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1、细胞细胞(xbo)(xbo)免疫学检测免疫学检测（cellular immunoassaycellular immunoassay）一、淋巴细胞表面标志物检测一、淋巴细胞表面标志物检测 (Assay of membran molecules for (Assay of membran molecules for lymphocyteslymphocytes） 第一页，共七十页。淋巴细胞标志检测l一、免疫一、免疫(miny)(miny)细胞分离技术细胞分离技术 (Technic of separation for immunocyte) (Technic of separation for im
2、munocyte)l二、免疫细胞表面标志检测技术二、免疫细胞表面标志检测技术 （Assay of membran molecules for Assay of membran molecules for ）l三、免疫细胞功能检测技术三、免疫细胞功能检测技术 （Assay for Immunocyte Tuntion Assay for Immunocyte Tuntion ）l四、细胞因子与黏附分子检测技术四、细胞因子与黏附分子检测技术（Assay for Cytokine and Adhesion Assay for Cytokine and Adhesion moleculemolecul
3、e）第二页，共七十页。淋巴细胞标志检测免疫系统免疫系统(Immune system)(Immune system)l免疫器官免疫器官(qgun)(Immune Organs)(Immune Organs)l免疫细胞免疫细胞(Immunocyte)(Immunocyte)l免疫球蛋白免疫球蛋白(Immunoglobulin)(Immunoglobulin)l主要组织相容性复合体主要组织相容性复合体 (Major Histocompatibility Complex; MHC) (Major Histocompatibility Complex; MHC)l细胞因子细胞因子(Cytekine)(C
4、ytekine)l白细胞分化抗原和粘附分子白细胞分化抗原和粘附分子(Leukocyte (Leukocyte Differentiation Antigen and Adhesion Differentiation Antigen and Adhesion molecule)molecule)第三页，共七十页。淋巴细胞标志检测免疫免疫(miny)(miny)细胞细胞(immune cells)(immune cells)l指指:所有参与免疫应答或与免疫应答有关所有参与免疫应答或与免疫应答有关(yugun)的细胞的细胞l包括包括T T细胞、细胞、B B细胞、细胞、NKNK细胞、单核吞噬细胞、单核
5、吞噬细胞、树突状细胞及其他细胞细胞、树突状细胞及其他细胞第四页，共七十页。淋巴细胞标志检测免疫免疫(miny)(miny)细胞分离技术细胞分离技术(Separation of immunocytes)(Separation of immunocytes)第五页，共七十页。淋巴细胞标志检测人外周血人外周血(peripheral blood )(peripheral blood )白细胞分离白细胞分离(fnl)(fnl)l一、一、原理原理(principle)(principle)： 红细胞红细胞/ /白细胞比例不同（白细胞比例不同（60060010001000）：）：1 1，密度不，密度不同，沉
6、降速度不同。同，沉降速度不同。l二、方法二、方法(method)(method)： 1 1、自然沉降法、自然沉降法（直立静置（直立静置RT30RT3060min60min，紧贴红细胞层上的白膜层），紧贴红细胞层上的白膜层） 2 2、聚合物加速沉降法、聚合物加速沉降法（加某些高分子物使（加某些高分子物使RBCRBC凝集成串凝集成串(chn chun)(chn chun)加速沉降，加速沉降，如明胶）如明胶）第六页，共七十页。淋巴细胞标志检测人外周血单个核细胞人外周血单个核细胞(xbo)(xbo)（peripheral blood peripheral blood mononuclear cells
7、mononuclear cells，PBMCPBMC）的分离的分离加入加入(jir)对倍稀释的血液样本对倍稀释的血液样本 水平式离心水平式离心(lxn)20min时结果时结果第七页，共七十页。淋巴细胞标志检测聚蔗糖聚蔗糖(zhtng)(zhtng)-泛影葡胺泛影葡胺(ficoll-hypaque)(ficoll-hypaque)(1.0770.001g/L)l 分离分离(fnl)人外周血淋巴细胞以密度为人外周血淋巴细胞以密度为1.0770.001/g/L第八页，共七十页。淋巴细胞标志检测PercollPercoll混悬液混悬液( (处理过的硅胶颗粒处理过的硅胶颗粒(kl)(kl) )原液密度原
8、液密度(density)(density)为为1.135g/L+1.135g/L+等量等量PBS, PBS, 高速离心高速离心 (centrifugation)(centrifugation)由下而上的逐减的连续密度梯度由下而上的逐减的连续密度梯度(density gradient)(density gradient)淋巴细胞纯度淋巴细胞纯度98%, 98%, 单核细胞纯度单核细胞纯度78%78%流程长流程长, , 步骤繁步骤繁, , 成本高成本高第九页，共七十页。淋巴细胞标志检测人外周血淋巴细胞人外周血淋巴细胞(亚群亚群)的分纯的分纯(purificcation)(purificcation
9、)l人外周血单个核细胞（人外周血单个核细胞（PBMC）主含淋巴细胞）主含淋巴细胞, 但混有但混有单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯：单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯：（一）红细胞的去除（一）红细胞的去除（0.83%氯化铵、蒸馏水）氯化铵、蒸馏水）（二）血小板的去除（离心、洗涤）（二）血小板的去除（离心、洗涤）（三）单核、粒细胞的去除（黏附去除，羰基（三）单核、粒细胞的去除（黏附去除，羰基(tn j)铁粉吞噬）铁粉吞噬）（四）淋巴细胞亚群的分离（四）淋巴细胞亚群的分离第十页，共七十页。淋巴细胞标志检测淋巴细胞亚群的分离淋巴细胞亚群的分离(fnl)(fnl)l分离
10、依据分离依据(yj)： 1、淋巴细胞不同亚群其细胞表面标志（淋巴细胞不同亚群其细胞表面标志（ specific membrane specific membrane molecule/surface markermolecule/surface marker） 2 2、淋巴细胞不同亚群其细胞分化抗原（、淋巴细胞不同亚群其细胞分化抗原（antigen of antigen of cluster differentiation cluster differentiation ；CDCD）l分离方法：分离方法：l1、第十一页，共七十页。淋巴细胞标志检测Precipitation of E roset
11、tePrecipitation of E rosettelErythrocyte Rosette forming cell; ERFCErythrocyte Rosette forming cell; ERFC The sueface of T lymphocyte contains the The sueface of T lymphocyte contains the receptor (CDreceptor (CD2 2) of sheep erythrocyte ,which is ) of sheep erythrocyte ,which is called E receptor f
12、or short . T lympho-cytes called E receptor for short . T lympho-cytes can form E rosette with sheep erythro-cytes by can form E rosette with sheep erythro-cytes by its E receptor. its E receptor. lLymphocytes + sLymphocytes + sRBCRBC , centrifugation- , centrifugation- T lympho-cytes( T lympho-cyte
13、s(底底) / B lympho-cytes) / B lympho-cytes（界面界面(jimin)(jimin)） 第十二页，共七十页。淋巴细胞标志检测l2、黏着性（理化）：、黏着性（理化）： B淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维(xinwi)（尼龙纤维（尼龙纤维(xinwi)）表面，）表面，而而T淋巴细胞则不易附着淋巴细胞则不易附着（例）尼龙棉柱分离（例）尼龙棉柱分离 直接流出的是直接流出的是T淋巴细胞。淋巴细胞。l3、免疫学：用特异性抗体并使其固相化，捕获具特定膜抗原、免疫学：用特异性抗体并使其固相化，捕获具特定膜抗原的细胞的细胞（例）（例）1、亲和板结合分离、亲和板结
14、合分离 (affinity (affinity ) ) 2 2、免疫磁珠分离、免疫磁珠分离 （immunomagnetic beadsimmunomagnetic beads） 3 3、流式细胞术分离、流式细胞术分离 (FCM) (FCM) 第十三页，共七十页。淋巴细胞标志检测第十四页，共七十页。淋巴细胞标志检测磁性磁性(cxng)(cxng)(cxng)(cxng)微珠微珠(magnetic beads):(magnetic beads):磁性微珠是以金属离子为核心，外层磁性微珠是以金属离子为核心，外层均匀包裹高分子聚合体的固相颗粒。均匀包裹高分子聚合体的固相颗粒。磁性微珠上既可标记针对某种
15、细胞表磁性微珠上既可标记针对某种细胞表面抗原的特异性抗体面抗原的特异性抗体(kngt)（直接（直接法）法）; 也可标记羊抗鼠也可标记羊抗鼠IgG抗体抗体(kngt)(间接法），使分离细胞的范间接法），使分离细胞的范围大大扩大围大大扩大第十五页，共七十页。淋巴细胞标志检测l正选正选（positive selectionpositive selection）法：法： 磁珠结合的细胞就是所要分离获得磁珠结合的细胞就是所要分离获得(hud)的细的细胞胞l负选（负选（negtive selectionnegtive selection）法：）法： 磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细磁珠结合不需要的细
16、胞，游离于上清液的细胞为所需细胞胞为所需细胞l一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大第十六页，共七十页。淋巴细胞标志检测l评价评价(evalution)(evalution)：l免疫磁珠分离法具有高纯度（免疫磁珠分离法具有高纯度（8080 9999），高得率（），高得率（9090 9595）、高细胞活性（）、高细胞活性（99100%99100%）的特点，仅次或相当于流式细胞）的特点，仅次或相当于流式细胞仪（仪（FACSFACS）的分选效率。）的分选效率。 与与FACS FACS 相比，本方法操作相比，本方法操作(cozu)(cozu)简单、省时、经济；可用简单
17、、省时、经济；可用做做FACSFACS分选前的预分离，以减少分选前的预分离，以减少FACSFACS所用时间。所用时间。 另外连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度，通常可另外连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度，通常可达达95959999。第十七页，共七十页。淋巴细胞标志检测注意事项（注意事项（AttentionsAttentions）l如果分离细胞用作培养，全过程在超净台中完成。如果分离细胞用作培养，全过程在超净台中完成。l分离柱一般只能一次应用，再用时分离效率降低。分离柱一般只能一次应用，再用时分离效率降低。l抗体包被抗体包被(bo bi)磁珠和死细胞常有非特异性结合，因而分磁珠和死
18、细胞常有非特异性结合，因而分选前应去除死细胞；上分离柱前，充分振荡混悬细胞，选前应去除死细胞；上分离柱前，充分振荡混悬细胞，打散细胞团块。打散细胞团块。l用分离柱分选，应用真空抽滤水，减少水中气泡，使分离用分离柱分选，应用真空抽滤水，减少水中气泡，使分离柱不被气泡阻滞柱不被气泡阻滞第十八页，共七十页。淋巴细胞标志检测荧光荧光(ynggung)(ynggung)激活细胞分离仪原理激活细胞分离仪原理(principle)(principle)（fluorescence activated cell sorterfluorescence activated cell sorter，FACSFACS）
19、n细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区。测区。n当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴，每小滴内最多含一个细胞（其中只有百分之几的液滴中串的均匀小滴，每小滴内最多含一个细胞（其中只有百分之几的液滴中含细胞）。含细胞）。n细胞经激光照射产生荧光和散射光，信号经计算机系统处理细胞经激光照射产生荧光和散射光，信号经计算机系统处理(chl)，分辨细胞的类型。如识别的是所需的细胞时（如，分辨细胞的类型。如识别的是所需的细
20、胞时（如T细胞），细胞），使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带电荷，使所需的细胞在使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带电荷，使所需的细胞在电场偏转下进入不同的收集管。电场偏转下进入不同的收集管。第十九页，共七十页。淋巴细胞标志检测n评价评价(evalution)(evalution) ： 用用FACS分离细胞准确分离细胞准确(zhnqu)快速、纯度高、回收率快速、纯度高、回收率高，能保持细胞活力，并可在无菌条件下进行。高，能保持细胞活力，并可在无菌条件下进行。 仪器昂贵，极少用于常规，而多数仅作为研究的手仪器昂贵，极少用于常规，而多数仅作为研究的手段段第二十页，共七十页。淋巴细胞标志检测吞噬细胞吞
21、噬细胞(tn sh x bo)(tn sh x bo)(phagocytosis)(phagocytosis)分离分离lPhagocytes - Phagocytes - mononuclearmononuclear macrophage macrophage neutrophil neutrophil、eosinophileosinophil、basophilbasophill分离（分离（SeparationSeparation）：）： Mononuclear Mononuclear 参照参照(cnzho)(cnzho)PercollPercoll分层液法分层液法 Macrophage Ma
22、crophage 斑蝥敷贴（诱发无菌性皮炎）斑蝥敷贴（诱发无菌性皮炎） Other Other 很少分纯很少分纯第二十一页，共七十页。淋巴细胞标志检测树突状细胞树突状细胞(xbo)(xbo)（Dendritic cellDendritic cell）lDendritic cellsDendritic cells（DCsDCs）are the most potent are the most potent antigen presenting cellantigen presenting cell（APCAPC）knownknown，which which have numerous speci
23、alized features that make have numerous specialized features that make them extremely efficient at capturing and them extremely efficient at capturing and presenting antigen and activating T cells presenting antigen and activating T cells and mediating immune response.and mediating immune response.
24、树突细胞是体内功能最强的专职树突细胞是体内功能最强的专职(zhunzh)抗原提呈细胞，可把抗抗原提呈细胞，可把抗 原特异性地提呈给原特异性地提呈给T淋巴细胞而产生抗原特异性免疫应淋巴细胞而产生抗原特异性免疫应 答。答。第二十二页，共七十页。淋巴细胞标志检测树突状细胞树突状细胞(xbo)(xbo)（Dendritic cellDendritic cell）制备）制备lDCs can be generatedDCs can be generated，in vitroin vitro，from many from many different samples of human beings.diff
25、erent samples of human beings.lDCs only constitue 0.5DCs only constitue 0.51.0% of the 1.0% of the peripheral blood mononuclear cells.peripheral blood mononuclear cells.lDCs can be generated from monocyto/MDCs can be generated from monocyto/M + IL-4 and GM-CSF + IL-4 and GM-CSFlIdentifing DCs by CD
26、markerIdentifing DCs by CD marker第二十三页，共七十页。淋巴细胞标志检测免疫细胞功能免疫细胞功能(gngnng)(gngnng)检测检测(Assays for immunocytes)(Assays for immunocytes)一、功能简介一、功能简介二、测定方法二、测定方法第二十四页，共七十页。淋巴细胞标志检测T lymphocytesT lymphocytesl 外周血中外周血中T细胞占淋巴细胞总数的细胞占淋巴细胞总数的65%70%l来源于骨髓干细胞（胚胎期为卵黄囊和胎肝，来源于骨髓干细胞（胚胎期为卵黄囊和胎肝，Bone-marrow stem cell
27、sBone-marrow stem cells），在胸腺中发育，在胸腺中发育和分化和分化(fnhu)。l分化成熟分化成熟（be derivedbe derived）后离开胸腺进入外）后离开胸腺进入外周免疫器官的胸腺依赖区定居。周免疫器官的胸腺依赖区定居。l淋巴细胞再循环淋巴细胞再循环(recycle)(recycle)（血液（血液组织组织淋淋巴巴血液）血液）第二十五页，共七十页。淋巴细胞标志检测T T细胞细胞(xbo)(xbo)(xbo)(xbo)亚群（亚群（SubsetSubset）l根据根据TCRTCR不同分为不同分为TT细胞细胞(xbo)(xbo)和和T T细胞细胞l根据表面标志和分化抗
28、原的不同，根据表面标志和分化抗原的不同，T T可分为可分为CD4CD4和和CD8 CD8 T T细胞细胞lCD4 CD4 T T细胞根据其分泌的细胞因子和介导的功能在细胞根据其分泌的细胞因子和介导的功能在分为分为Th1Th1和和Th2Th2lCD8 CD8 T T细胞依据其功能不同分为细胞毒性细胞依据其功能不同分为细胞毒性(cytotoxicity)T(cytotoxicity)T细胞和抑制性细胞和抑制性(suppresion)T(suppresion)T细胞细胞lNK 1.1 NK 1.1 T T细胞专一识别脂类细胞专一识别脂类(lipid)(lipid)抗原、非抗原、非MHCMHC限制限制
29、第二十六页，共七十页。淋巴细胞标志检测Type-I /2 T helperType-I /2 T helper（Th1,Th2Th1,Th2）lTh1Th1细胞主要分泌细胞主要分泌IL-2IL-2、IFN-IFN-和和TNF-TNF-，介导细胞免疫，介导细胞免疫lTh2Th2细胞主要分泌细胞主要分泌IL-4IL-4、 IL-5 IL-5、 IL-6 IL-6、 IL-10IL-10，介导体液免疫，介导体液免疫lTh1Th1和和Th2Th2是一对重要的调节是一对重要的调节(regulation)(regulation)细胞，同时又互为抑制细胞，同时又互为抑制(inhibition)(inhibi
30、tion)细胞，细胞，二类细胞的相互二类细胞的相互(xingh)(xingh)平衡平衡(balance)(balance)与否与否直接影响直接影响(influence)(influence)机体的免疫功能机体的免疫功能第二十七页，共七十页。淋巴细胞标志检测T-cytotoxic cells, Tc/CTLT-cytotoxic cells, Tc/CTL（1 1）lCD8CD8+ +T T细胞细胞l免疫应答的主要效应免疫应答的主要效应(effect)(effect)细胞细胞l特异性杀伤特异性杀伤(shshng)(shshng)靶细胞靶细胞(target cells)(target cells)
31、l在肿瘤免疫和抗病毒感染的免疫中发挥重在肿瘤免疫和抗病毒感染的免疫中发挥重要作用要作用l功能发挥受功能发挥受MHC IMHC I类限制类限制第二十八页，共七十页。淋巴细胞标志检测Tc/CTLTc/CTL（2 2）l除细胞毒效应外，除细胞毒效应外，CTLCTL还可分泌一系列细胞还可分泌一系列细胞因子，调节因子，调节(tioji)(tioji)(regulation)(regulation)免疫功能；免疫功能；也分泌趋化性也分泌趋化性(tend to)(tend to)细胞因子如细胞因子如IL-8IL-8、IP-10IP-10（IFN inducible protein 10IFN inducib
32、le protein 10）、）、IP-1IP-1（巨噬细胞炎症蛋白）等，介导炎症（巨噬细胞炎症蛋白）等，介导炎症反应反应(inflammatory reaction)(inflammatory reaction)。l依据依据CTLCTL分泌细胞因子的不同可分为分泌细胞因子的不同可分为Tc1Tc1和和Tc2Tc2。第二十九页，共七十页。淋巴细胞标志检测T-suppresion cells, TsT-suppresion cells, Tsl通过过继转移实验通过过继转移实验(passive transfer test)(passive transfer test)加以确认加以确认(confirm
33、)(confirm)。l可能可能(may be)(may be)作为单独的功能细胞群体存在作为单独的功能细胞群体存在(cnzi)(cnzi)l多年来未能找到多年来未能找到TsTs特有（特有（specificspecific）的表面）的表面标志（标志（surface markersurface marker）。）。第三十页，共七十页。淋巴细胞标志检测第三十一页，共七十页。淋巴细胞标志检测 B B淋巴细胞的分化淋巴细胞的分化(fnhu)(fnhu)(fnhu)(fnhu)成熟（成熟（ be derived be derived ） 骨髓干细胞骨髓干细胞前前B B细胞细胞未成熟未成熟B B细胞细胞成
34、熟成熟B B细胞细胞激活激活B B细胞细胞浆细胞浆细胞（plasma cellsplasma cells）经过）经过IgIg基因重排、活基因重排、活化化(huhu)(huhu)(huhu)(huhu)、转录最终表达、转录最终表达BCRBCR。（B-cell-receptor complex,BCRB-cell-receptor complex,BCR） 第三十二页，共七十页。淋巴细胞标志检测前（前（pro/prepro/pre）B B细胞细胞(xbo)(xbo)(xbo)(xbo)l细胞浆出现细胞浆出现链，并诱导轻链的重排链，并诱导轻链的重排 （rearrangerearrange）；）；l不
35、表达不表达BCRBCRl不具有不具有(jyu)(jyu)任何已知的生物学功能任何已知的生物学功能 BCR ( BCR (B-cell-receptor)B-cell-receptor)B-cell-receptor)B-cell-receptor) : : B-cell surface immunoglobulin and its B-cell surface immunoglobulin and its associated signalling molecules, CD79a associated signalling molecules, CD79a and CD79b. and CD
36、79b. 第三十三页，共七十页。淋巴细胞标志检测未成熟（未成熟（immatureimmature）B B细胞细胞(xbo)(xbo)(xbo)(xbo)l替代轻链（替代轻链（SLSL）preBCR preBCR 细胞质细胞质IgM IgM 膜膜IgMIgMl膜膜IgMIgM是是B B细胞分化细胞分化(fnhu)(fnhu)成熟中首先出现的成熟中首先出现的BCRBCR，也，也是未成熟是未成熟B B细胞的表面标志细胞的表面标志l此时此时B B细胞具有识别（细胞具有识别（recognitionrecognition）抗原的能力，但还）抗原的能力，但还不能介导免疫应答不能介导免疫应答l处于抗原敏感期，
37、受到相应刺激后会导致细胞凋亡处于抗原敏感期，受到相应刺激后会导致细胞凋亡（apoptosisapoptosis），是），是B B细胞自身免疫耐受细胞自身免疫耐受（immunological toleranceimmunological tolerance）的重要机制）的重要机制第三十四页，共七十页。淋巴细胞标志检测成熟成熟(chngsh)(chngsh)(chngsh)(chngsh)（maturemature）B B细胞细胞l细胞浆和细胞膜都表达细胞浆和细胞膜都表达(biod)(biod)IgMIgM和和IgDIgDl能识别抗原能识别抗原(recognition of antigen)(re
38、cognition of antigen)，介导特异性免疫应答介导特异性免疫应答lB B细胞此时完成在骨髓中的分化和成熟细胞此时完成在骨髓中的分化和成熟第三十五页，共七十页。淋巴细胞标志检测活化活化(huhu)(huhu)(huhu)(huhu)（activeactive）B B细胞和浆细细胞和浆细胞胞l无抗原刺激时，无抗原刺激时，B B细胞在外周免疫器官中仅细胞在外周免疫器官中仅存活存活7 71010天天l当受到抗原刺激时，当受到抗原刺激时，B B细胞可被活化并增殖细胞可被活化并增殖和分化，进入激活状态和分化，进入激活状态l最终向浆细胞分化最终向浆细胞分化l浆细胞大量合成浆细胞大量合成(hc
39、hng)(hchng)和分泌和分泌IgIg，BCRBCR数量减数量减少少第三十六页，共七十页。淋巴细胞标志检测B B细胞细胞(xbo)(xbo)(xbo)(xbo)亚群（亚群（ Subset Subset ）l为异质性群体，显示不同为异质性群体，显示不同(b tn)(b tn)的功能和标的功能和标志，依据志，依据CD5CD5将将B B细胞分为细胞分为B1B1和和B2B2。 （一）（一）B1B1细胞：细胞： CD5 CD5 + +，主要识别非蛋白质抗原，如细菌，主要识别非蛋白质抗原，如细菌脂多糖。无须脂多糖。无须ThTh细胞辅助，可直接介导对细胞辅助，可直接介导对非胸腺依赖抗原的免疫应答，产生特
40、异性非胸腺依赖抗原的免疫应答，产生特异性抗体为低亲和力，不产生免疫记忆细胞抗体为低亲和力，不产生免疫记忆细胞第三十七页，共七十页。淋巴细胞标志检测（二）（二）B2B2细胞：细胞： CD5 CD5 - -，主要识别蛋白质抗原，主要识别蛋白质抗原(kngyun)(kngyun) 在在ThTh细胞辅助下，被完全激活并介导对细胞辅助下，被完全激活并介导对 胸腺依赖抗原的免疫应答，产生特异性胸腺依赖抗原的免疫应答，产生特异性 抗体抗体第三十八页，共七十页。淋巴细胞标志检测Other immune cellsOther immune cellslNKNK（natural killernatural kil
41、ler）细胞）细胞l单核吞噬单核吞噬(tnsh)(tnsh)（mononuclear phagocytemononuclear phagocyte）细）细胞胞l粒细胞（粒细胞（granulocytesgranulocytes）l肥大（肥大（mastmast）细胞）细胞第三十九页，共七十页。淋巴细胞标志检测NKNK细胞细胞(xbo)(xbo)(xbo)(xbo)l大颗粒淋巴细胞、裸细胞（大颗粒淋巴细胞、裸细胞（nakednaked）l来源于骨髓造血干细胞来源于骨髓造血干细胞l参与细胞免疫参与细胞免疫l在肿瘤免疫、抗病毒感染在肿瘤免疫、抗病毒感染(gnrn)(gnrn)中起重要作中起重要作用用l细
42、胞表面标志较少：细胞表面标志较少：CD2CD2，CD16CD16，CD56CD56，CD69CD69第四十页，共七十页。淋巴细胞标志检测 mononuclear phagocytemononuclear phagocyte l血液中血液中单核细胞（单核细胞（ mononuclear mononuclear ）l组织中组织中巨噬细胞（巨噬细胞（macrophagemacrophage，M M）l来源于骨髓干细胞，发育成单核细胞后，进入来源于骨髓干细胞，发育成单核细胞后，进入血流分布于各种血流分布于各种( zhn)( zhn)组织器官，并有不同命组织器官，并有不同命名名l非特异免疫功能（非特异免疫
43、功能（non-specificnon-specific）l特异性（特异性（ specific specific）免疫功能（免疫调节、）免疫功能（免疫调节、抗原递呈，抗原递呈，antigen-presentingantigen-presenting）第四十一页，共七十页。淋巴细胞标志检测Different denomination Of Different denomination Of mononuclear phagocytemononuclear phagocytelBlood mononuclear cellsBlood mononuclear cellslGeneral tissue
44、macrophageGeneral tissue macrophage，M MlConnective tissue tissue cellsConnective tissue tissue cellslLiver KupfferLiver Kupffers cells celllLung alveolar cellsLung alveolar cellslSkin LangerhanSkin Langerhans cells celllNervous system micro-glia cellsNervous system micro-glia cellsAbdomen abdomen(Ab
45、domen abdomen(腹腔腹腔(fqing)(fqing) M) M第四十二页，共七十页。淋巴细胞标志检测Markers of mononuclear phagocyteMarkers of mononuclear phagocyte l成熟成熟(chngsh)(chngsh)的单核吞噬细胞表达的单核吞噬细胞表达MHC I MHC I 类和类和IIII类分子，协同刺激类分子，协同刺激(co-stimulatory)(co-stimulatory)分分子（子（CD40CD40、B7B7）lCD1CD1，CD2CD2，CD14CD14，CD64CD64，CD32CD32，CD16CD16，C
46、D23CD23，CD35CD35（C3bC3b受体）和受体）和CR3 CR3 （C3biC3bi受受体）体）第四十三页，共七十页。淋巴细胞标志检测树突细胞树突细胞(xbo)(xbo)（Dendritic cellDendritic cell，DCDC）l由骨髓由骨髓( su)( su)中髓样前体细胞分化而来，中髓样前体细胞分化而来，DCDC成熟经历成熟经历2 2个阶段：个阶段：l1 1）经血流迁徙到外周组织和器官，此时）经血流迁徙到外周组织和器官，此时MHCMHC和和B7B7分子的表达水平很低，无功能，分子的表达水平很低，无功能，但可以吞噬和吞饮抗原但可以吞噬和吞饮抗原l2 2）这些细胞经输入
47、淋巴管进入局部淋巴）这些细胞经输入淋巴管进入局部淋巴结，分化为成熟结，分化为成熟DCDC，但不再具有吞噬，但不再具有吞噬活性。活性。第四十四页，共七十页。淋巴细胞标志检测DC DC 的组织的组织(zzh)(zzh)(zzh)(zzh)分布和命名分布和命名l淋巴样器官：淋巴样器官：T T细胞区（并指状细胞区（并指状DCDC）和）和B B细细胞区（滤泡胞区（滤泡DCDC）l非淋巴样器官：皮肤和黏膜非淋巴样器官：皮肤和黏膜(ninm)(ninm)（朗罕细（朗罕细胞）、器官（间质胞）、器官（间质DCDC）l循环体液：血液（血液循环体液：血液（血液DCDC）、淋巴液（隐）、淋巴液（隐蔽细胞）蔽细胞）第四
48、十五页，共七十页。淋巴细胞标志检测DCDC的生物学功能的生物学功能(gngnng)(gngnng)(gngnng)(gngnng)l向向T T细胞递呈抗原（细胞递呈抗原（CD1CD1，CD40CD40，MHCMHC）l参与天然免疫和参与天然免疫和T T细胞亚群的分化细胞亚群的分化l诱导诱导(yudo)(yudo)免疫耐受：淋巴样免疫耐受：淋巴样DCDCl调节免疫应答（抑制调节免疫应答（抑制T T细胞增殖）细胞增殖）l向向B B细胞递呈抗原（滤泡细胞递呈抗原（滤泡DCDC）第四十六页，共七十页。淋巴细胞标志检测Granulocyte and Mast cellsGranulocyte and M
49、ast cellslGranulocyteGranulocyte来源于来源于BMBM（bone marrowbone marrow），参与特异和），参与特异和非特异免疫应答，在炎症中发挥作用，主要分布于血非特异免疫应答，在炎症中发挥作用，主要分布于血液液l肥大细胞主要分布于黏膜和结缔组织中（血液中肥大细胞主要分布于黏膜和结缔组织中（血液中即嗜碱性粒细胞），表达即嗜碱性粒细胞），表达FcRFcR，在，在IgEIgE作用下发作用下发生脱颗粒反应生脱颗粒反应(fnyng)(fnyng)，参与，参与I I型变态反应型变态反应(fnyng)(fnyng)。l主要标志：主要标志：MHCMHC，B7B7，C
50、D40CD40，CD40LCD40L第四十七页，共七十页。淋巴细胞标志检测Assay for the surface markers of Assay for the surface markers of T lymphocyteT lymphocytelT T细胞表面标志（细胞表面标志（ThTh，TsTs，TiTi）l抗体抗体(kngt)(kngt)致敏细胞花环致敏细胞花环(E-rosette)(E-rosette)法（法（CD58CD58受体）受体）l免疫细胞化学法免疫细胞化学法(immunochemistry (immunochemistry ) )l免疫荧光法免疫荧光法(immunof
51、luorescent(immunofluorescent) )lT T细胞亚群检测（细胞亚群检测（flow cytometry sorter, flow cytometry sorter, FCMSFCMS）第四十八页，共七十页。淋巴细胞标志检测Assay for the surface markers Assay for the surface markers of B lymphocyteof B lymphocytelSmIgM (surface membrane SmIgM (surface membrane ) )检测检测lFcFc受体受体(receptor)(receptor)和补
52、体和补体(bt)(bt)(complement)(complement)受体的检测（受体的检测（EACEAC花环）花环） sRBC+ sRBC+溶血素（溶血素（EAEA）+C+C（补体）（补体）- EAC- EAClB B细胞亚群（细胞亚群（CDCD）检测（）检测（FACSFACS）第四十九页，共七十页。淋巴细胞标志检测Assay for the surface markers Assay for the surface markers of NK cellsof NK cellslNatural Killer(NK)cells express neither T Natural Killer
53、(NK)cells express neither T cell nor B cell antigen receptors.cell nor B cell antigen receptors.lCD16 and CD56 molecule are important CD16 and CD56 molecule are important markere of NK cells. markere of NK cells. lADCC(ADCC(抗体抗体(kngt)(kngt)依赖细胞毒性依赖细胞毒性) )(antibody-dependent cellular cytotoxicity )(a
54、ntibody-dependent cellular cytotoxicity )第五十页，共七十页。淋巴细胞标志检测Assays of Cellular immune TunctionAssays of Cellular immune Tunction第五十一页，共七十页。淋巴细胞标志检测Lymphocyte Transformation TestLymphocyte Transformation TestlPrinciple: Principle: Antigens or mitogens (such as PHA Antigens or mitogens (such as PHA and
55、 ConA ) are incubated with T and ConA ) are incubated with T lymphocytes in culture medium, lymphocytes in culture medium, allowing stimulation of T lymphocyte allowing stimulation of T lymphocyte activity to transform into activity to transform into lymphoblasts.lymphoblasts.lMethods: morphologic c
56、ountingMethods: morphologic counting 3 3H-thymidine incorporationH-thymidine incorporation MTT colorimetry MTT colorimetry第五十二页，共七十页。淋巴细胞标志检测lLymphocyte proliferation rate: Lymphocyte proliferation rate: Blast cell count Blast cell count= - 100% = - 100% Small lymphocyte + Blast cell count(200) Smal
57、l lymphocyte + Blast cell count(200)lReference valueReference value：70%70%第五十三页，共七十页。淋巴细胞标志检测3H-thymidine incorporationl3 3H H标记的胸腺嘧啶核苷（标记的胸腺嘧啶核苷（ 3 3H TdR)+H TdR)+细胞培养液中细胞培养液中, , 转化淋巴母细胞的转化淋巴母细胞的DNADNA合成增加合成增加(zngji)(zngji), , 增加增加(zngji)(zngji)的的DNADNA中有中有3 3H TdRH TdR。检测培养后淋巴细胞内放射性核素。检测培养后淋巴细胞内放射
58、性核素量，通过计算判断淋巴细胞的转化程度（量，通过计算判断淋巴细胞的转化程度（SISI）。）。lSISI（stimulating indexstimulating index）= = PHA PHA刺激管刺激管cpmcpm均值均值 / / 对照管对照管cpm cpm 均值均值 （cpmcpm指每分钟脉冲数）指每分钟脉冲数）第五十四页，共七十页。淋巴细胞标志检测MTT colorimetryMTT colorimetryl一种噻唑盐，化学名一种噻唑盐，化学名3-(4,5-3-(4,5-二甲基二甲基-2-2-噻唑噻唑)-2,5-)-2,5-二苯二苯基溴化四唑基溴化四唑(3-(4,5-dimethy
59、lthiazol-2-yl)-2,5-(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)diphenyl tetrazolium bromide)。lMTTMTT作为细胞内线粒琥珀酸脱氢酶的底物参与反应，形成作为细胞内线粒琥珀酸脱氢酶的底物参与反应，形成蓝黑色的甲潜颗粒沉积于细胞内。蓝黑色的甲潜颗粒沉积于细胞内。 + + 盐酸异丙醇盐酸异丙醇/ /二甲亚砜二甲亚砜 溶细胞，释放溶细胞，释放 A570nmA570nm测吸光值，以刺激指数（测吸光值，以刺激指数（SISI）判断淋巴细胞增）判断淋巴细胞增殖程度。殖程度。 SI
60、 = SI = 试验试验(shyn)(shyn)孔孔A570nmA570nm均值均值 / / 对照孔对照孔A570nmA570nm均值均值 第五十五页，共七十页。淋巴细胞标志检测T cell-mediated cytotoxicityT cell-mediated cytotoxicitylT T细胞介导的细胞毒性是细胞毒细胞介导的细胞毒性是细胞毒T T细胞（细胞（CTLCTL）的特性，）的特性，即致敏的即致敏的T T细胞再次接触同抗原的靶细胞（细胞再次接触同抗原的靶细胞（target target cellcell），可表现出对），可表现出对Target cellTarget cell的破坏
61、的破坏(phui)(phui)（裂解（裂解或凋亡）。或凋亡）。lApoptosis is a highly ordered process in which Apoptosis is a highly ordered process in which cells are systematically disassembled.cells are systematically disassembled.lMorphologyMorphology（凋亡小体）（凋亡小体） Electrophoresis Electrophoresis（DNADNA梯状图谱）梯状图谱） FACS or ELISA F
62、ACS or ELISA第五十六页，共七十页。淋巴细胞标志检测Enzyme-linked immune spot,ELISPOTEnzyme-linked immune spot,ELISPOTl酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法: 用抗原包被固相载体用抗原包被固相载体, + (刺激原刺激原- 待检细胞待检细胞) 分泌的抗体分泌的抗体-固相抗原结合固相抗原结合(使细胞吸附于固使细胞吸附于固相相) + 酶标二抗酶标二抗 +底物显色底物显色, 镜下计数着色镜下计数着色(zhu s)斑点。斑点。 应用：检测抗体分泌细胞和其分泌抗体的量应用：检测抗体分泌细胞和其分泌抗体的量 特点：稳定、特异；定性、定量。特
63、点：稳定、特异；定性、定量。第五十七页，共七十页。淋巴细胞标志检测Skin test in vivoSkin test in vivol正常机体对某种抗原建立了细胞免疫后，正常机体对某种抗原建立了细胞免疫后，如用相同的抗原做皮肤试验如用相同的抗原做皮肤试验(shyn)时，常出时，常出现阳性的迟发型超敏反应。本试验现阳性的迟发型超敏反应。本试验(shyn)不不仅可以检查受试者是否对某种抗原具有仅可以检查受试者是否对某种抗原具有特异性细胞免疫应答能力，而且可以检特异性细胞免疫应答能力，而且可以检查受试者总体细胞免疫状态。查受试者总体细胞免疫状态。第五十八页，共七十页。淋巴细胞标志检测lB B细胞功
64、能减低或缺陷，可表现为体内细胞功能减低或缺陷，可表现为体内Ig Ig 和血型抗体和血型抗体量下降或缺如，患者对外源性抗原的应答能力减弱或量下降或缺如，患者对外源性抗原的应答能力减弱或缺如，仅产生极低或不能产生特异性抗体。故临床定缺如，仅产生极低或不能产生特异性抗体。故临床定量测定受检者血清中各种量测定受检者血清中各种IgIg量和相应血型抗体可判断量和相应血型抗体可判断B B细胞功能，也是诊断体液细胞功能，也是诊断体液(ty)(ty)免疫缺陷的重要指标。反免疫缺陷的重要指标。反之，如血清中一种或多种之，如血清中一种或多种IgIg或轻、重链片段异常增高，或轻、重链片段异常增高，表明表明B B细胞产
65、生细胞产生IgIg的功能异常增高。的功能异常增高。 第五十九页，共七十页。淋巴细胞标志检测Skin test in vivoSkin test in vivoIntradermal injectionIntradermal injectionImmediate Immediate (within 20 (within 20 min)min)Late Late (at 4-12 hours) (at 4-12 hours)Delayed Delayed (24-48 hours) (24-48 hours)第六十页，共七十页。淋巴细胞标志检测Assays for Phagocyte functi
66、onAssays for Phagocyte function Phagocyte function:Phagocyte function: 指吞噬细胞的吞噬活力指吞噬细胞的吞噬活力(hul)(hul) 趋化（趋化（chemotaxischemotaxis） 吞噬（吞噬（taken intotaken into） 胞内消化（胞内消化（digestdigest） 第六十一页，共七十页。淋巴细胞标志检测Chemotaxis of leucocyteChemotaxis of leucocyteChemotactic index Chemotactic index (CI) = (CI) = 趋化移
67、动距离趋化移动距离(A)/(A)/自发移动距离自发移动距离(B)(B)趋化指数与细胞的定向趋化指数与细胞的定向(dn xin)移动能力呈正相移动能力呈正相关关 (琼脂糖凝胶平板法琼脂糖凝胶平板法)第六十二页，共七十页。淋巴细胞标志检测吞噬吞噬(Phagocytic)(Phagocytic)和杀菌和杀菌(bactericidal)(bactericidal)功能功能(gngnng)(gngnng)(gngnng)(gngnng)测定测定白细胞白细胞+ +细菌细菌-共同温育共同温育, , 涂片涂片, , 染色镜检，染色镜检，计算计算(j sun)(j sun)吞噬率和杀菌率。吞噬率和杀菌率。吞噬率
68、（吞噬率（phagocytic ratephagocytic rate）%= %= 吞噬细菌的白细胞数吞噬细菌的白细胞数/ /计数的白细胞数计数的白细胞数100%100%杀菌率又称吞噬指数（杀菌率又称吞噬指数（phagocytic indexphagocytic index）%=%= 含着色菌体的白细胞数含着色菌体的白细胞数/ /计数的白细胞数计数的白细胞数100%100%OthersOthers：溶菌法、：溶菌法、NBTNBT还原法、化学发光法等还原法、化学发光法等 第六十三页，共七十页。淋巴细胞标志检测T T细胞表面标记和亚群检测细胞表面标记和亚群检测(jin c)(jin c)(jin
69、c)(jin c)意义意义l1、用于用于T T淋巴细胞总数的计算淋巴细胞总数的计算l2 2、判定、判定T T淋巴细胞的活化程度淋巴细胞的活化程度l3 3、了解、了解CDCD3 3/CD/CD4 4/CD/CD8 8细胞分布正常与否，尤其细胞分布正常与否，尤其CDCD4 4/CD/CD8 8的的比值是否下降、倒置？比值是否下降、倒置？lT T淋巴细胞是机体极其重要的一群免疫细胞，参与并维持淋巴细胞是机体极其重要的一群免疫细胞，参与并维持宿主的细胞免疫功能。其检测助于判断宿主的细胞免疫功能。其检测助于判断(pndun)(pndun)宿主的细胞宿主的细胞免疫状态，助于多种疾病的辅助诊断和发病机理的探
70、明以免疫状态，助于多种疾病的辅助诊断和发病机理的探明以及疗效的评价等。及疗效的评价等。第六十四页，共七十页。淋巴细胞标志检测B B细胞细胞(xbo)(xbo)(xbo)(xbo)表面标记和亚群检测意表面标记和亚群检测意义义l1 1、检测、检测B B淋巴细胞的成熟度和产生不同抗淋巴细胞的成熟度和产生不同抗体细胞的分布。体细胞的分布。l2 2、了解产生免疫球蛋白、了解产生免疫球蛋白B B细胞种类和数量细胞种类和数量的变化，提示增殖、缺陷或恶性？的变化，提示增殖、缺陷或恶性？lB B细胞是机体细胞是机体(jt)(jt)唯一能产生抗体的细胞，唯一能产生抗体的细胞，其参与并维护宿主的体液免疫防御功能。其
71、参与并维护宿主的体液免疫防御功能。第六十五页，共七十页。淋巴细胞标志检测NKNK、吞噬细胞检测、吞噬细胞检测(jin c)(jin c)(jin c)(jin c)意义意义lNKNK细胞为自然杀伤细胞，即不受细胞表面细胞为自然杀伤细胞，即不受细胞表面MHCMHC限制，能直接杀伤效应细胞。具广谱限制，能直接杀伤效应细胞。具广谱的抗肿瘤、感染（胞内寄生）和免疫调节。的抗肿瘤、感染（胞内寄生）和免疫调节。lPhagocytePhagocyte胞质具多种酶，通过胞质具多种酶，通过(tnggu)(tnggu)氧化氧化或非氧化途径杀灭病原体，抗感染。若其或非氧化途径杀灭病原体，抗感染。若其功能低下，助扩散
72、、慢性肉芽肿形成和反功能低下，助扩散、慢性肉芽肿形成和反复感染。复感染。第六十六页，共七十页。淋巴细胞标志检测l小结小结: :1 1、免疫细胞种类多，彼此发挥相应的功能、免疫细胞种类多，彼此发挥相应的功能 分析时需要分离与纯化其相应的细胞。分析时需要分离与纯化其相应的细胞。2 2、免疫细胞的分离是利用不同、免疫细胞的分离是利用不同(b tn)(b tn)细胞的比重、细胞的比重、 黏附力及表面标志物的不同；方法包括花黏附力及表面标志物的不同；方法包括花 环形成、尼龙毛粘着和免疫学原理等。环形成、尼龙毛粘着和免疫学原理等。3 3、免疫细胞功能检测包括：其数量、成熟度、免疫细胞功能检测包括：其数量、
73、成熟度 （标志物表达）和其分泌活性物质的能力（标志物表达）和其分泌活性物质的能力 与其功效的检测。与其功效的检测。4 4、皮肤试验能反映机体细胞免疫功能。、皮肤试验能反映机体细胞免疫功能。第六十七页，共七十页。淋巴细胞标志检测l思考题：思考题：1 1、免疫细胞主要指哪些细胞？分离的方法及其、免疫细胞主要指哪些细胞？分离的方法及其 评价您知道吗？评价您知道吗？2 2、什么是细胞表面标志？具何作用？如何检测？、什么是细胞表面标志？具何作用？如何检测？3 3、您是否、您是否(sh fu)(sh fu)记住记住T T、B B、NKNK和单核细胞的主要表和单核细胞的主要表面面 标志？标志？4 4、T/B
74、T/B细胞功能检测包括哪些内容？细胞功能检测包括哪些内容？5 5、为什么皮肤试验可用于机体细胞免疫功能监、为什么皮肤试验可用于机体细胞免疫功能监 测？测？第六十八页，共七十页。淋巴细胞标志检测 谢谢 谢谢第六十九页，共七十页。淋巴细胞标志检测内容(nirng)总结细胞免疫学检测（cellular immunoassay）一、淋巴细胞表面标志物检测 (Assay of membran molecules for lymphocytes）。淋巴细胞纯度98%, 单核细胞纯度78%。另外(ln wi)连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度，通常可达9599。原特异性地提呈给T淋巴细胞而产生抗原特异性免疫应。计算吞噬率和杀菌率。测第七十页，共七十页。淋巴细胞标志检测
