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1、LOGO酶的固定化万丽花万丽花 2011.11.42011.11.4木瓜木瓜(m u)(m u)蛋白酶的固定蛋白酶的固定第一页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化固定化酶的介绍固定化酶的介绍1固定化酶的特点固定化酶的特点2酶固定化的方法酶固定化的方法3举例：木瓜蛋白酶的固定及性质研究举例：木瓜蛋白酶的固定及性质研究4主要主要(zhyo)(zhyo)内容内容第二页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化食品(shpn)酶学 研究生课件原因原因(yuny(yunyn)n)2 2固定化酶固定化酶原因原因1 1酶一般以溶于水的状酶一般以溶于水的状态作用于底物，因此，态作用于底物，因此，当反应结束时，一般当反应结束
2、时，一般难以回收，也难以从难以回收，也难以从产物中除尽，又由于产物中除尽，又由于酶仅能使用一次，因酶仅能使用一次，因此，使得此，使得(sh de)产物产物纯度不够，且造成很纯度不够，且造成很大的浪费。大的浪费。固定化酶的介绍固定化酶的介绍酶对热、酸、碱等有机酶对热、酸、碱等有机溶剂均不稳定，即使在溶剂均不稳定，即使在酶反应的最适环境中，酶反应的最适环境中，也易失活。也易失活。通过物理或化学通过物理或化学法将酶束缚在一法将酶束缚在一定的空间，使酶定的空间，使酶只能在此区间进只能在此区间进行催化反应，反行催化反应，反应结束后，能迅应结束后，能迅速与底物和产物速与底物和产物分开，实现重复分开，实现重
3、复使用。使用。第三页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化食品(shpn)酶学 研究生课件优点优点(yudin)固定化酶的特点固定化酶的特点(tdin)易与反应液分开易与反应液分开可反复使用，降低成本可反复使用，降低成本酶的稳定性提高酶的稳定性提高较易控制终止酶反应的进程较易控制终止酶反应的进程产物纯化简便产物纯化简便第四页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化食品(shpn)酶学 研究生课件缺点缺点(qudin)固定化酶的特点固定化酶的特点(tdin)酶活力有损失酶活力有损失胞内酶必须经过酶的分离手续胞内酶必须经过酶的分离手续增加了生产的成本，工厂初增加了生产的成本，工厂初始投资大始投资大与完整菌体相比
4、不适于多酶反应与完整菌体相比不适于多酶反应只能用于可溶性底物只能用于可溶性底物第五页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化食品(shpn)酶学 研究生课件酶固定化的方法酶固定化的方法(fngf) 格子型格子型包埋法包埋法 微胶囊型微胶囊型交联法交联法 共价结合法共价结合法载体载体(zit)结合法结合法 离子结合法离子结合法 物理吸附法物理吸附法分离的酶分离的酶 载体载体一定方式一定方式固定固定第六页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化包埋法包埋法-格子格子(g zi)(g zi)型型原理原理(yunl)(yunl)：将酶包埋在聚合物的凝胶格子中：将酶包埋在聚合物的凝胶格子中常用凝胶为：聚丙烯酰胺凝胶、明
5、胶、常用凝胶为：聚丙烯酰胺凝胶、明胶、 角叉菜胶角叉菜胶EEEE第七页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化包埋法包埋法-微胶囊型微胶囊型原理原理(yunl)(yunl)：以半透性的有机高聚物薄膜包围含有酶分子的液滴，在有机溶：以半透性的有机高聚物薄膜包围含有酶分子的液滴，在有机溶剂中，含酶水溶液的液滴界面处，发生界面凝集作用，形成半透性膜，使酶被剂中，含酶水溶液的液滴界面处，发生界面凝集作用，形成半透性膜，使酶被包裹于其中，阻止了酶的漏失。包裹于其中，阻止了酶的漏失。微囊直径一般为微囊直径一般为 m-m-几百几百 m m的小珠的小珠特点：小分子底物能通过膜与酶接触，产物也可释放出来。特点：小分子底
6、物能通过膜与酶接触，产物也可释放出来。第八页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化载体载体(zit)(zit)吸附吸附-共价结合法共价结合法原理：酶蛋白原理：酶蛋白(dnbi)上上非活性必需基团非活性必需基团（氨基酸残基）与载体通过（氨基酸残基）与载体通过共价键共价键形成不形成不可逆的联结。可逆的联结。载体：纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺衍生物载体：纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺衍生物优点：优点：结合牢固，酶不易脱落，稳定性好。结合牢固，酶不易脱落，稳定性好。缺点：缺点：载体需活化，操作复杂，反应条件剧烈载体需活化，操作复杂，反应条件剧烈载体载体EEEEEE第九页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化载体
7、吸附载体吸附(xf)(xf)-离子结合法离子结合法原理：酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固体载体由于离子效应，将酶固定在原理：酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固体载体由于离子效应，将酶固定在离子交换基团的非水溶性载体上。离子交换基团的非水溶性载体上。常见载体为：常见载体为： DEAEDEAE纤维素（二乙氨基已基纤维素）、纤维素（二乙氨基已基纤维素）、 TEAETEAE纤维素（三乙基氨基乙基纤纤维素（三乙基氨基乙基纤维素）、维素）、DEAEDEAE葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶特点特点(tdin)(tdin)：操作简便，酶分子结构及活性中心不变：操作简便，酶分子结构及活性中心不变 第十页，共二十四
8、页。木瓜蛋白酶的固定化 E E 惰性载体惰性载体 （不溶于水）（不溶于水） 特点：操作简单，吸附力弱；特点：操作简单，吸附力弱；pH pH 、T T、 底物浓度变化底物浓度变化(binhu)(binhu)时，会导致酶从载体上部分或全部脱落。时，会导致酶从载体上部分或全部脱落。 吸附吸附(xf)活性碳活性碳硅胶硅胶(u jio)石英石英硅藻土硅藻土EEE载体吸附载体吸附-物理吸附法物理吸附法第十一页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化交联法交联法原理：依靠双功能基团试剂，使酶蛋白原理：依靠双功能基团试剂，使酶蛋白(dnbi)分子间发生交联，凝集成网分子间发生交联，凝集成网状结构，从而成为不溶性酶。状
9、结构，从而成为不溶性酶。特点：反应条件剧烈、酶活力低、颗粒较细，一般不能单独特点：反应条件剧烈、酶活力低、颗粒较细，一般不能单独(dnd)(dnd)使用，使用，常常和包埋法、吸附法等联合使用常常和包埋法、吸附法等联合使用。常用双功能基团为：戊二醛常用双功能基团为：戊二醛 -CHO-(CH2)3-CHO-CHO-(CH2)3-CHO第十二页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化一、微孔淀粉一、微孔淀粉(dinfn)海海藻酸钠固定化藻酸钠固定化木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶（包埋法固定）（包埋法固定）固定固定(gdng)方法方法二、金属螯合二、金属螯合载体定向固定载体定向固定化木瓜蛋白酶化木瓜蛋白酶（载体吸附（载
10、体吸附共共价结合）价结合）举例：木瓜蛋白酶的固定举例：木瓜蛋白酶的固定第十三页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化实验设计实验设计实验实验(shyn)步骤步骤实验实验(shyn)结果结果条件优化：条件优化：不同浓度的微孔淀粉不同浓度的微孔淀粉对酶活力的影响对酶活力的影响不同浓度的海藻酸钠不同浓度的海藻酸钠对酶活力的影响对酶活力的影响不同浓度的不同浓度的GaG1GaG1溶液对溶液对固定化木瓜蛋白酶活力固定化木瓜蛋白酶活力的影响的影响固定化木瓜蛋白酶制备条固定化木瓜蛋白酶制备条件的正交试验件的正交试验包埋法固定木瓜蛋白酶包埋法固定木瓜蛋白酶采用采用微孔淀粉微孔淀粉海藻酸钠包埋法固定木瓜蛋海藻酸钠包埋法
11、固定木瓜蛋白酶，探讨固定化条件、固定化木瓜蛋白酶及白酶，探讨固定化条件、固定化木瓜蛋白酶及游离酶的酶学性质。游离酶的酶学性质。一种新型的变性淀粉，具有较大的比孔容和比表一种新型的变性淀粉，具有较大的比孔容和比表面积，可以吸附很多种功能性物质面积，可以吸附很多种功能性物质凝胶剂凝胶剂游离木瓜蛋白酶活力的游离木瓜蛋白酶活力的测定测定固定化木瓜蛋白酶固定化木瓜蛋白酶的制备的制备固定化酶活力测定固定化酶活力测定固定化酶制备条件的优固定化酶制备条件的优化化固定化酶性质研究固定化酶性质研究最佳制备条件为微孔淀粉浓度最佳制备条件为微孔淀粉浓度4 4，海藻酸钠浓度，海藻酸钠浓度3 3，CaC12CaC12浓浓
12、度度5.55.5。固定化木瓜蛋白酶的最适。固定化木瓜蛋白酶的最适pHpH值为值为5.75.7，最适温度，最适温度7272。第十四页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化实验实验(shyn)(shyn)结果：结果：1 1、不同浓度的微孔淀粉、不同浓度的微孔淀粉(dinfn)(dinfn)对酶活力的影响：对酶活力的影响：木瓜蛋白酶固定化的最适微孔淀粉浓度为木瓜蛋白酶固定化的最适微孔淀粉浓度为4 4。随着微孔淀粉浓度的增加，吸附。随着微孔淀粉浓度的增加，吸附(xf)(xf)木瓜蛋白酶的量会逐渐增加，但继续加大微孔淀粉浓度就会使底物运动扩散更加木瓜蛋白酶的量会逐渐增加，但继续加大微孔淀粉浓度就会使底物运动扩
13、散更加困难，降低酶活。困难，降低酶活。第十五页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化实验实验(shyn)(shyn)结果：结果：2 2、不同浓度的海藻、不同浓度的海藻(hi zo)(hi zo)酸钠对酶活力的影响：酸钠对酶活力的影响：随着随着(su zhe)(su zhe)海藻酸钠浓度的增加，包埋木瓜蛋白酶的量会逐渐增加，但继续加大海藻酸海藻酸钠浓度的增加，包埋木瓜蛋白酶的量会逐渐增加，但继续加大海藻酸钠浓度就会使表面密度不断加大，底物运动扩散更加困难，降低酶活。木瓜蛋白酶固定化的钠浓度就会使表面密度不断加大，底物运动扩散更加困难，降低酶活。木瓜蛋白酶固定化的最适海藻酸钠浓度为最适海藻酸钠浓度为3
14、3。第十六页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化实验实验(shyn)(shyn)结果：结果：3 3、不同浓度不同浓度(nngd)(nngd)的的GaG1GaG12 2溶液对固定化木瓜蛋白酶活力溶液对固定化木瓜蛋白酶活力的的影响影响当当CaC12 CaC12 浓度为浓度为5 55 5时酶活最高。一般时酶活最高。一般(ybn)(ybn)情况下凝胶强度与钙离子浓度成正比，情况下凝胶强度与钙离子浓度成正比，但由于有微孔淀粉的存在使钙离子对木瓜蛋白酶的抑制作用发生变化，但总体上酶活是先升但由于有微孔淀粉的存在使钙离子对木瓜蛋白酶的抑制作用发生变化，但总体上酶活是先升高后降低的。高后降低的。第十七页，共二十四
15、页。木瓜蛋白酶的固定化食品(shpn)酶学 研究生课件利用金属螯合配体与蛋白质相结合的原理，利用金属螯合配体与蛋白质相结合的原理，选用磁性琼脂糖选用磁性琼脂糖- -亚氨基二乙酸亚氨基二乙酸(y (y sun)sun)（IDAIDA）-Gu-Gu2+2+ 做为金属螯合载做为金属螯合载体，定向固定木瓜蛋白酶。体，定向固定木瓜蛋白酶。结果结果(ji gu)总结总结实验结果分析实验结果分析实验步骤实验步骤共价结合吸附固定木瓜蛋白酶共价结合吸附固定木瓜蛋白酶实验原理实验原理1.1.载体的制备载体的制备 2.2.酶的固定化酶的固定化 3.3.酶活的测定酶活的测定 4.4.载体吸附载体吸附GuGu2+2+
16、的量对固定化酶的影响的量对固定化酶的影响 5.5.固定化时间的影响固定化时间的影响 6.pH 6.pH 对对固定化酶的影响固定化酶的影响 7.7.给酶量对固定化酶的影响给酶量对固定化酶的影响 8.8.固定化酶固定化酶的性质的性质采用反相悬浮包埋法制备，利用原子吸收分光光度法采用反相悬浮包埋法制备，利用原子吸收分光光度法测定上清测定上清GuGu2+2+ 浓度，计算载体吸附浓度，计算载体吸附Gu2+Gu2+的量。的量。取螯合载体，加入木瓜蛋白酶室温下取螯合载体，加入木瓜蛋白酶室温下振荡振荡4h4h，用，用PBSPBS洗涤数次至上清中检测不到酶活，洗涤数次至上清中检测不到酶活，即得固定化的木瓜蛋白酶
17、即得固定化的木瓜蛋白酶在使用金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶时，固定化反应条在使用金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶时，固定化反应条件温和，对酶的高级结构件温和，对酶的高级结构影响小，酶活回收高；固定化酶的热稳定性明显提高；载体的载酶影响小，酶活回收高；固定化酶的热稳定性明显提高；载体的载酶量大；载体的再生、酶的固定化过程操作简单；固定化酶及载体可量大；载体的再生、酶的固定化过程操作简单；固定化酶及载体可多次重复利用多次重复利用第十八页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化实验实验(shyn)(shyn)结果分析结果分析1 1、载体、载体(zit)(zit)吸附吸附GuGu2+2+ 的量对固定化酶的影
18、响的量对固定化酶的影响: :当当Gu2+Gu2+载体载体1.51.51010-2-2mol/g mol/g 时，酶活随给时，酶活随给Gu2+Gu2+量的增加而增加，这是因为琼脂糖量的增加而增加，这是因为琼脂糖IDAIDA只有只有(zhyu)(zhyu)在结合了在结合了Gu2+Gu2+后才能以配位作用固定后才能以配位作用固定酶，随给酶，随给Gu2+Gu2+量的增加载体表面固定木瓜蛋白量的增加载体表面固定木瓜蛋白酶的位点增多，导致载酶量增加而引起酶活上升；酶的位点增多，导致载酶量增加而引起酶活上升；当当Gu2+Gu2+载体载体 1.5 1.51010-2-2mol/gmol/g时，载体表面的时，载
19、体表面的IDA IDA 逐渐被逐渐被Gu2+Gu2+饱和至过饱和，载体的载酶量达到饱和至过饱和，载体的载酶量达到最大值，但被琼脂糖最大值，但被琼脂糖IDAIDA载体过量吸附的载体过量吸附的Gu2+Gu2+在在随后的酶反应过程中溢出至溶液中抑制了木随后的酶反应过程中溢出至溶液中抑制了木瓜蛋白酶的活性，使得酶活随瓜蛋白酶的活性，使得酶活随Gu2+Gu2+量的增加而量的增加而减少。减少。第十九页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化实验实验(shyn)(shyn)结结果分析果分析2.2.固定化时间固定化时间(shjin)(shjin)的影的影响响载体载体(zit)(zit)的载酶量随固定化时间的延长而增加
20、，的载酶量随固定化时间的延长而增加，4h4h达到最大值并趋于稳定。达到最大值并趋于稳定。3.pH 3.pH 对固定化酶的影响对固定化酶的影响载体的载酶量随载体的载酶量随PH PH 值的增大而增加，值的增大而增加，pH7 pH7 时饱和。时饱和。第二十页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化4.4.给酶量对固定化酶的影响给酶量对固定化酶的影响(yngxing)(yngxing)实验实验(shyn)(shyn)结结果分析果分析给酶量为给酶量为10mg/g 10mg/g 载体时，酶的固定化率最高，载体时，酶的固定化率最高，随着给酶量的增大，载体上金属螯合配体结合位随着给酶量的增大，载体上金属螯合配体结合位
21、点逐渐饱和，固定化率逐渐降低，与此相反，所点逐渐饱和，固定化率逐渐降低，与此相反，所得的固定化酶的活力逐渐增加。根据以上结果，得的固定化酶的活力逐渐增加。根据以上结果，在固定化酶的制备实验中，每次给酶量为在固定化酶的制备实验中，每次给酶量为30mg/g 30mg/g 载体，这样载体，这样(zhyng)(zhyng)就能以较低的给酶量得就能以较低的给酶量得到较高活力的固定化酶和较高的固定化率。到较高活力的固定化酶和较高的固定化率。第二十一页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化参考文献参考文献1 1、沈、沈 斌，魏荣卿，欧阳平凯等；胺化聚苯乙烯载体柔性固定化木瓜蛋白酶斌，魏荣卿，欧阳平凯等；胺化聚苯乙
22、烯载体柔性固定化木瓜蛋白酶J;J;化化 工工 学学 报报;2005.06,56(6):1070-1075.;2005.06,56(6):1070-1075.2 2、金、金 锋锋; ;微孑微孑L L淀粉一海藻淀粉一海藻(hi zo)(hi zo)酸钠固定化木瓜蛋白酶的研究酸钠固定化木瓜蛋白酶的研究J;J;中国酿造中国酿造;2009,208(7):83-85.;2009,208(7):83-85.3 3、刘琳琳，曾力希，刘婷，邓乐、刘琳琳，曾力希，刘婷，邓乐; ;金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶的研究金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶的研究J;J;生物工程学生物工程学报报;2005.09,21(5)
23、:789-793.;2005.09,21(5):789-793.4 4、程凡亮、程凡亮, ,陈伶利陈伶利, ,王卫等；氨基化二氧化硅颗粒固定木瓜蛋白酶研究王卫等；氨基化二氧化硅颗粒固定木瓜蛋白酶研究J;J;生物工程学报生物工程学报;2004.03,20(2):287-289.;2004.03,20(2):287-289.5 5、王宪政、王宪政; ;固定化木瓜蛋白酶研究进展固定化木瓜蛋白酶研究进展J;J;山东化工山东化工;2009,38:31-39.;2009,38:31-39.6 6、徐元，何琦、徐元，何琦; ;木瓜蛋白酶的固定化及其在啤酒澄清中应用的研究木瓜蛋白酶的固定化及其在啤酒澄清中应用
24、的研究J;J;天然产物分离天然产物分离;2003,1(3):6-12.;2003,1(3):6-12.第二十二页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化LOGO第二十三页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化内容(nirng)总结酶的固定(gdng)化。木瓜蛋白酶的固定(gdng)。一、微孔淀粉海藻酸钠固定(gdng)化木瓜蛋白酶。（载体吸附共价结合）。固定(gdng)化木瓜蛋白酶的最适pH值为5.7，最适温度72。当CaC12 浓度为55时酶活最高。载体的载酶量随固定(gdng)化时间的延长而增加，4h达到最大值并趋于稳定。4.给酶量对固定(gdng)化酶的影响。4、程凡亮,陈伶利,王卫等。Thank You第二十四页，共二十四页。木瓜蛋白酶的固定化
