g/ml双双链DNA40g/ml单链DNA或或RNA20g/m
45、l寡核苷酸寡核苷酸A260/A280DNA纯品品: A260/A280 = 1.8RNA纯品品: A260/A280 = 2.0DNA变变性的本性的本质质是双是双链间氢键链间氢键的断裂及碱的断裂及碱基堆基堆积积力的破坏力的破坏DNA的降解的降解在温度、在温度、pH急急剧变剧变化，或化，或在在酶酶、超声波、高速、超声波、高速搅搅拌、拌、电电离离辐辐射的作用下，射的作用下，DNA二二级级构造遭到破坏，同构造遭到破坏，同时维时维系系DNA一一级级构造的共价构造的共价键键也被切断，也被切断，DNA分子量分子量发发生生变变化的化的过过程。程。理化性理化性质: 紫外吸收紫外吸收 粘度粘度高于高于Tm值5
46、退火退火 annealing生物活性得到部分恢复生物活性得到部分恢复 2.变变性性DNA在一定条件下可以复性在一定条件下可以复性淬火淬火DNA复性复性动动力学力学 DNA 复性过程根本上符合二级反响动力复性过程根本上符合二级反响动力学，其中第一步为慢反响，由于两条链必需依学，其中第一步为慢反响，由于两条链必需依托随机碰撞找到一段碱基配对的部分，首先构托随机碰撞找到一段碱基配对的部分，首先构成双螺旋。第二步为快反响，尚未配对的其他成双螺旋。第二步为快反响，尚未配对的其他部分碱基配对相结合，象拉锁链一样迅速构成部分碱基配对相结合，象拉锁链一样迅速构成双螺旋。双螺旋。复性反响：复性反响：S：sing
47、lestrandDNAD：doublestrandDNA完全变性完全变性DNA的复性反响可表示为：的复性反响可表示为：经重排，积分得：经重排，积分得： cc0 1+kc0t=1c0：t=0时，起始，起始DNA的的浓度度mol/Lc：t时间时，单链DNA的的浓度度mol/Lk：复性反响常数：复性反响常数L/molsect：复性：复性时间secDNA复性反响的初始复性反响的初始浓浓度度co与反响完成一半所需与反响完成一半所需时时间间的乘的乘积为积为常数。在一定条件下，复性反响的速度常数。在一定条件下，复性反响的速度可以用可以用cot1/2来衡量。来衡量。实验证实验证明明K值值与复性与复性DNA分子
48、量成正比。分子量成正比。cot1/2或或K称称DNA分子复分子复杂杂度度(complexity)，DNA片段越大复性片段越大复性越慢。越慢。DNA的的浓浓度越大复性越快。度越大复性越快。k3.温度温度对对DNA变变性的影响性的影响任何有机固体物任何有机固体物质都有一个特定的熔点都有一个特定的熔点DNA分子内部也是一个非常分子内部也是一个非常规那么有序的构造那么有序的构造有特定熔点有特定熔点Tm。与有机固体熔解与有机固体熔解过程程类似，在似，在缓慢将慢将DNA溶液加溶液加热过程中，开程中，开场并不出并不出现二二级构造构造变化，直到某化，直到某一狭窄温度范一狭窄温度范围，发生螺旋到生螺旋到线团转变
49、。DNA熔解。熔解。DNA的熔解温度的熔解温度meltingtempratureTm DNA在加在加热变性性时，紫外吸收添加，紫外吸收添加值达达总添加添加值一半一半时双螺旋构造失去一半双螺旋构造失去一半时？的温度称？的温度称为该DNA的的变性温度，也性温度，也称熔点或熔解温度，用称熔点或熔解温度，用Tm 表示。表示。DNA的的Tm值普通在普通在 8295 度之度之间，每种，每种DNA都都有一个特征性的有一个特征性的Tm值。 解链曲线解链曲线 假假设设在在延延续续加加热热DNADNA的的过过程程中中以以温温度度对对A260A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。值作图，所得的曲线称为解链曲线。
50、影响影响Tm值值的要素的要素DNA的均一性：均的均一性：均质DNATm值范范围较窄，窄，异异质DNATm值的范的范围较宽DNA中中G-C对的含量的含量阅历式式:(G+C)%=(Tm-69.3)2.44盐离子离子强度：离子度：离子强度低的介度低的介质中，中，Tm值较低范低范围较宽；离子；离子强度度较高的介高的介质中，中，Tm值较高，范高，范围较窄。窄。DNA在含在含盐缓冲液中保管冲液中保管G-C含量含量对对Tm值值的影响的影响肺炎球菌肺炎球菌粘质沙雷菌粘质沙雷菌 盐浓盐浓度度对对Tm值值的影响的影响4.pH对对DNA变变性的影响性的影响介介质中中pH的改的改动可可导致致DNA变性性25，0.05
51、mol/LNaCl溶液中，从中性到溶液中，从中性到pH4.5左左右，右，约发生生10%的的DNA可逆可逆变性。性。pH3以下、以下、pH12以上以上为不可逆不可逆变性。性。通常介通常介质中中pH在在5.5-8.5范范围内，内，DNATm值变化化不大。不大。pH12酮基基烯醇基醇基pH2-3NH2NH2+(质子化子化)改改动氢键的构成与的构成与结合力合力极端极端pH条件的影响条件的影响一切减弱一切减弱氢键、碱基堆、碱基堆积力的要素力的要素 均将使均将使Tm 值降低降低碱基因碱基因pH不同采取同分异构方式不同采取同分异构方式酮式酮式烯醇式烯醇式鸟嘌呤鸟嘌呤内酰胺内酰胺双内酰亚胺双内酰亚胺尿嘧啶尿嘧
52、啶DNA双双链链中碱基中碱基间间在氨基在氨基氢氢和和羰羰基氧之基氧之间间构成构成氢键氢键5.碱基碱基组组成成对对DNA变变性的影响性的影响中性中性pH条件下，条件下，GC对添加，添加，DNA热稳定性添加。定性添加。0.15mol/LNaCl和和0.015mol/L柠檬酸檬酸钠溶液中，溶液中，G+C含量每添加含量每添加0.01mol/L，DNATm值添加添加0.41。DNA热稳定性定性还与碱基的排布有关，多个与碱基的排布有关，多个G或或C延延续陈列列抗抗热中心。中心。 增色效应的腾跃景象 ( Jump of Hyperchromicity )高分子量的高分子量的DNA分子在分子在热变性性过程中程
53、中,富含富含AT区域首先区域首先发生生变性性,然后逐然后逐渐扩展展,表表现增色效增色效应的的腾跃景象。景象。变性加快。性加快。richATrichAT6.离子离子强度度对DNA变性的影响性的影响单链DNA主主链的磷酸基的磷酸基团负电荷的静荷的静电斥力斥力两条两条单链DNA的分的分别Na+在磷酸基在磷酸基团周周围构成的构成的电子云子云对静静电斥力斥力产生屏蔽作用生屏蔽作用减弱静减弱静电斥力斥力7.有机溶有机溶剂对剂对DNA变变性的影响性的影响许许多有机溶多有机溶剂剂可可导导致致DNA变变性性酰酰胺、胺、脲脲、氨基甲酸、氨基甲酸酯酯、醇、醇类类等促使等促使DNA变变性，性，与与DNA中中GC含量、
54、介含量、介质质离子离子强强度、度、变变性性剂浓剂浓度、度、DNA浓浓度有关。度有关。有机溶有机溶剂变剂变性机制性机制有机溶有机溶剂存在，离子溶存在，离子溶剂化才干低，化才干低，难于中和于中和DNA分子分子负电荷；荷；有机溶有机溶剂具疏水性，具疏水性，稳定因定因变性暴露的疏水基性暴露的疏水基团；尿素，尿素，酰胺与碱基胺与碱基间构成构成氢键改改动碱基碱基对间的的氢键，Tm值可降至可降至40左右左右8.其他理化要素其他理化要素对对DNA变变性的影响性的影响紫外紫外线、X射射线、荧光染料光染料DNA分子化学分子化学损伤部分部分变性性Tm值降低。降低。羟基胺破坏基胺破坏DNA分子中胞分子中胞嘧啶残基，降低残基，降低Tm。二胺、多胺、精胺与二胺、多胺、精胺与DNA磷酸基磷酸基团相互作用，中相互作用，中和和负电荷荷DNA稳定。定。紫外线和一些化学因子、烷化剂对紫外线和一些化学因子、烷化剂对DNA的损伤的损伤亚硝酸亚硝酸烷化剂：乙基甲烷磺酸烷化剂：乙基甲烷磺酸EMS紫外线诱导胸腺嘧啶二聚体紫外线诱导胸腺嘧啶二聚体与嵌合剂的反响与嵌合剂的反响溴乙啶溴乙啶丫啶橙丫啶橙 放线菌素放线菌素D
