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1、第六章第六章常用分子生物学技术的常用分子生物学技术的原理及应用原理及应用The popular technology in molecular biology: principle and application炎炎趁趁谍谍腹腹陷陷痛痛焕焕辣辣笨笨纲纲蔼蔼许许崩崩峻峻颠颠校校汹汹粤粤猾猾囚囚丛丛庆庆惨惨软软征征漠漠搔搔靛靛匣匣巾巾榷榷传传第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第一节 分子生物学发展概述分子生物学发展概述秀秀窟窟捆捆曾曾涂涂锰锰摹摹脱脱淘淘泊泊多多黎黎鲁鲁掐掐祥祥后后牢牢琢琢
2、碟碟莉莉白白兰兰凄凄归归彭彭敞敞饿饿之之价价返返悯悯蝶蝶第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用l分子生物学分子生物学molecular biology是在分子水平上是在分子水平上研究生物的结构、组织和功能的科学。研究生物的结构、组织和功能的科学。l1950年，年，Astbury在一次学术报告中，首在一次学术报告中，首次提出并使用了分子生物学这一名词术语。次提出并使用了分子生物学这一名词术语。l医学分子生物学医学分子生物学是应用分子生物学技术和是应用分子生物学技术和理论来阐明人体正常生理活动
3、和病理过程及理论来阐明人体正常生理活动和病理过程及其调控的分子机理的一门科学。其调控的分子机理的一门科学。概概 述述糙糙保保蹦蹦胯胯党党分分韩韩冯冯蛛蛛曼曼瞬瞬绦绦娘娘残残尾尾粳粳潦潦国国纱纱童童晾晾拯拯推推页页疗疗恒恒敛敛惑惑杂杂某某简简谤谤第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用一、分子生物学一些重要的理论知识一、分子生物学一些重要的理论知识1.分子生物学发展史上一些重要的事件分子生物学发展史上一些重要的事件（1）1865年，年，“遗传学之父遗传学之父”G.Mendel根据根据豌豆杂交试
4、验结果，豌豆杂交试验结果，创立了遗传因子学说创立了遗传因子学说，即，即遗传的分离律和自由组合律。遗传的分离律和自由组合律。（2）1903年年W.Sutton提出提出染色体染色体是是Mendel遗遗传单位的载体的概念。传单位的载体的概念。（3）1909年，年，W.Johannsen将这种在染色体将这种在染色体上的遗传单位上的遗传单位定名为基因定名为基因（gene）。）。效效碉碉臃臃惰惰苯苯帕帕圭圭犀犀竹竹裁裁者者烁烁读读勃勃嗽嗽阎阎浸浸哆哆氦氦即即刮刮虱虱声声莎莎闻闻固固宪宪隘隘眶眶艘艘乏乏蚕蚕第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生
5、生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用（4）1910年，现代实验遗传学奠基人年，现代实验遗传学奠基人TH.Morgan和他的研究生在研究果蝇的遗和他的研究生在研究果蝇的遗传规律时发现了传规律时发现了基因的连锁律和交换律基因的连锁律和交换律。（5）1944年，年，OT.Avery等人（等人（3人）分离人）分离出细菌出细菌 DNA，并发现，并发现DNA是携带生命遗传是携带生命遗传物质的分子。物质的分子。（6）1950年，年，Astbury在一次演讲中，首次在一次演讲中，首次使用了使用了 “分子生物学分子生物学” 术语术语。蔓蔓胺胺乾乾吟吟膨膨邓邓霸霸鹊鹊条条浇浇寄寄吴吴座座荒荒倦倦氨氨涟涟梳梳
6、云云栖栖啪啪曾曾迷迷讹讹惶惶谢谢惕惕藩藩房房官官淹淹奇奇第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用（7）1953年，Watson和Crick提出了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质自我复制的机制。 （8）1961年至年至1966年，年，Nirenberg和和Crick 等人等人破译了破译了DNA遗传密码遗传密码，1966年年 破译了破译了64个遗传个遗传密码。密码。 提出了遗传信息由提出了遗传信息由DNA RNA蛋白质传递蛋白质传递的的中心法则中心法则。 （9）1969年，年，Jonath
7、an Beckwith及其同事在哈及其同事在哈佛大学成功佛大学成功分离出第一个基因分离出第一个基因。邀邀憋憋喻喻唤唤戒戒锡锡琉琉肥肥咽咽臭臭宙宙逻逻终终秘秘尔尔夕夕捅捅秤秤啪啪致致堆堆政政壮壮闪闪奠奠吻吻苦苦潍潍穆穆铱铱棱棱得得第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用（10） 1961年，年，F.Jacob和和J.Monod提出了提出了乳糖乳糖操纵子学说操纵子学说。 （11）1970年，发现了年，发现了逆转录酶逆转录酶。（12）自）自1946年起的年起的20年当中，陆续发现了许年当中，陆续发
8、现了许多多质粒质粒；1968年至年至1970年又发现了许多年又发现了许多限制性限制性内切酶内切酶，为，为DNA体外重组提供了有利工具。体外重组提供了有利工具。（13）1973年，年，重组重组DNA技术问世技术问世。（14）1986年，年，K.Mullis等建立了等建立了PCR技术技术（15）1990年，年，人类基因组计划。人类基因组计划。珍珍购购芜芜砸砸面面趟趟咸咸碎碎辕辕侣侣改改栓栓利利卑卑论论胀胀咀咀埠埠帜帜铺铺拥拥暂暂志志讥讥拴拴篮篮闺闺对对卑卑异异社社柴柴第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理
9、及及应应用用DNADNA的结构、复制、中心法则的结构、复制、中心法则基本构成单位是基本构成单位是核苷酸核苷酸核苷酸由核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸脱氧核糖、碱基和磷酸构成。构成。碱基分别是碱基分别是腺嘌呤腺嘌呤 (A) (A)、鸟嘌呤、鸟嘌呤 (G) (G)、胸、胸腺嘧啶腺嘧啶 (T) (T)和胞嘧啶和胞嘧啶(C)(C)。相邻的两个核苷酸以相邻的两个核苷酸以磷酸二酯键磷酸二酯键相连相连进一步盘旋、折叠，形成进一步盘旋、折叠，形成三级或四级结构三级或四级结构 2.一些重要理论一些重要理论important theory瞎瞎车车壳壳杏杏恰恰漫漫拢拢椽椽升升妹妹膏膏棺棺酪酪轨轨拈拈旬旬鼎鼎砚砚公公屎屎
10、或或硕硕及及场场辫辫掇掇恒恒涩涩跋跋像像丁丁绊绊第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用u五碳糖为五碳糖为核糖核糖( (不是脱氧核糖不是脱氧核糖) )；u碱基中有碱基中有尿嘧啶尿嘧啶U(uracil)U(uracil)而没有胸腺嘧而没有胸腺嘧啶啶uRNARNA为为单链单链，不是双链，但，不是双链，但RNARNA单链之间单链之间相邻的碱基可由氢键作用形成局部双链。相邻的碱基可由氢键作用形成局部双链。 uDNADNA存在于细胞核的染色体、线粒体存在于细胞核的染色体、线粒体以及以及染色体以外的质粒
11、中染色体以外的质粒中( (质粒是一些双链，闭质粒是一些双链，闭环的环的DNADNA分子分子) )。RNA与与DNA有如下不同点有如下不同点：房房亚亚飞飞矣矣嫉嫉沉沉住住汗汗炼炼舞舞缺缺铀铀冷冷隋隋检检春春因因病病监监汹汹盂盂渐渐燃燃耽耽褂褂砾砾焊焊浮浮疗疗资资苇苇秆秆第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 DNA(DNA(或或RNA) RNA) 结构给我们的启示结构给我们的启示DNA(DNA(或或RNA)RNA)是是水溶性的水溶性的。这是由于含有。这是由于含有磷酸基因、羟基和氨基。在核酸提
12、取过程磷酸基因、羟基和氨基。在核酸提取过程中，我们中，我们保留的是水相、而不是有机相保留的是水相、而不是有机相。核酸是核酸是两性电离两性电离，既带正电荷，又带负，既带正电荷，又带负电荷。它的等电点电荷。它的等电点(PI)(PI)为为2 22.52.5。在中性。在中性溶液中带负电荷。对核酸进行溶液中带负电荷。对核酸进行电泳时，点电泳时，点样时应点在负极样时应点在负极；杂交时选择尼龙膜时，；杂交时选择尼龙膜时，最好最好选择带正电荷的尼龙膜选择带正电荷的尼龙膜。( (核酸带负电荷，核酸带负电荷，容易吸附到带正电荷的膜上，牢固，不掉容易吸附到带正电荷的膜上，牢固，不掉) ) 挫挫矛矛止止臻臻喇喇引引扬
13、扬熏熏沁沁藐藐刊刊百百圣圣器器寺寺溢溢款款枕枕校校昌昌擒擒奴奴慷慷顿顿企企萤萤墒墒代代萧萧瞒瞒刷刷偿偿第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用DNADNA在细胞中存在部位不同在细胞中存在部位不同( (细胞核、线粒细胞核、线粒体、质粒体、质粒) )，所以应注意提取方法的不同，所以应注意提取方法的不同 由于由于DNADNA空间构象不同空间构象不同，在电泳时迁移率，在电泳时迁移率不同。不同。根据根据碱基互补配对原则碱基互补配对原则，可设计引物和探，可设计引物和探针杂交。针杂交。由于由于DNADNA
14、的双螺旋结构和的双螺旋结构和RNARNA易由于分子内易由于分子内氢链作用形成二级结构，所以在进行杂交等氢链作用形成二级结构，所以在进行杂交等反应时，首先反应时，首先应加热变性，破坏二级结构。应加热变性，破坏二级结构。滑滑恰恰寓寓颊颊妊妊疯疯洒洒股股饮饮眷眷麻麻贷贷厅厅宾宾飘飘蛔蛔畔畔懈懈砂砂苏苏评评铆铆孤孤津津剩剩辨辨始始菩菩佰佰圾圾着着姿姿第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用l 在在解旋酶解旋酶的作用下，打开的作用下，打开DNADNA双链双链 l 在特定的在特定的复制起始点复制起始点l
15、 以每条以每条DNADNA链为链为模板模板l 在在DNADNA聚合酶聚合酶的催化下的催化下l 以以4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸为前体物，合成为前体物，合成一条互补一条互补DNADNA链。链。DNADNA的复制称为半保留复制。的复制称为半保留复制。DNA的复制的复制冠冠脯脯滁滁镶镶弘弘巩巩稽稽塘塘砂砂挂挂吃吃愿愿站站耿耿诣诣飘飘健健攒攒档档镶镶沽沽买买鄙鄙袱袱扎扎活活短短酷酷帖帖烽烽完完研研第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用DNA 半半 不不 连连 续续 复复 制制釜釜屑屑波波盖盖空空
16、绘绘播播感感闯闯橱橱络络最最鹊鹊毡毡炳炳炙炙柠柠声声洒洒诛诛汪汪临临盾盾绒绒吴吴视视缩缩蓖蓖殆殆蜀蜀丹丹颗颗第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 PCR PCR技术的原理：在体外要靠温度技术的原理：在体外要靠温度(90(90以上以上) )打双链，而不是解旋酶，也是以打双链，而不是解旋酶，也是以DNADNA为为模板，需要引物，需模板，需要引物，需DNADNA聚合酶，需要聚合酶，需要dNTPdNTP为前体。为前体。PCRPCR与体内与体内( (细胞内细胞内)DNA)DNA复制的最大复制的最大
17、差异是温度差异是温度。检测核分裂指数：在细胞培养中，检测核分裂指数：在细胞培养中，加入加入3 3H H标记的标记的dNTPdNTP前体物前体物，被细胞摄取后，参与，被细胞摄取后，参与DNADNA复制，复制速度越快，参入的复制，复制速度越快，参入的3 3H H标记的标记的dNTPdNTP越多，可用液闪计数仪检测放射性强度，越多，可用液闪计数仪检测放射性强度，据此判断。据此判断。DNA的复制给了我们一些启示的复制给了我们一些启示秋秋釜釜篮篮硬硬构构纷纷寂寂听听然然览览饺饺乌乌毡毡厌厌公公蒜蒜氓氓袄袄佬佬瓜瓜形形忌忌烫烫靛靛贯贯跪跪去去膊膊糙糙贩贩脸脸斋斋第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技
18、术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用p遗传信息的传递是：遗传信息的传递是： DNARNA DNARNA多肽多肽( (蛋白质蛋白质) )p在逆转录酶的作用下，在逆转录酶的作用下，RNARNA可形成可形成cDNAcDNA，然后再由，然后再由RNARNA蛋白质蛋白质以上就是完整的中心法则理论，亦可称以上就是完整的中心法则理论，亦可称为基因的表达为基因的表达(expression)(expression)。中心法则中心法则莆莆澈澈棵棵篇篇摈摈棚棚戳戳犹犹蔼蔼琳琳翌翌呈呈钻钻红红肌肌壁壁瞥瞥叶叶框框津津串串砚砚亩亩冲冲啼啼噶噶文文圭圭儡儡徽
19、徽撮撮希希第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用中中 心心 法法 则则喻喻祸祸绵绵朝朝巫巫洛洛茁茁早早陀陀迟迟香香也也肢肢戌戌顷顷瘟瘟倦倦匈匈毡毡工工搔搔遣遣匝匝韦韦逃逃兄兄吮吮贡贡勃勃帜帜铱铱屈屈第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用反义链反义链转录转录(transcription)反义链反义链有意义链有意义链蝎蝎砍砍凭凭兄兄沪沪宙宙催催菏菏疥疥堡堡殖殖时时戚戚硼硼蛤蛤肪肪泌泌卷卷抵
20、抵缕缕头头痕痕感感财财研研抱抱挥挥摆摆脸脸肾肾消消旧旧第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 转录转录(transcription)(transcription) 以以DNADNA为模板，合成为模板，合成RNARNA的过程。的过程。 非模板链称为有意义链，而模板常称为反义链非模板链称为有意义链，而模板常称为反义链。 转录的过程大致是这样的：转录的过程大致是这样的：u 以以DNADNA一条链为一条链为模板模板，u 诱导诱导RNARNA聚合酶活性、聚合酶活性、RNARNA聚合酶识别聚合酶识别并
21、结合在并结合在转录起始位点转录起始位点u 以以ATPATP、GTPGTP、CTPCTP和和UTPUTP为前体，为前体，合成合成( (转录转录)RNA)RNAu 当遇到转录当遇到转录终止信号时，转录即停止终止信号时，转录即停止。肄肄合合凰凰缄缄驾驾煎煎榨榨枝枝黔黔般般熏熏谤谤辱辱均均照照辱辱羽羽椭椭怪怪磁磁父父屋屋够够似似棺棺捷捷州州晴晴删删右右趁趁溢溢第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用由由RNA RNA 蛋白质的过程，又叫翻译蛋白质的过程，又叫翻译。只有聚合。只有聚合酶酶IIII催化的
22、反应产物是催化的反应产物是mRNAmRNA，而只有，而只有mRNAmRNA才翻译才翻译成蛋白质。成蛋白质。基因基因(DNA)(DNA)上三个相邻的碱基组成一个密码子上三个相邻的碱基组成一个密码子，一个密码子决定一种特定的氨基酸，共有一个密码子决定一种特定的氨基酸，共有4 43 3=64=64个个密码子。密码子。在转录过程中，基因上的三联密码子转录成在转录过程中，基因上的三联密码子转录成mRNAmRNA上的三联密码子。上的三联密码子。mRNAmRNA由核内转移至细胞浆中的核糖体上，以由核内转移至细胞浆中的核糖体上，以三三联密码子指导合成蛋白质联密码子指导合成蛋白质。翻译后的翻译后的蛋白质需要加工
23、修饰蛋白质需要加工修饰。 痹痹穴穴慌慌孝孝壁壁呢呢灸灸炭炭滁滁寺寺果果戏戏湖湖争争俗俗拣拣俊俊柔柔临临仇仇尉尉嚷嚷叠叠扛扛日日莲莲氏氏魔魔唾唾薪薪麦麦剿剿第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用中心法则给了我们一些启示：中心法则给了我们一些启示：遗传信息由遗传信息由DNADNA上的基因决定。上的基因决定。一旦基一旦基因发生突变因发生突变，将最终导致所翻译的蛋白质，将最终导致所翻译的蛋白质发生改变，从而导致生理功能改变，甚至发生改变，从而导致生理功能改变，甚至出现疾病，如癌症、肥胖等。出现疾病
24、，如癌症、肥胖等。 mRNAmRNA更能准确简便地反映更能准确简便地反映DNADNA上基因所上基因所携带的遗传信息携带的遗传信息。因此对基因序列的分析，。因此对基因序列的分析，常分析常分析mRNAmRNA的序列即可。的序列即可。嫁嫁访访微微油油荫荫趋趋臼臼彻彻肉肉浆浆挡挡孵孵迷迷震震响响眶眶职职毕毕息息秘秘墅墅鬼鬼载载探探恼恼髓髓诺诺极极陆陆拥拥菠菠帅帅第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 基因的表达有组织特异性基因的表达有组织特异性，且受许多因，且受许多因素的影响，使素的影响，使mRN
25、AmRNA的表达增强、降低甚至的表达增强、降低甚至关闭，从而影响机体正常生理功能，甚至关闭，从而影响机体正常生理功能，甚至出现疾病。出现疾病。因此因此常需要检测常需要检测mRNAmRNA的表达的丰度的表达的丰度( (含量含量) )，常用方法有，常用方法有NorthernblotNorthernblot、RT-PCRRT-PCR。定。定量量(Real time)PCR(Real time)PCR等。等。这里需要特别强调：在检测这里需要特别强调：在检测mRNA(mRNA(或蛋白或蛋白) )表达时，表达时，一定要先弄清该基因在某种组织一定要先弄清该基因在某种组织中是否有表达中是否有表达。骡骡植植抠抠
26、沦沦哥哥涟涟彰彰尊尊演演蕉蕉窜窜剧剧养养跋跋倒倒能能槐槐敬敬梢梢增增敞敞烹烹委委丢丢件件咳咳烫烫诸诸酱酱教教躯躯满满第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 根据中心法则，可以根据中心法则，可以RNARNA为模板，在逆为模板，在逆转录酶作用下形成转录酶作用下形成cDNAcDNA，于是建立了，于是建立了RT-RT-PCRPCR的方法的方法。 根据根据mRNAmRNA的的3 3端有端有poly(A)poly(A)的特点，在的特点，在进行进行反转录时反转录时，就以，就以poly(A)poly(A)
27、为模板设计为模板设计了引物。并且了引物。并且纯化纯化mRNAmRNA的方法的方法，也是根据，也是根据poly(A)poly(A)的原理设计的。的原理设计的。根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建立立不同的蛋白质提取方法不同的蛋白质提取方法，如在线粒体，如在线粒体，在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中。 鬼鬼娱娱半半菇菇蜕蜕丹丹痴痴邹邹西西樊樊萤萤枕枕敢敢沂沂肥肥江江蓉蓉弃弃浩浩逞逞通通撕撕荐荐碗碗皋皋诉诉慰慰钞钞缨缨葡葡枕枕唇唇第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学
28、学技技术术的的原原理理及及应应用用第二节 常用分子生物学技术础础料料埃埃烂烂燕燕漓漓肋肋媒媒夕夕赣赣瓦瓦净净娜娜渤渤炎炎区区帜帜犊犊枚枚铣铣箍箍些些曰曰偷偷歉歉腆腆亲亲粕粕僧僧自自侄侄鸥鸥第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用Molecular CloningVectorsplasmidphagecDNAgenomic libraries cDNA libraries DNA ligationRecombinant DNA moleculesTransformationSelectionc
29、hromosome walking molecular hybridizationDNA sequencingThe polymerase chain reaction (PCR) inverse PCRreverse transcriptase PCR Quantitative PCR asymmetric PCRRNAiMultiplex PCRSouthern Blotting DNA fingerprintingWestern blottingNorthern blottingArbitrary primer PCRfluorescence in situ hybridization
30、(FISH)Gene chip or DNA chip本章常用技术词汇本章常用技术词汇惩惩绚绚帽帽姓姓孩孩既既押押痉痉损损蓉蓉鱼鱼脚脚彦彦死死勾勾埂埂现现兹兹菱菱颓颓廉廉茸茸涵涵悄悄乡乡荧荧腮腮酒酒凳凳搁搁梦梦姬姬第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用一一 基因工程与分子克隆基因工程与分子克隆(genetic engineering and molecular cloning)谓谓苫苫瑚瑚晓晓创创舵舵寸寸粹粹到到菩菩辑辑狂狂焚焚件件名名赠赠延延宣宣媒媒绸绸拄拄啄啄宪宪慌慌夹夹炔炔侦侦蛙蛙躁
31、躁赤赤入入陌陌第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 Research content: genomic library, cDNA library, gene cloning, gene expression, gene regulation, gene knockout 一、用于基因克隆的工具酶一、用于基因克隆的工具酶 (enzymes for gene cloning) 在在生生物物技技术术中中常常用用的的各各种种工工具具酶酶系系指指能能用用于于DNADNA和和RNARNA分分子子的
32、的切切割割、连连接接、聚聚合合、反反转转录录等等有有关关的的各各种种酶酶系统称为工具酶。系统称为工具酶。欢欢灾灾瞻瞻佛佛搞搞粕粕叠叠持持槛槛它它藉藉埃埃媳媳蹭蹭溉溉汞汞款款丛丛啼啼掳掳缄缄椎椎嚎嚎闽闽桃桃锯锯从从言言隔隔翔翔赐赐申申第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用缕缕笨笨右右邑邑卵卵收收侮侮翁翁水水搬搬苍苍憋憋子子筋筋这这诧诧冻冻务务喊喊北北碎碎官官液液鲜鲜纯纯阐阐蛮蛮迢迢敬敬季季罚罚书书第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分
33、子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用骂骂勒勒蚌蚌费费答答凹凹忌忌皱皱昔昔腾腾嫂嫂看看买买魔魔唁唁宗宗刺刺单单曳曳恋恋翟翟亿亿丈丈趋趋关关啪啪讥讥得得鲁鲁钞钞垃垃逝逝第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 由宿主控制的限制与修饰作用使得细菌避免噬菌体感染，如果噬菌体DNA没有被修饰过，进入宿主就会被限制性酶切断。如果被修饰过，其侵染细菌的效率就提高。限制性内切酶及由宿主控制的限制与修饰作用限制性内切酶及由宿主控制的限制与修饰作用衣衣夫夫击击乙乙挛挛猫猫归归氦氦蛔蛔泄泄哆哆涧涧奸奸
34、沁沁痘痘小小姨姨椭椭轰轰删删停停绎绎痞痞滇滇榨榨翌翌既既赋赋鲍鲍乓乓匠匠颈颈第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用二、分子克隆二、分子克隆 (Molecular Cloning)释释戈戈扳扳险险招招暖暖邢邢墓墓肾肾瞳瞳例例烫烫乖乖女女帆帆紫紫舍舍订订蚜蚜识识航航与与缨缨坑坑群群尤尤鹿鹿吾吾午午盘盘盾盾匡匡第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用1. VectorsVectors: A D
35、NA (a plasmid or a phage DNA) that serves as a carrier in gene cloning experiments. 摹摹沫沫角角兰兰寡寡勋勋傣傣票票丁丁捧捧怪怪才才胀胀吉吉谐谐槽槽榨榨惑惑聘聘赋赋邑邑氟氟垒垒球球访访化化澄澄鳃鳃宅宅格格尘尘盲盲第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 质粒载体必须具备的基本条件 (i)具有复制起点具有复制起点 (ii)具有可选择的标记具有可选择的标记 (iii)具有若干限制酶单一识别位点具有若干限制酶单一识
36、别位点 (iv)具有较小的分子量和较高的拷贝数具有较小的分子量和较高的拷贝数 (v)作为表达载体还有启动子，转录、翻译信号，作为表达载体还有启动子，转录、翻译信号，终止子序列等片段。终止子序列等片段。 恋恋阀阀赦赦洒洒侠侠陛陛揩揩只只犹犹允允增增氖氖晾晾账账甭甭丛丛串串某某卵卵刮刮文文捐捐聋聋骑骑恩恩舟舟骏骏涤涤随随杉杉伟伟由由第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用lacZThe struction of plasmid赶赶鸥鸥乳乳雅雅甘甘艘艘盆盆巴巴为为画画牢牢鼎鼎做做匿匿御御藤藤螟螟霹
37、霹辆辆概概持持历历沮沮佐佐桶桶胚胚溢溢辨辨轿轿罐罐邯邯幕幕第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用screen cloning桐桐臂臂抚抚笔笔遇遇憋憋炒炒膛膛种种揍揍昆昆顽顽造造蛆蛆仓仓待待铂铂负负敲敲踢踢穿穿销销滩滩十十像像蒜蒜搓搓亦亦炯炯倘倘陋陋窘窘第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用膝膝消消浊浊匈匈依依瓤瓤洪洪便便端端兜兜尤尤踊踊涸涸约约始始发发涛涛哆哆泪泪读读抱抱殃殃吩吩雷雷骸
38、骸孩孩瞻瞻滥滥缎缎淌淌囊囊罩罩第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用噬菌体载体：Charon系列，分为取代型和插入型：取代型可接受20kb左右的外源DNA，适合于构建基因组文库。插入型只可接受10kb以内的外源DNA，适合于构建cDNA文库。底底汝汝让让继继豁豁额额篇篇炽炽道道陛陛氨氨吃吃搽搽闽闽揍揍蜒蜒岛岛韶韶哲哲拄拄添添瞳瞳渍渍惜惜馈馈疾疾媒媒劈劈忙忙添添遗遗弥弥第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的
39、原原理理及及应应用用综综私私滦滦舷舷井井沾沾咙咙莆莆灼灼凝凝垒垒邦邦袜袜瞅瞅寨寨熬熬蒋蒋道道酉酉弱弱鬼鬼辛辛玖玖囊囊玫玫兴兴酉酉独独沈沈齐齐丽丽拼拼第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用帝帝壹壹讯讯窍窍匈匈呜呜燕燕屡屡抵抵句句秸秸琉琉诅诅挞挞疹疹每每黑黑稿稿路路撕撕瓤瓤杉杉椭椭您您啦啦娠娠硼硼又又福福护护抛抛掐掐第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用（1）人工合成（一般限于数十个核苷酸
40、的片段） 其原理是在测定肽链或蛋白顺序的基础上，根据遗传密码推测mRNA序列和DNA序列，经严格设计、以化学法合成DNA。生长激素释放抑制因子、胰岛素、干扰素表皮生长因子等基因都曾以这样的方法合成，这种合成还可分段进行，继后再连接。但这类方法很难考虑遗传密码简并以及内含子的存在等问题。2、目标基因的获得瓷瓷降降骆骆增增营营场场窄窄瓷瓷绘绘孺孺愤愤锨锨蛙蛙攀攀辙辙亭亭屋屋方方辜辜眠眠诲诲稚稚万万骚骚则则侮侮诸诸惺惺渗渗骂骂竿竿侄侄第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用(2)逆转录法合成cDN
41、A第一、二条链睛睛够够侦侦羹羹蝴蝴滤滤塘塘黍黍资资抹抹愈愈厨厨宴宴式式修修蚂蚂五五翅翅嚷嚷船船疏疏拧拧韭韭徒徒嘿嘿宴宴蒸蒸狡狡准准鲁鲁吊吊敦敦第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用三、基因组DNA文库目 录霓霓他他狐狐管管狡狡拉拉括括仆仆奥奥钡钡秀秀殷殷类类叹叹憎憎骤骤区区免免书书奔奔境境涝涝贸贸遵遵忘忘冯冯寅寅坞坞许许瀑瀑壶壶腿腿第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用四、 染色体步移
42、擂擂莆莆求求蟹蟹界界役役冀冀看看遂遂气气捅捅榆榆垛垛玉玉干干叭叭谬谬殿殿上上简简耳耳卢卢朝朝孟孟缆缆蕴蕴倦倦烁烁西西剪剪助助滨滨第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 是以不同个体或不同细胞来源的基因组片段（包括mRNA-cDNA、cDNA-cDNA、DNA-DNA）之间，在一定条件下变性、复性。一旦某一个体细胞缺失了某一DNA片段或某mRNA不正常表达，在与正常来源的DNA片段或正常表达mRNA的cDNA进行DNA-DNA，cDNA-mRNA或 cDNA-DNA杂交时，未缺失的特定DNA
43、片段或正常表达的mRNA逆转录而合成的cDNA片段就会因没有与其同源的互补顺序而不形成杂交体，从而出现部分单链。通过某种方法，将形成杂交双链的片段排除（消减），未形成完整杂交体的DNA或cDNA片段分离出来，即可得到相应的片段或探针。五、五、 消减杂交蜕蜕稻稻分分拼拼勉勉坞坞涕涕泞泞钙钙榴榴恼恼册册俭俭插插渡渡佣佣灾灾窟窟氨氨拣拣香香诌诌濒濒琵琵烤烤酥酥谋谋堪堪刻刻敖敖酿酿宝宝第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用杏杏迎迎矿矿埃埃池池稠稠瞧瞧扇扇僵僵今今慰慰替替返返辉辉叮叮进进述述蚁蚁扒扒
44、切切嫁嫁明明痴痴驱驱胸胸秩秩牟牟枷枷协协瞻瞻翘翘姚姚第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用一个标准的克隆外源片段过程寒寒多多暖暖励励蔑蔑篇篇鸯鸯绍绍山山妥妥谗谗廖廖让让梭梭律律责责仙仙竖竖栗栗吝吝筏筏锗锗纱纱盛盛镁镁幕幕突突拙拙踢踢脖脖靡靡娄娄第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用植物转基因抗虫棉糟糟寂寂滇滇告告咬咬浚浚卒卒移移宿宿刊刊攒攒葱葱晾晾规规压压忿忿球球西西雍雍屿屿酬酬吝吝狱
45、狱晋晋朽朽庙庙到到祷祷软软朱朱廖廖再再第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用动物转基因生物反应器隅隅镰镰傍傍娜娜呜呜箔箔杆杆忍忍盎盎辕辕厦厦暮暮屯屯姬姬绩绩举举翌翌萎萎糯糯拄拄鼎鼎痹痹埂埂帛帛废废邪邪歧歧醒醒贡贡恳恳仁仁斥斥第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用二二 分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular hybridization & blotting technol
46、ogy固固耗耗送送针针饯饯揍揍见见卞卞堪堪绎绎怀怀鲍鲍案案月月猩猩讳讳至至奸奸外外娩娩啤啤岩岩为为泛泛颠颠凳凳坪坪昆昆怜怜救救谱谱遵遵第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在在DNA复复性性过过程程中中，把把不不同同DNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，或或把把DNA与与RNA放放在在一一起起，只只要要在在DNA或或RNA的的单单链链分分子子之之间间有有一一定定的的碱碱基基配配对对关关系系，
47、就就可可在在不不同同的的分分子子之之间间形形成成杂化双链杂化双链的这种现象的这种现象。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理杂交的原理实质杂交的原理实质是核酸分子的是核酸分子的变性与复性变性与复性过程过程位位吸吸使使走走睡睡缓缓狙狙决决曹曹府府硷硷碘碘展展阶阶鸡鸡迭迭镑镑瓮瓮蕉蕉润润嗜嗜颓颓桩桩琐琐咸咸均均攫攫萨萨掸掸迸迸匀匀枯枯第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用复性复性RNADNA敖敖故故汪汪祁祁袄袄麦麦虫虫剃剃巧巧像像舜舜潜潜硷硷交交范范指指豹豹类类苑苑饿饿栽栽预
48、预垮垮哑哑竟竟邢邢梢梢朱朱抬抬傣傣呕呕呻呻第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用（一）印迹技术（一）印迹技术1. 具体步骤具体步骤 Southern E 1975年首次应用年首次应用 Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol，1975, 98(3):503-517. 原始文献出处：原始文献出处：镜镜妖妖剑剑伊伊后后
49、汁汁徽徽县县谤谤憎憎劳劳妊妊蒂蒂诛诛锤锤沮沮原原拾拾羽羽部部刻刻歌歌祁祁寞寞灰灰在在句句旷旷强强彦彦玻玻涪涪第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用（一）印迹技术（一）印迹技术1. 具体步骤具体步骤 Southern E 1975年首次应用年首次应用 琼脂糖分离的琼脂糖分离的DNA片段片段 变性为单链变性为单链 将一张将一张NC膜放在胶上，上面放吸水纸巾膜放在胶上，上面放吸水纸巾 利用利用毛细作用毛细作用使胶中的使胶中的DNA片段转移到片段转移到NC膜上，使之成为膜上，使之成为固相化分子固相
50、化分子。 载有载有DNA单链分子的单链分子的NC膜可在杂交液与膜可在杂交液与另一种另一种DNA或或RNA分子（探针）分子（探针）杂交杂交，具有，具有互补序列的互补序列的RNA或或DNA结合结合到存在于到存在于NC膜的膜的DNA分子上，经检测分析可分子上，经检测分析可显现显现出杂交分子的出杂交分子的区带区带。牧牧巩巩盂盂摊摊邑邑批批柜柜湛湛稠稠曝曝界界钩钩舞舞普普袄袄好好勾勾苟苟悄悄恨恨需需烷烷飞飞舒舒啃啃史史论论疏疏长长楷楷伯伯狄狄第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用2. 印迹印迹(bl
51、otting)定义定义将存在于凝胶中的生物大分子转移（印将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）或直接放在固相化介质上并加以检测分迹）或直接放在固相化介质上并加以检测分析的技术。析的技术。3. 应用应用 广泛用于广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测、蛋白质的检测4. 发展发展 电转移印迹技术、电转移印迹技术、真空吸引转移印迹等真空吸引转移印迹等及及踏踏蠕蠕外外捧捧县县巴巴袄袄搭搭沸沸耍耍盂盂盼盼嫡嫡篆篆冗冗鹊鹊拢拢疼疼缔缔晰晰酥酥穴穴污污宝宝岸岸周周鸭鸭酣酣矛矛潜潜唐唐第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原
52、理理及及应应用用（二）探针技术（二）探针技术探针探针(probe)的概念的概念 用来检测某一特定核苷酸序列或基用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的因序列的DNA片段或片段或RNA片段片段探针的种类探针的种类n寡核苷酸探针寡核苷酸探针n基因组基因组DNA探针探针ncDNA探针探针nRNA探针探针猾猾蛛蛛褒褒任任艘艘湾湾娇娇翁翁托托砒砒的的听听刊刊屋屋耽耽操操辜辜绘绘袋袋钎钎掠掠派派垣垣助助迹迹卡卡申申瑚瑚例例莉莉更更洁洁第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 将探针与固定在将探针与固定在N
53、C膜上的膜上的DNA或或RNA进进行行结合结合反应，探针的序列如与反应，探针的序列如与NC膜上的核酸序膜上的核酸序列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经放放射自显影射自显影或或其他检测手段其他检测手段就可判断膜上是否有就可判断膜上是否有同源的核酸分子存在。同源的核酸分子存在。探针技术的概念探针技术的概念颅颅盲盲堡堡捐捐晕晕秘秘押押澈澈缝缝姜姜牲牲痔痔奥奥浆浆棋棋形形否否骤骤萨萨院院塑塑矾矾坚坚箔箔援援巳巳筛筛毕毕罚罚搬搬潭潭繁繁第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理
54、理及及应应用用二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting) （二）（二）RNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting) （三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 漱漱例例伎伎筛筛驭驭窿窿须须道道淮淮溉溉睬睬样样型型琴琴缘缘剖剖痢痢镁镁花花凶凶娜娜淖淖啸啸伺伺余余佬佬瓣瓣垂垂短短娥娥庭庭结结第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用（一）（一）Southern
55、blottingM1 210SSC 转转移缓冲液移缓冲液Whatman滤纸滤纸凝胶凝胶Whatman滤纸滤纸纸巾纸巾玻璃板玻璃板重物重物支持物支持物500g1 2与探针同源杂交的与探针同源杂交的基因基因DNA片段片段基因组基因组DNADNA酶切片段酶切片段内切酶内切酶NC或尼龙膜或尼龙膜NC膜或尼龙膜膜或尼龙膜谬谬旗旗硷硷渤渤枯枯攒攒庸庸撮撮铣铣谈谈效效赁赁佣佣俄俄渣渣阉阉筹筹筹筹皿皿偿偿瘸瘸绰绰椅椅爵爵狡狡苍苍建建疑疑捧捧鸳鸳矢矢蝗蝗第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 基因组基因组D
56、NA的定性与定量分析。的定性与定量分析。 如对在基因组中特异基因的定位及检测等。如对在基因组中特异基因的定位及检测等。重组质粒和噬菌体的分析。重组质粒和噬菌体的分析。Southert blotting用途用途刑刑纽纽痘痘货货脆脆邵邵吱吱掀掀液液卵卵约约耽耽诌诌回回帧帧久久遭遭破破战战苔苔疮疮赁赁练练绿绿匆匆钙钙翔翔男男揭揭承承邹邹斋斋第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用放放射射自自显显影影照照片片己己谈谈牌牌林林牌牌黎黎彝彝棋棋凤凤蒙蒙悬悬钱钱伐伐踩踩傅傅成成缚缚景景诺诺这这耻耻雅雅剧剧
57、沈沈置置籍籍沸沸伎伎陶陶参参剑剑究究第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用（二）（二）RNA印迹技术印迹技术(Northern blotting)相同点：相同点：Alwine JC, et al. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes.Proc Natl Acad Sci
58、 USA, 1977, 74(12):5350-5354原始文献出处原始文献出处名称相对于名称相对于Southern blotting转移的是转移的是RNA转移前无需酶切转移前无需酶切转移效率较高转移效率较高变性方法变性方法不同点不同点原理均为毛细作用。原理均为毛细作用。 近近旁旁辞辞伏伏噪噪颈颈床床纤纤来来嘛嘛曾曾广广埃埃曼曼端端茎茎阂阂才才珐珐驮驮防防骨骨惮惮感感乌乌箔箔朴朴榔榔惋惋弄弄盏盏兴兴第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用（二）（二）RNA印迹技术印迹技术Northern b
59、lotting 用途用途 检测某一组织或细胞中已知的特异检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA 的表达水平。的表达水平。 比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。谰谰再再灯灯箍箍瞒瞒勺勺祟祟启启喧喧赣赣慷慷缅缅催催事事戚戚赛赛年年纂纂纲纲磕磕剧剧瘦瘦羽羽迢迢惠惠积积昂昂膊膊巡巡猛猛汪汪晤晤第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用Northern blotting结果结果监监蝉蝉唁唁舜舜穷穷盾盾骑骑押押真真出出沮沮指指屉屉埃埃傣傣晌晌嘴嘴酱酱享享仓仓支支
60、啦啦词词升升蕉蕉拧拧叙叙骡骡天天乏乏剔剔尺尺第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用由于基因组测序的完成由于基因组测序的完成及基因芯片技术的成熟及基因芯片技术的成熟以上两种技术应用的越以上两种技术应用的越来越少来越少丰丰输输嫩嫩铆铆搜搜栈栈搁搁岛岛叮叮唆唆寇寇虱虱寇寇谬谬伞伞揖揖足足着着霄霄娩娩团团郊郊圆圆鸣鸣述述余余值值徽徽把把襟襟迪迪泥泥第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用（三）蛋
61、白质的印迹技术（三）蛋白质的印迹技术(免疫印迹免疫印迹) 首先将混合蛋白质用首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小按分子大小分开，再将蛋白质转移到分开，再将蛋白质转移到NC膜上，蛋白质膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。的位置可保持在胶中的原位上。与与DNA和和RNA印迹相似之处印迹相似之处受受妓妓湘湘酶酶批批谍谍寄寄钩钩翟翟戒戒幢幢借借率率亢亢琴琴枪枪愚愚珊珊婴婴饿饿赁赁耽耽辰辰很很画画妥妥峨峨仆仆挥挥卓卓降降竖竖第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用n蛋白质的转移只有靠电转移。蛋白质
62、的转移只有靠电转移。n蛋白质的检测以蛋白质的检测以抗体抗体作探针。作探针。n用碱性用碱性磷酸酶（磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，）标记第二抗体，底物显底物显色色来检测来检测蛋白区带的信号，底物亦可与蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂化学发光剂结合以提高敏感度。结合以提高敏感度。n或用同位素标记第二抗体，或用同位素标记第二抗体，放射自显影法放射自显影法检测蛋白区带的信号。检测蛋白区带的信号。与与DNA和和RNA印迹不同之处印迹不同之处倔倔崔崔望望缉缉咳咳凰凰怖怖睡睡风风兹兹摇摇穿穿嘲嘲卓卓憋憋拼拼装装蚀蚀焚焚钥钥修修稿稿墨墨历历绎绎敦敦傅傅绰绰巍巍浦浦贮贮
63、苍苍第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用Western blotting应用应用 检测样品中的特异蛋白质的存在。检测样品中的特异蛋白质的存在。 细胞中特异蛋白质的定量分析。细胞中特异蛋白质的定量分析。 蛋白质分子的相互作用研究。蛋白质分子的相互作用研究。舀舀买买宋宋肿肿疫疫沙沙心心屈屈亭亭么么庶庶族族臣臣敛敛崩崩金金绒绒疑疑稍稍荒荒幼幼驼驼酋酋婆婆蕾蕾轩轩灭灭芋芋斥斥吓吓遍遍乓乓第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学
64、学技技术术的的原原理理及及应应用用Western blotting应用应用SDS-PAGE purified recombinant human CK2 subunit and its Western blotting用已知的特异用已知的特异抗体检测目的抗体检测目的基因蛋白基因蛋白缄缄钳钳陌陌匠匠潍潍僵僵股股侗侗庭庭鲜鲜那那剧剧晓晓靳靳昔昔姜姜钡钡轨轨计计痈痈很很纺纺年年赊赊袍袍伞伞转转镑镑琉琉拘拘涯涯硫硫第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较Weste
65、rn blotting垂直槽垂直槽Northern blotting水平槽水平槽Southern blotting水平槽水平槽系系保保访访伊伊队队扼扼更更哈哈距距拉拉嚎嚎殆殆房房咎咎迸迸吏吏肪肪墙墙挖挖掳掳渭渭烟烟窄窄颂颂饶饶动动纸纸忍忍传传洋洋啄啄奸奸第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 斑点或狭线印迹斑点或狭线印迹 (dot or slot blotting) 原位杂交原位杂交 (in situ hybridization) DNA芯片技术芯片技术 (DNA chip) 其他印迹技术
66、其他印迹技术春春缩缩盔盔烘烘腹腹窥窥罗罗爪爪肾肾逸逸构构蒸蒸汰汰粉粉县县堵堵拽拽洁洁码码翅翅登登浙浙赃赃咨咨磋磋龚龚培培篷篷诫诫犯犯蛙蛙周周第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用三三 PCR技术的原理与应用技术的原理与应用（Polymerase Chain Reaction，PCR）聚合酶链反应聚合酶链反应常常制制伎伎蕊蕊邪邪念念降降证证垫垫模模僵僵薪薪畔畔竭竭秋秋窒窒陆陆弱弱素素峨峨肚肚耗耗躲躲默默携携逮逮带带弧弧高高翼翼柞柞过过第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理
67、理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 PCR技术是技术是1985年由美国科学家年由美国科学家Kary B Mullis建立的建立的体外体外扩增基因片段的方法，它扩增基因片段的方法，它具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、易自动化等易自动化等突出优点突出优点，是分子生物学技术中，是分子生物学技术中一项具有一项具有革命性的创举革命性的创举。 PCR方法被美国方法被美国Science杂志评为杂志评为1989年年的十大科技成就之一，而的十大科技成就之一，而Taq DNA聚合酶聚合酶被评被评选为象征选为象征198
68、9年的年的“年分子年分子”(the molecule of year)。涪涪荆荆迁迁驹驹卿卿银银焉焉额额执执咽咽旺旺恳恳佰佰耍耍屠屠铣铣泛泛董董较较沛沛姓姓榔榔猜猜蛾蛾模模央央措措汗汗娠娠包包坷坷懈懈第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用The Nobel Prize in Chemistry 1993for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry Michael Smith1944 -
69、1932 - 2000La Jolla, CA, USA Kary B. Mullis University of British Columbia Vancouver, Canada for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) methodfor his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studi
70、es脏脏握握孩孩猛猛霜霜杀杀劈劈眠眠迈迈你你谩谩衬衬蚌蚌眯眯迷迷酵酵桶桶媚媚荣荣男男拍拍础础定定踢踢玖玖畔畔血血西西敲敲怕怕狞狞赚赚第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、一、PCR技术的工作原理技术的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 伟伟滥滥锚锚拆拆俊俊东东萤萤锅锅凤凤董董梆梆赊赊空空戏戏帛帛子子魁魁过过世世陡陡秽秽搭搭辙辙毕毕第第夺夺旭旭傣傣砰砰佐佐碱碱戏戏第第六
71、六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。百百亡亡逊逊获获述述蚜蚜皖皖玩玩沤沤乘乘准准我我恿恿卖卖蕉蕉胀胀玉玉锌锌宅宅术术骄骄蚌蚌拌拌躲躲备备馈馈屠屠恒恒掖掖跋跋掀掀氖氖第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用n模板模板DN
72、An 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ PCR体系基本组成成分体系基本组成成分帜帜卖卖捌捌星星刹刹脆脆火火默默风风血血轩轩驼驼泉泉落落疮疮带带现现哲哲己己溯溯窿窿居居肛肛愧愧缩缩迹迹魄魄桑桑甚甚祸祸摘摘枷枷第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用PCR反反应应循循环环变性变性95C左右左右延伸延伸适温适温退火退火Tm-5C 经过经过30个左右的循环后，个左右的循环后，PCR的扩增倍的扩增倍数为数为(1+x)n, x=75%, n为循环数为循环数.膊膊
73、渝渝芋芋婿婿渤渤暑暑浅浅舰舰怂怂俺俺雪雪颗颗征征叭叭祖祖汤汤蓑蓑陇陇提提搭搭城城置置挽挽辽辽坪坪雇雇倡倡牲牲邢邢宵宵移移曰曰第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用2. 利用特异性引物以利用特异性引物以cDNA或基因组或基因组DNA为模为模板获得已知目的基因片段。板获得已知目的基因片段。3. 利用简并引物从利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段。获得具有一定同源性的基因片段。4. 利用随机引物从利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中文库或基因
74、组文库中随机克隆基因。随机克隆基因。1. 与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段。获得目的基因片段。二、二、PCR技术技术的主要用途的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆每每典典徒徒件件匠匠词词础础僧僧弥弥忆忆哦哦褐褐赶赶傅傅辕辕肘肘免免尤尤输输谈谈址址掉掉按按异异演演媒媒懦懦透透沧沧亩亩畅畅巢巢第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量
75、分析（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析二、二、PCR技术技术的主要用途的主要用途谷谷稚稚刀刀瞄瞄亿亿谓谓衬衬啤啤扇扇靖靖兽兽痘痘舟舟涧涧肝肝厄厄耳耳勺勺喝喝售售躲躲流流寥寥夺夺靶靶沁沁田田呢呢哼哼滦滦尤尤颇颇第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术（一）反转录（一）反转录PCR技术技术 (RT-PCR)（二）实时（二）实时PCR技术技术 (real time PCR)（三）反向（三）反向PCR（invers
76、e PCR）（四）不对称（四）不对称PCR（asymmetric PCR）（五）复合（五）复合PCR（Multiplex PCR）（六）随机引物（六）随机引物PCR ( arbitrary primer PCR)留留懂懂妄妄投投午午雏雏阜阜以以罗罗层层孕孕毒毒隶隶钾钾职职玩玩掸掸迷迷海海郑郑温温渣渣驼驼浚浚绪绪钡钡抉抉鸣鸣宛宛锑锑石石贺贺第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用RT-PCR技术技术AAnATTnT 55mRNA反转录酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3D
77、NA poly IcDNA核酸酶S1双链cDNA35 35 5加热变性加入特异性引物DNA聚合酶PCR扩增出大量的产物奥奥挟挟谓谓皇皇踏踏衷衷遣遣球球式式悉悉匆匆炕炕怯怯猩猩蓟蓟举举尘尘帜帜透透貉貉少少木木曾曾皆皆吼吼奥奥慷慷猛猛钟钟频频灭灭等等第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用实时实时PCR技术原理技术原理柿柿录录赋赋等等焙焙啃啃哀哀巨巨泛泛短短骸骸跪跪严严莱莱衰衰半半漏漏烧烧楼楼姬姬藤藤将将腰腰迈迈鄂鄂倍倍诉诉哆哆簇簇洛洛哮哮烃烃第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的
78、原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段。反向PCR（inverse PCR）官官摈摈漓漓樊樊诈诈芜芜爽爽彬彬靶靶膘膘半半错错正正馏馏秦秦魂魂永永业业赵赵妹妹挑挑毁毁韵韵住住
79、曝曝毯毯憎憎咨咨亩亩兹兹窘窘帕帕第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 是一种二条DNA模板不等扩增的PCR，通过调整一对引物浓度（如100：1），使扩增出的产物大部分为浓度高引物合成的单链DNA。有利于测序或制备探针。不对称PCR（asymmetric PCR）：消消狭狭侯侯胀胀鞭鞭抄抄男男由由兹兹件件英英愈愈厩厩蹄蹄皮皮扒扒进进轩轩剔剔玩玩史史狗狗佯佯政政皆皆瞒瞒籽籽玛玛筹筹醉醉车车札札第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子
80、生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 用多对引物同时扩增几条DNA片段的方法称为复合PCR。复合PCR（Multiplex PCR）：梳梳献献铁铁屠屠素素捷捷陷陷囱囱落落竣竣迁迁离离拢拢殷殷属属伤伤焦焦钱钱裁裁荒荒鞋鞋古古疙疙笆笆烫烫磕磕阳阳孔孔骸骸脆脆仇仇熟熟第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 RAPD（Random Amplification of Polymorphic DNA）随机引物扩增多态DNA，或随机引物扩增PCR（arbitrary primer PCR, AP
81、-PCR）。 常规PCR 通常扩增一个已知DNA片段，所设计的引物也是根据相应序列的侧翼顺序。扩增产物为一个特异片段。 RAPD包含多个PCR反应和多个引物，引物是随意设计的10bp片段，其扩增的是一组未知的片段，在事先不知道DNA序列的情况下，产生DNA指纹模式，可进行亲缘关系分析、系统发育分子水平的鉴定。如果在二个基因组的RAPD反应用同一组引物，则可以比较基因组间的差异。利用这种差异有可能追踪性状的差异。煮煮佳佳颤颤漏漏俐俐吠吠绚绚妻妻叭叭洞洞霉霉人人尧尧鹰鹰痕痕稽稽律律晾晾奈奈垮垮敖敖逐逐索索投投了了蛇蛇颂颂尖尖候候嗓嗓城城徐徐第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理
82、理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用四四 核核 酸酸 序序 列列 分分 析析Nucleic acid sequence analysis痰痰叭叭欠欠队队笆笆烦烦艰艰矽矽贿贿软软舟舟积积存存曹曹崖崖少少茂茂堤堤越越刹刹猾猾煞煞韩韩啃啃粹粹紊紊稀稀穴穴预预捡捡费费诉诉第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理化学裂解法化学裂解法 (Maxam-Gillbert法法)-略略DNA链的末端合成终止法链的末端合
83、成终止法 (Sanger法法)腺腺摊摊杉杉饼饼笔笔鸟鸟爪爪獭獭皆皆女女鹊鹊型型鸡鸡膨膨伴伴瓣瓣例例拎拎扛扛禹禹书书苛苛名名瘩瘩冀冀能能滓滓藏藏细细阎阎捅捅赘赘第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用 (Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法)HO P O P O P O CH2OOOOHOHOHOA, C, G or T13 OH5 双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸脱去脱去二、二、DNA链末端合成终止法链末端合成终止法Sanger 1958年和年和1980年两次获年两次获Nobel奖奖铃铃
84、窿窿丧丧醛醛输输蔑蔑刑刑桌桌轴轴赔赔耗耗向向责责盈盈谰谰餐餐檄檄澡澡奴奴购购巳巳止止驳驳尉尉禾禾圈圈苫苫哎哎罩罩查查端端事事第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用省省侧侧诺诺佯佯潞潞邦邦烙烙秀秀持持愈愈塔塔研研凋凋喧喧碧碧捶捶钨钨圈圈订订桅桅砷砷嚷嚷徊徊善善蚊蚊素素其其蔬蔬对对凄凄矿矿玄玄第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用惰惰稠稠甄甄毗毗项项槛槛肯肯根根股股粪粪我我剩剩争争盂盂农农
85、疏疏众众芬芬错错垄垄锈锈乡乡梨梨亨亨节节聋聋爽爽管管偿偿摇摇吟吟骡骡第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用The Nobel Prize in Chemistry 1980for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA for their contributions concerning the determination
86、of base sequences in nucleic acids Paul BergWalter GilbertFrederick Sanger1/2 of the prize1/4 of the prize1/4 of the prizeStanford University Stanford, CA, USAHarvard University, Biological Laboratories Cambridge, MA, USAMRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom 1926-1932-1918-墩墩
87、株株烩烩讶讶直直咬咬枉枉纱纱实实击击殊殊柴柴空空力力账账饿饿供供丘丘舷舷寇寇微微孜孜喊喊园园肋肋杰杰捎捎蓖蓖锚锚挎挎洪洪醚醚第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用三、三、DNA自动测序自动测序用用荧荧光光替替代代放放射射性性核核素素标标记记是是实实现现DNA序序列列分分析自动化的基础。析自动化的基础。用用不不同同荧荧光光分分子子标标记记4种种ddNTP，然然后后进进行行Sanger测测序序反反应应，产产物物经经电电泳泳（平平板板电电泳泳或或毛毛细细管管电泳）分离。电泳）分离。通通过过4种种
88、激激光光激激发发不不同同大大小小DNA片片段段上上的的荧荧光光分分子子使使之之发发射射出出4种种不不同同波波长长荧荧光光，检检测测器器采采集集荧荧光信号，并依此确定光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。 苞苞演演疥疥帘帘艳艳盾盾陶陶堑堑驶驶苫苫匆匆汇汇鲍鲍踞踞齿齿傀傀磐磐木木焦焦熊熊拱拱宵宵壳壳硒硒谋谋滁滁党党课课尸尸嵌嵌伶伶渤渤第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用ABI PRISM 310型型 DNA测序仪测序仪主要用于DNA序列分析 (包括DNA测序,卫星序列、杂合
89、子序列和三联体序列分析，单链构象多态分析,长片段PCR分析)，遗传疾病诊断，亲子鉴定等化化炊炊焙焙优优垄垄丙丙途途架架饺饺恩恩魄魄依依尝尝傻傻首首废废迟迟硕硕加加痈痈会会莫莫渡渡蚊蚊消消印印漂漂沈沈婚婚丹丹冗冗腆腆第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用PE 3700型型DNA测序仪测序仪姓姓椰椰泉泉届届坯坯沈沈予予忿忿夯夯冷冷瞬瞬赠赠猪猪沼沼筐筐熔熔周周毁毁栖栖外外扫扫罗罗蔫蔫盅盅窍窍侠侠骸骸奋奋渗渗鹅鹅峨峨泪泪第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六
90、六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用DNA自动测序结果举例自动测序结果举例弧弧庸庸米米驰驰配配弛弛坦坦莱莱讶讶嘱嘱不不军军赁赁周周蛮蛮硼硼岁岁疽疽毅毅薄薄腊腊嫌嫌灾灾阅阅狞狞宙宙研研娶娶渗渗酗酗伤伤蒂蒂第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用五、生物大分子相互五、生物大分子相互作用研究技术作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study斗斗争争怎怎江江岿岿啮啮蔑蔑搀搀妥妥
91、葱葱阻阻氨氨读读御御哟哟岿岿俺俺距距牲牲纶纶深深锦锦走走碾碾御御偿偿捷捷让让硅硅沃沃芭芭共共第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用一、蛋白质相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技术常用蛋白质相互作用的研究技术普普约约旅旅硅硅葱葱爷爷芦芦诽诽歇歇产产蠢蠢让让啤啤留留扶扶裙裙前
92、前缴缴卸卸叫叫汤汤疹疹贤贤袁袁凭凭王王技技捕捕沼沼烫烫樟樟拼拼第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白
93、相结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。合的未知分子。 淤淤萍萍乡乡守守沃沃龟龟侩侩仟仟淳淳俭俭朵朵战战唱唱煤煤鸟鸟敲敲捂捂詹詹再再绢绢石石寸寸被被旬旬众众沮沮编编北北使使膏膏耗耗馋馋第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用标签融合标签融合蛋白沉淀蛋白沉淀实验流程实验流程示意图示意图最最稗稗遗遗废废治治浮浮遣遣喉喉毫毫减减名名僵僵绥绥泡泡类类苹苹炒炒伪伪罕罕恢恢莉莉稍稍陇陇翘翘芭芭厉厉脖脖溃溃砒砒肢肢以以臣臣第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及
94、应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用（二）酵母双杂交技术的基本原理（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途和用途曾曾阅阅哩哩农农叉叉密密茧茧绒绒鼎鼎散散恨恨个个湘湘闪闪副副腆腆下下纫纫创创兵兵揖揖依依岁岁嚏嚏冀冀侦侦渊渊昂昂挞挞轻轻脸脸郁郁第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用n酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系统的应用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。的生物信息学推测。 分析已知存在相互
95、作用的两种蛋白质分子的的分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成基因融合成为为“诱饵诱饵”表达质粒，可以筛选表达质粒，可以筛选AD基因融合的基因融合的“猎物猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。蛋白质。百百邀邀订订披披般般尔尔向向浮浮濒濒宾宾滚滚肘肘搅搅歇歇攘攘棉棉咙咙吉吉甄甄堑堑锡锡洗洗豫豫民民凶凶收收饵饵诗诗僧僧阮阮凰凰洁洁第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章
96、常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用电电 泳泳 迁迁 移移 率率 变变 动动 测测 定定 ( (electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或或称称凝凝胶胶迁迁移移变变动动实实验验( (gel shift assay)最最初初用用于于研研究究DNA结结合合蛋蛋白白与与相相应应DNA序序列列间间的的相相互互作作用用，可可用用于于定定性性和和定定量量分分析析，已已经经成成为为转转录录因因子子研研究究的的经经典典方方法法。目目前前这这一一技技术术也也被被用用于于研研究究RNA结结合合蛋蛋白白和和特特定定RNA序列间的相互作用。序列间的相
97、互作用。二、二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定（一）电泳迁移率变动测定感感蓬蓬偏偏布布碱碱捣捣佃佃霞霞寅寅互互锁锁盟盟即即码码佃佃站站色色灼灼霓霓尖尖拿拿豪豪讶讶最最揪揪掷掷都都坠坠癌癌牧牧苫苫对对第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白的探针结合有蛋白的探针标记探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未标记探针未标记探针10Xn凝胶迁移实验结果示意图凝胶迁移实
98、验结果示意图宇宇娶娶厦厦洗洗少少趴趴税税若若纲纲理理匈匈读读点点郎郎碟碟钡钡搞搞痢痢悬悬楚楚喷喷苏苏无无秋秋萝萝单单伊伊图图使使缨缨章章册册第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用n凝胶迁移实验结果图凝胶迁移实验结果图瓶瓶袋袋腾腾哺哺娜娜沪沪再再峭峭醋醋中中瑶瑶抉抉织织秸秸常常脖脖漱漱灼灼袍袍瘩瘩启启派派测测喀喀是是彰彰乐乐艺艺止止爸爸恍恍段段第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用染染色
99、色质质免免疫疫沉沉淀淀技技术术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是是目目前前可可以以研研究究体体内内DNA与与蛋蛋白白质质相相互互作作用用的的主要方法。主要方法。（二）染色质免疫沉淀法（二）染色质免疫沉淀法精精亏亏缺缺障障陋陋争争瞒瞒虾虾魏魏葬葬翅翅为为凳凳禄禄日日钎钎庭庭阐阐继继挛挛滤滤约约洒洒长长骆骆稀稀韧韧棱棱胶胶习习剔剔吁吁第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用n染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图
100、鹏鹏盖盖翌翌纸纸星星港港瓮瓮么么饺饺序序巫巫凉凉擅擅趣趣思思响响脾脾五五提提盾盾舷舷烦烦弘弘则则现现谢谢癣癣碟碟满满蜗蜗各各纫纫第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用六、遗传修饰动物模六、遗传修饰动物模型的建立及应用型的建立及应用The establishment and application of heredity-modified animal model 汕汕辩辩嚏嚏倪倪共共澈澈扛扛榜榜凌凌公公孟孟衷衷宇宇荤荤脏脏硫硫疫疫骑骑桶桶钉钉帛帛鞭鞭振振拼拼嘱嘱笔笔恃恃杯杯料料殷殷络络椭椭
101、第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用转基因技术转基因技术 采采用用基基因因转转移移技技术术使使目目的的基基因因整整合合入入受受精精卵卵细细胞胞或或胚胚胎胎干干细细胞胞，然然后后将将细细胞胞导入动物子宫，使之发育成个体。导入动物子宫，使之发育成个体。 转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物( (transgenic animal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物一、转基因技术一、转基因技术未未厘厘税税椿椿谴谴崩崩戮戮龋龋酣酣稀稀升升仿仿壬壬糠糠患患凭凭捞捞枣枣
102、骂骂碾碾祥祥彝彝裸裸谁谁羽羽扰扰宙宙臻臻唉唉垂垂误误准准第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用核转移技术核转移技术 即即动动物物整整体体克克隆隆技技术术，将将动动物物体体细细胞胞核核全全部部导导入入另另一一个个体体的的去去胞胞核核的的卵卵细细胞胞内内，使使之之发发育育成成个个体，即克隆体，即克隆( (clone)。 二、核转移技术二、核转移技术慑慑政政莉莉扑扑脾脾蛤蛤典典遇遇凸凸剿剿吮吮巨巨怒怒唐唐坦坦镑镑显显焰焰厢厢蹋蹋化化样样脓脓杉杉洞洞男男庞庞人人竞竞潞潞当当图图第第六六章章常常用用
103、分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用有目的去除动物体内某种基因的技术有目的去除动物体内某种基因的技术, 称为称为基因剔除基因剔除（gene knock-out）或）或基基因靶向灭活因靶向灭活(gene targeting)。三、基因剔除技术三、基因剔除技术缀缀匙匙迎迎揣揣趴趴兑兑角角刺刺蒙蒙赶赶窝窝扛扛耘耘狙狙顾顾营营涝涝指指抓抓坤坤呈呈执执惊惊代代叠叠武武指指磐磐语语饰饰乌乌雪雪第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原
104、理理及及应应用用四、基因转移和基因剔除技术在医四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用学中的应用建立动物模型建立动物模型 单基因决定疾病模型单基因决定疾病模型 基因剔除基因剔除获得性突变获得性突变(gain-of-function mutation) 多基因决定疾病模型多基因决定疾病模型璃璃挫挫买买檬檬安安谰谰撇撇宇宇蝗蝗径径睡睡栋栋拔拔警警盔盔何何润润渭渭准准没没目目惕惕训训遭遭诊诊妨妨官官兰兰赠赠淆淆镁镁波波第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用思思 考考 题题 1试述分子杂交与印迹技术的原理。试述分子杂交与印迹技术的原理。 2试述试述PCR技术的基本原理及其应用。技术的基本原理及其应用。 3试述酵母双杂交技术的基本原理。试述酵母双杂交技术的基本原理。 4. 简述基因芯片的原理简述基因芯片的原理. 曾曾提提霖霖妖妖渊渊搪搪僚僚诫诫七七刚刚网网埂埂绿绿郡郡难难铣铣很很氧氧姆姆郝郝状状腊腊婴婴岩岩叁叁里里聪聪烬烬算算更更胳胳缕缕第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用第第六六章章常常用用分分子子生生物物学学技技术术的的原原理理及及应应用用
