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1、第第7 7章章 细菌与病毒的微生物学检查法细菌与病毒的微生物学检查法细菌与病毒的微生物学检查法细菌与病毒的微生物学检查法Laboratory Diagnosis of Bacterial and Viral InfectionsLaboratory Diagnosis of Bacterial and Viral Infections商庆龙商庆龙商庆龙商庆龙Instructor in Microbiology Dept. of HMUInstructor in Microbiology Dept. of HMUNov. 6, 2009 Nov. 6, 2009 病原学检查程序病原学检查程序标标
2、本本分离培分离培养养鉴定鉴定怎么办怎么办培养基制备培养基制备细菌培养法细菌培养法三段划线、纯培养三段划线、纯培养无菌技术无菌技术油镜使用、细菌形态学观察油镜使用、细菌形态学观察革兰染色法革兰染色法生化反应观察生化反应观察药敏试验药敏试验血清学诊断血清学诊断核酸检测核酸检测标本染色镜检血平板 观察可疑菌落染色镜检纯培养甘露醇发酵试验血浆凝固酶试验耐热核酸酶试验动物试验药敏试验化脓性球菌的分离鉴定程序Microbiology Lab标本的采集与送检原则n无菌操作n感染部位、病变部位采集标本n不同时间采集不同标本n尽量在使用抗生素前采集n检查特异性抗体，采急性期和恢复期双份血清双份血清n及时送检第一
3、节第一节 细菌感染的微生物细菌感染的微生物血检查法血检查法一、细菌学诊断示踪性检测n形态学检查 n分离培养n生化试验 n血清学鉴定 致病力和药敏测定n动物实验n毒力检测n药物敏感试验 形态学检查n细菌染色检查法n暗视野检查 形态和染色性有明显特征的病原菌革兰染色结果比较 抗酸染色革兰染色阳性菌 革兰染色阴性菌（葡萄球菌） （大肠埃希菌）结核分枝杆菌结核分枝杆菌 MTuberculosis n确定细菌性感染最可靠的方法uu培养特征培养特征uu形态特征形态特征 病原菌的分离和鉴定： 菌落n大小n形态n颜色n表面性状n透明度n溶血性 金黄色葡萄球菌光滑型菌落结核分枝杆菌粗糙型菌落Flame ster
4、ilize wire loop, metal forceps, etc before and after use in a hooded Bunsen burner 糖发酵试验糖发酵试验 H2S试验试验枸橼盐利用试验枸橼盐利用试验细菌代谢产物的检测 得到细菌纯培养物后，用糖发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验等对细菌的酶系统和得到细菌纯培养物后，用糖发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验等对细菌的酶系统和其代谢产物的检查，是鉴别细菌的重要方法之一。特别是有些细菌特征基本相同，因此有其代谢产物的检查，是鉴别细菌的重要方法之一。特别是有些细菌特征基本相同，因此有必要经分离培养后用生化试验进行鉴定。但步骤
5、繁杂耗时。随着现代化技术的发展，细菌必要经分离培养后用生化试验进行鉴定。但步骤繁杂耗时。随着现代化技术的发展，细菌检测的技术水平也不断地提高，正在逐步实现快速化、微量化、自动化和标准化。检测的技术水平也不断地提高，正在逐步实现快速化、微量化、自动化和标准化。生化反应血清学鉴定n利用含已知的特异性抗体的免疫血清，对细菌（志贺菌属、沙门菌属）进行群和型的鉴别n常用方法是玻片凝集试验 动物试验毒力检测n n 半数致死量半数致死量 LD50LD50n n 半数感染量半数感染量 ID50ID50n n Elek Elek平板平板纸碟法试管法小杯法凹孔法 最低抑菌浓度（MIC）是能够抑制细菌生长的最低药物
6、浓度；最低杀菌浓度（MBC）是指能够杀灭细菌最低药物浓度； MIC和MBC的值越低，表示细菌对该药越敏感 药物敏感试验二、病原菌成分检测n抗原的检测uu用已知的特异性抗体检测未知的细菌抗原成分用已知的特异性抗体检测未知的细菌抗原成分n核酸的检测 uu核酸杂交核酸杂交uuPCRPCRToxins from E. coli 0157:H7 bacteria and others can cause fatal disease in humans, and they can be food borne 细菌核酸的检测 n基因探针uDNA印迹杂交 (southern blot) n质粒指纹图谱分析nP
7、CRPCR Machine聚合酶链反应聚合酶链反应（PCR）PCR产物的检测产物的检测 三、抗体的检测三、抗体的检测n辅助诊断n抗体存在于血清或其他体液中 由中国科学院研制的IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)，被国家食品药品监督管理局批准进行试生产Immunology evaluates a patient immune system by detecting the bodies response (an antibody) to a foreign agent (or antigen). The presence of antigens can be detected too细菌感染的血清
8、学诊断细菌感染的血清学诊断 血清学试验举 例 凝集试验 肥达反应 补体结合试验钩体病 中和试验 抗O试验BioThreat Alert Test StripsBioThreat Alert Test StripsBioThreat Alert Test StripsBTA Assay and Reader.Tracking Chain of Custody Autonomous Pathogen Detection System (APDS)The Autonomous Pathogen Detection System is capable of continuous, automated,
9、 24-hour monitoring for pathogens, with results reported every 30 minutes HANAA in Hand About the size of a brick, the HANAA biodetection system can be held in one hand and weighs less than a kilogram. The system was designed for emergency response groups, such as firefighters and police, who are of
10、ten first on the scene at sites where bioterrorism may have occurred. Each handheld system can test four samples at onceeither the same test on four different samples or four different tests on the same sample. HANAA can provide results in less than 30 minutes, compared with the hours to days that r
11、egular laboratory tests typically take.Bio Sensors Bio Sensors This technique is essentially an ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method, however with an extremely sensitive all-electronic detection system. Tiny computer chip can detect toxinsThe lab on a chip, its developers say, could have
12、 potential applications in law enforcement, environmental pollution detection, military medical care, or for anyone who needs a cheap and portable method of identifying the presence of specific toxins or DNA without the benefit of a laboratory.This device could be developed into something medics use
13、 in the field to get answers in a matter of minutes rather than hours.Research on the fluorescence microscopy detection system, which provides a cheap and portable method for identifying specific toxins or DNA, was funded by the National Science Foundation.UC BERKELEY PHOTO 第二节第二节 病毒感染的微生物学检测法病毒感染的微
14、生物学检测法 一、形态学检查 u 电子显微镜电子显微镜 u 光学显微镜光学显微镜 内基小体（Negri body），可辅助诊断狂犬病 扫描电镜 透射电镜 狂犬病病毒 天花病毒 冠状病毒 SARS冠状病毒冠状病毒二、病毒分离培养的方法二、病毒分离培养的方法采集标本抑制杂菌（青、链霉素）（青、链霉素）n病毒分离u易感动物-出现病状u鸡胚 -病变或死亡u细胞培养 -细胞病变病毒鉴定（血清学方法）（血清学方法）uu动物接种 uu鸡胚培养鸡胚培养uu组织培养 细胞培养n原代细胞n二倍体细胞n传代细胞细胞培养技术细胞培养技术三、病毒在细胞内增殖的鉴定指标三、病毒在细胞内增殖的鉴定指标n细胞病变效应（cyt
15、opathic effect，CPE） u红细胞吸附（hemadsorption）u红细胞凝集（hemagglutination）u病毒干扰作用（viral interference）u中和试验（neutralization test，NT）正常细胞病变细胞病毒的定量nTCID50u病毒感染性和毒力的指标是50%组织细胞感染量（50% tissue culture infectious dose）nPFUu空斑形成试验（plaque formation）u用于病毒浓度的精确定量 空斑形成试验空斑形成试验uu 红细胞吸附红细胞吸附红细胞吸附红细胞吸附 hemadsorptionhemadsorp
16、tion 病病毒毒在在细细胞胞内内增增殖殖，病病毒毒或或其其血血凝凝素素会会出出现现于于感感染染细细胞胞膜膜上上，使使感感染染细细胞胞能能与与红红细细胞胞结结合合。检检测测正正粘粘病病毒毒和和副粘病毒的间接指标副粘病毒的间接指标 Hemadsorption of monkey red blood cellsu 红细胞凝集红细胞凝集 hemagglutination 一种检测含血凝素病毒的方法四、病毒成分的检测n病毒核酸的检测 uu核酸杂交技术核酸杂交技术uu核酸扩增技术核酸扩增技术uu基因芯片（基因芯片（gene chipgene chip）n病毒抗原的检测uu荧光标记技术、荧光标记技术、EL
17、ISAELISA或放射免疫标记技术或放射免疫标记技术 将已知的抗病毒血清先与病毒悬液混合在一起，在一定温度条件下作用一定时间后，接种于敏感细胞进行培养，观察病毒致细胞病变作用或红细胞吸附现象是否消失。 这是比较可靠的病毒诊断方法 中和试验中和试验 neutralization test，NT五、病毒抗体的检测中和作用血凝血凝抑制ELISA法法 n 特异性高、敏感性强、操作方便，广泛用于细菌、病毒和其他病原体的临床化验室检测，特别在病毒感染性疾病的诊断中 n蛋白印迹技术蛋白印迹技术 Western blot uu目前目前WHOWHO规定该试验作为规定该试验作为HIVHIV感染的确认试验感染的确认试验
