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1、第8章 酶学概论酶(enzyme) 核酶(ribozyme) 脱氧核酶(deoxyribozyme)（一）、酶的定义 酶是生物体活细胞产生的具有特殊催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质及核酸。酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的生物催化剂。 一、 酶的定义和认识过程enzyme是希腊文是希腊文 en = in ， zyme = yeast二二. . 酶是催化剂酶是催化剂 1、与一般催化剂的共性与一般催化剂的共性催化效率高，用量少（细胞中含量低)。加快反应速度但不改变化学反应平衡点（不改变平衡常数）。只加快正反应速度吗？降低反应活化能。（只降低正反应活化能吗？）活化能：在一定的
2、温度下，1mol分子全部进入其活化态所需要的自由能。反应前后自身结构不变。Enzymes DO NOT Alter the Equilibrium Constant 自由能自由能变化变化（G）- - 非催化反应非催化反应活化能活化能 酶促反应酶促反应 活化能活化能 一般催化剂催一般催化剂催化反应的化反应的活化能活化能 自自由由能能反反 应应 过过 程程 底物 产物 正V 10 100逆V 5 50酶酶只加快正反应速度吗 ？G= -RTlnKeq 产物和底物由能差产物和底物由能差 思考题1. 酶的催化效果是由于（ ） A.增加反应底物和产物的自由能差 B. 降低反应底物和产物的自由能差 C. 减
3、少反应所需的能量 D. 增加反应所需的能量 2. 关于酶的陈述正确的是（ ） A. 酶的浓度必需和底物的浓度一致才有催化效果 B. 增加了反应的平衡常数，因此有利于反应 C. 酶加快了底物向产物转化的速率 D. 酶确保把全部底物转化为产物 E. 酶确保产物比底物更好的热稳定性 F. 酶可以降低底物向产物转化的活化能 G. 酶在反应过程中会被消耗。单选或多选2010浙江大学生物化学2009，2010浙江大学生物化学3. 是非题 酶可以降低生化反应的活化能，因此可以改变反应的平衡常数。中山大学2008,2012年生物化学思考题O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶Removes the methyl grou
4、p. The methyl group is transferred to the protein itself, inactivating the protein.下册下册P4292. .酶作为生物催化剂的特性酶作为生物催化剂的特性 （1）酶易失活：酶的敏感性 常温、常压，中性pH环境。（2）、催化效率更高（高效性） 酶催化反应速度是相应的无催化反应的108-1020倍，并且高出非酶催化反应速度至少几个数量级。转换数转换数（turnover number, TN ，等于催化常数等于催化常数 kcat） 一级反应速率常数一级反应速率常数,催化常数催化常数 酶被饱和时，每秒钟，每个酶分子转换底物
5、的分子数(微摩尔数），或每秒钟每摩尔酶转换底物的摩尔数(微摩尔数）。 Vmax = Kcat E思考题1. 名词解释名词解释： 催化常数(catalytic number)(Kcat) 苏州大学苏州大学2007年生物化学年生物化学 酶催化剂的特点酶催化剂的特点( (续续) )（3）专一性高 是酶对底物的一种选择性 是酶和一般催化剂最重要的差别最重要的差别 决定于酶活性中心的结合部位或全酶的脱辅酶部分酶催化剂的特点酶催化剂的特点(续续)（4） 活性可调节(调节活性或酶量） 调节酶的浓度；激素调节酶活性；反馈调节；抑制剂和激活剂：一些蛋白质可作抑制剂：豆类中的胰蛋白酶抑制剂，鸡蛋里面的抗生物素蛋白
6、；其它调节方式：别构调节、酶的共价修饰酶催化剂的特点(续)抗生物素抗生物素蛋白与生物素生物素 1 ) 丙酮酸羧化酶 2 ) 乙酰CoA羧化酶 3 ) 丙酰CoA羧化酶生物素生物素思 考常吃生鸡蛋有害身体健康，说明其中的原因？ 解析：因为生物素可作为羧化酶的辅酶。生鸡蛋的蛋清中含有抗生生物物素素蛋蛋白白质质（因子），它能抑制脂肪酸酸合成的限速酶，即乙酰辅酶A羧化酶的活性，因为该酶需要生物素作为辅助因子。如果细胞内脂肪酸合成受阻，会导致乙酰辅酶A积累，从而转而生成酮体，产生轻度酮酮体体症。当抗生物素因子被降解后或排出后，一切恢复正常。另外，在糖异生过程中，生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，丙酮酸羧化酶催
7、化糖异生的第一个反应，即丙酮酸生成草酰乙酸的反应。由于抗生物素因子可与生物素特异性高效结合，从而会阻断糖异生的过程。 三、酶的化学本质及其组成三、酶的化学本质及其组成（一）酶的化学本质：（一）酶的化学本质：绝大多数酶是蛋白质证据 （1）酸水解的产物是氨基酸，能被蛋白酶水解失活； （2）具有蛋白质的一切共性，凡是能使蛋白质变性的因素都能使酶变性；（具有蛋白质的颜色反应）。 少数酶是RNA（核酶：ribozyme ）(1) 80年代初,Thomas Cech 四膜虫L19RNA具有生物催化功能,催化rRNA前体的剪接(2) 1983年 Altman和Pace E.Coli RNase P中的RNA
8、具有加工tRNA前体的催化功能（二）酶的化学组成据酶分子组成分类单纯蛋白质酶类 (simple enzyme)：结合蛋白质酶类酶蛋白辅助因子金属离子小分子有机物（脱辅酶)）（1）单纯蛋白质酶 ：多肽链除了氨基酸不含任何其他化学 物质如胰脏的核糖核酸酶、淀粉酶等、脲酶、脂肪酶。（2）结合蛋白质酶： 蛋白质部分和非蛋白质部分组成，结 合蛋白质酶的蛋白质部分称为脱辅酶，非蛋白质部分称 为辅因子。脱辅酶与辅因子结合后形成的复合物称为 “全酶”(conjugated enzyme):辅酶(coenzyme)：与酶蛋白结合较松，可透析或超过 滤除去。（例如：NAD NADP）辅基(prosthetic g
9、roup)：与酶蛋白结合较紧。不可 透析或超过滤除去（FAD）辅助因子酶的化学组成酶蛋白酶蛋白：决定反应的专一性和催化机制：量多辅助因子辅助因子：传递电子、原子或某些化学基团的作 用，决定酶促反应的类型和反应的性质：量少全酶 一种酶蛋白一般只与一种辅助因子结合同种辅助因子可与不同的酶蛋白结合为什么必须将丙酮酸还原为乳酸为什么必须将丙酮酸还原为乳酸 ？Why should NAD+ be recycled?全酶才有催化活性v 酶蛋白或辅助因子单独存在时都不具有活性，只有两者结合 组成全酶才有催化活性。一种酶蛋白只能与一种辅助因子结合成一种特异的酶，而一种辅助因子可以与多种酶蛋白结合成不同的特异酶
10、。 辅助因子n 金属离子: 金属酶: 金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。 金属激活酶: 金属离子与酶结合得疏松。金属离子的作用：a.传递电子； b. 在酶与底物之间起连接作用； c. 维持酶分子的活性构象； d. 中和阴离子。 某些维生素与辅酶名称别名辅酶主要生理功能维生素B1硫胺素TPP参与-酮酸氧化脱羧维生素B2核黄素FMN、FAD氢载体泛酸遍多酸HSCoA酰基载体维生素PP尼克酸和尼克酰胺NAD+、NADP +氢载体维生素B6吡哆醛、 吡哆胺 磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺参与AA转氨、脱羧生物素维生素H羧化酶的辅酶叶酸THFA一碳基团载体维生素C抗坏血酸氧化还原作用硫辛酸酰基载体、氢载
11、体2009浙江大学生物化学名词解释: HS CoA1、单体酶：由一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子 牛胰RNase 124 a.a 单链 鸡卵清溶菌酶 129 a.a 单链 胰凝乳蛋白酶 三条肽链单体酶寡聚酶多酶复合体多酶融合体按亚基组成（一）酶的分类四、酶的命名和分类2、寡聚酶：由多个相同或不同亚基以非共价键连接的酶 亚基之间以非共价键结合。 含相同亚基的寡聚酶：苹果酸脱氢酶（鼠肝）2个 含不同亚基的寡聚酶：乳酸脱氢酶 4个亚基 大多数寡聚酶是胞内酶，而胞外酶一般是单体酶。酶的分类天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）3. 多酶复合体（multienzyme complex） ： 若干个功能相
12、关的酶缔合形成的结构和功能实体，催化细胞代谢中一个连续反应体系。其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。有利于化学反应的进行，以提高酶的催化效率，同时便于机体对酶的调控。如：丙酮酸脱氢酶系 酶的分类-生物化学教程多酶复合体 所谓“多酶体系”是指一个代谢过程中几个酶形成一个反应链体系，多酶体系中的酶通常具有以下性质。 （ ） 只是在功能上相互有联系，在结构上互不相关，不存在相互作用； 不仅在功能上相互有联系，在结构上也有相互联系，形成复合体； 上述两种情况都存在。 中国科学院中国科学院2002年年 多酶体系（multienzymesystem）是：在完整细
13、胞内的某一代谢过程中，由几个酶形成的反应体系。多酶体系与多酶复合体概念相同!（2版生化） 多酶复合体1. 多酶复合体具有自身调节的机制，第一步反应一般是限速步骤，可被其他反应产物。这种作用被称之为，催化这步反应的酶往往是。 中国科学院2003年生物化学 2. 组成多酶复合体的各种酶都是同工酶。(判断题) 2011青岛农业大学生物化学试题3. 在细菌和植物中，脂肪酸合酶由多酶体系构成。而在动物中，脂肪酸合酶以多功能多肽链的形式存在(判断题) 。中山大学中山大学20052005年年多酶复合体大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成： 举例(两个或以上)说明多酶复合体中长的灵活的臂模式在催化中的作用
14、上海交通大学2000 丙酮酸羧化酶4、多酶融合体（多功能酶、串联酶） 一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，往往是基因融合的产物。生物进化中,外显子跳动产生的结果.有利于酶的协同作用,提高催化效率. 例如：糖原分解过程中的脱支酶Debranching Enzymea. 大肠杆菌聚合酶b.哺乳动物脂肪酸合酶c. 哺乳动物乙酰-辅酶A羧化酶d.嘧啶合成的个别酶:真核生物中,合成途径的前三个酶和后两个酶各为一个多功能酶,更有利于以均匀的速度合成UMP大肠杆菌的DNA聚合酶1. DNA聚合酶工、都属于多功能酶。 (是非题 ) 南京大学南京大学2002年年 2. 何谓多酶复合体和多功能酶试举例阐明
15、两种酶的结构特点及其在代谢中的作用.(10分)体内有些酶彼此聚合在一起,组成一个物理的结合体,此结合体称为多酶复合体.若把多酶复合体解体,则各酶的催化活性消失.(2分)。一个酶分子中存在多种催化活性部位的酶称为多功能酶.多功能酶在分子结构上比多酶复合体更具有优越性,因为相关的化学反应在一个酶分子上进行,比多酶复合体更有效.(2分)上海交通大学医学院2007-2008学期大肠杆菌的DNA聚合酶 多酶复合体多酶复合体:丙酮酸脱氢酶复合体.催化丙酮酸生成乙酰CoA的反应.含3个酶,五个辅酶.包括丙酮酸脱氢酶,二氢硫辛酸乙酰转移酶及二氢硫辛酸脱氢酶.参与的辅酶有TPP,硫辛酸,FAD,NAD+,辅酶A
16、.(3分)多功能酶多功能酶: DNA聚合酶为一条多肽链上具有三种酶的活性.其大片段称为Klenow片段,具有两种催化活性,一为53的DNA聚合功能,另一为35外切酶的活性,从3端水解DNA产生3单核苷酸,这种35外切酶活性对保证DNA复制的真实性具有重要的意义.小片段则具53外切酶的活性,它能从53方向一个挨一个切除,产物为5单核苷酸,或跨过若干个核苷酸再进行酶解,从5末端释放一寡核苷酸.可除去冈崎片段5端的RNA引物和在DNA损伤修复中起重要的作用.(3分)四、酶的命名与编号1. 依据底物来命名（绝大多数酶）蛋白酶、淀粉酶2. 依据催化反应的性质命名：水解酶、转氨酶3. 结合上述两个原则命名
17、：琥珀酸脱氢酶。4. 有时加上酶的来源胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶 习惯命名法不够系统，不够准确，难免会出现一酶多名或一名多酶的现象。为此1961年国际酶学委员会（Enzyme Commission，EC）提出了系统命名法。习惯命名系统命名 系统名应包括底物名称,反应性质以及反应名称,最后加“酶”字。若作用的底物有两种,则须同时列出,并用:将其隔开;若作用物之一为水,则可略去.底物的名称必须确切,L,D型及a,b型均应列-酮戊二酸 + 丙氨酸谷氨酸 + 丙酮酸习惯名称:谷丙转氨酶系统名称:丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶例如：底物底物产物产物产物产物底物底物酶的国际系统分类法及编号（EC编号）类 别占
18、总酶比例%利用率%氧化还原酶oxidoreductases2765转移酶 transferases2425水解酶 hydrolases265裂合酶 lyases125异构酶 isomerases51连接酶 ligases611.氧化还原酶类：氧化还原酶类：催化氧化还原反应（最大的一类酶） 通式：AH2+BBH2+A 其中：A为质子供体，B为质子受体 如：乳酸脱氢酶催化的反应： 乳酸NAD+丙酮酸NADH22. 转移酶类：转移酶类：催化底物之间基团的转移反应. 通式：AR+BBR+A 其中：R为转移基团，R不为2H 如：己糖激酶、转氨酶、脂酰转移酶、糖基转移酶等酶的国际分类酶的国际分类3. 水解
19、酶类：催化底物的水解反应 通式：AB+H2OAH+BOH 如：淀粉酶，脂肪酶，蛋白质酶等4. 裂合酶类：催化底物裂解或缩合反应（可逆）， 通式： ABA+B 如：醛缩酶，水合酶，脱氨酶等。醛缩酶酶的国际分类5. 异构酶类：催化同分异构体底物之间相互转换 通式：AB 其中：A、B为同分异构 如：磷酸甘油酸变位酶、6-磷酸葡萄糖异构酶等。磷酸甘油酸变位酶磷酸甘油酸变位酶酶的国际分类6. 合成酶类： 也称连接酶类，催化两种或两种以上化合物合成一种化合物的反应。反应需吸收能量，通常与ATP的分解相偶连，ATP分解产生能量用于合成反应。 通式：A+B+ATPAB+ADP+Pi 或 A+B+ATPAB+A
20、MP+PPi 如：乙酰辅酶A羧化酶催化的反应：CH3COC0A+CO2+ATPHOOCCH2COC0A+AMP+PPi 合成酶与裂合酶的差异就是前者的合成反应需要ATP(判断？） 2009中山大学生物化学中山大学生物化学氨基酸+ATP+tRNA氨基酰-tRNA+AMP+ppi氨基酰-tRNA合成酶酶的国际分类碳酸酐酶催化反应CO2+H2OH2CO3,则此酶属于:( ) A. 水解酶 B.转移酶 C.裂合酶 D.合成酶 锌起催化作用的酶-碳酸酐酶和羧肽酶碳酸酐酶是已知转换数最高的酶之一酶的国际分类DNA聚合酶属于哪一类酶 ？己糖激酶属于哪一类酶？葡萄糖 + ATP 6-磷酸-葡萄糖 + ADP比
21、较需氧和不需氧脱氢酶异同？1 氧化酶类举例：细胞色素氧化酶、酚氧化酶等特点：催化底物脱氢后，以O2为直接受氢体,生成H2O。组成：结合酶酶蛋白辅基：含Fe 、 Cu2 脱氢酶类(1) 需氧脱氢酶（也可称为氧化酶）需氧脱氢酶（也可称为氧化酶） 特点：催化底物脱氢后,以O2为直接受氢体,生成H2O2。组成：结合酶酶蛋白辅基：FMN、FAD厦门大学2012生物化学举例：黄嘌呤氧化酶，氨基酸氧化酶(2). 不需氧脱氢酶（最重要）特点特点：催化底物脱氢后，催化底物脱氢后，不能以不能以O2为直接受氢体为直接受氢体 组成组成：结合酶结合酶 酶蛋白酶蛋白 辅助因子辅助因子 辅酶：辅酶：NAD+、NADP+ 辅
22、基辅基：FMN、FAD1、下列哪种酶属需氧脱氢酶？A、乳酸脱氢酶B、L-氨基酸氧化酶C、琥珀酸脱氢酶D、NADH脱氢酶E、苹果酸脱氢酶上海交通大学2004年生物化学试题思考题2. 是非题：黄嘌呤氧化酶是可催化黄嘌呤氧化生成尿酸的需 氧脱氢酶。 山东大学2003生物化学3、细胞色素aa3的重要特点是A、可使电子直接传递给氧分子的细胞色素氧化酶B、以铁卟啉为辅基的递氢体C、是递电子的不需氧脱氢酶D、是分子中含铜的递氢体E、含有核黄素中山大学医学院硕士生物化学试题（2002）思考题酶的国际命名酶的系统编号：4位数字 第一位：代表六大类反应类型 第二位：亚类（作用的基团或键的特点） 第三位：亚亚类（精
23、确表示底物/产物的性质） 第四位：在亚亚类中的序号乳酸脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的编号五、酶的专一性概念：酶只能催化某一化合物或某一类化合物，发生一定的 化学变化，生成一定的产物。（酶对底物的选择性）两种类型结构专一性 1、绝对专一性： 2、相对的专一性立体异构专一性 1、 旋光异构专一性 2、 几何异构专一性族专一性键专一性（一）、酶的专一性类型1、结构专一性 (1) 绝对专一性绝对专一性 指酶对底物的要求非常严格,只作用于一种底物,而不作用于其它任何物质.指酶可作用于一类底物.如:脲酶只能催化
24、尿素分解生成氨和二氧化碳,而对尿素的衍生物甲基尿素则不起作用.另外，DNA聚合酶（2）相对专一性相对专一性（relative specificity）结构专一性（续） 族专一性族专一性or 基因专一性基因专一性 具相对专一性的酶作用于底物时，对底物键两端的基团要求的程度不同，对其中一个基团要求严格，对另一个则要求不严格，这种专一性又称族专一性or 基因专一性。如 -D- 葡萄糖苷酶，胰蛋白酶。 键的专一性键的专一性 有一些酶，只要求作用于一定的键，而对键两端的基团并无严格的要求。这种专一性称键的专一性。如脂肪酶A B 或 A BSpecific Peptide Cleavage Reactio
25、nsCleave polypeptide into smaller peptides 2. 立体异构专一性 (1) 旋光异构专一性 例如L氨基酸氧化酶只能催化L氨基酸氧化，而对D氨基酸无作用 (2) 几何异构专一性 当底物具有几何异构体时，酶只能作用于其中的一种。例如，琥珀酸脱氢酶只能催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸（反丁烯二酸）(二)酶作用专一性假说认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样Lock and key model Emil Fischer (1890)1. 锁与钥匙学说锁与钥匙学说2、诱导契合学说（induced-fit h
26、ypothesis)酶作用专一性假说 （Koshland，1958）：酶活性中心的结构有一定的灵活性，当底物（激活剂或抑制剂）与酶分子结合时，酶蛋白的构象发生了有利于与底物结合的变化，使反应所需的催化基团和结合基团正确地排列和定向，转入有效的作用位置。 认为酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。酶作用专一性假说3、“三点结合”的催化理论 酶能区分从有机化学观点来看是属于对称分子中两个等 同的基团，只催化其中的一个基团，而不催化另一个。 “三点结合”的催化理论顺乌头酸酶催化的立体异构专一性：什么是酶的活性部位，如何解释酶的专一性2
27、009年中科院生物化学与分子生物学六、酶的活力测定与分离纯化（一）、酶活力、活力单位和比活力 酶的定量并非对其质量质量进行定量，而是对它的催化能力进行定量。测定酶的活力就是酶的定量测定1、酶活力酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度（一般测初速度一般测初速度）的能力。酶的含量多少就是酶的含量多少就是反应速率大小反应速率大小 酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。 单位：浓度/单位时间活力测定一般测初速度活力测定一般测初速度 反应初速率的概念及其条件反应初速率的概念及其条件初速度（初速度（底物变化量不能 超过5%；不超过5分钟） 测初速度原因：初速率与酶量成线性关
28、系测初速度原因：初速率与酶量成线性关系 反应速度：反应速度：单位时间、单位体 积中底物的减少量或产物的增加量。 （a）底物浓度的降低、产物的增加而造成的逆反应的加快。（b）产物的抑制作用（c）酶本身的逐渐失活（d）PH改变P335-6（1）S远大于远大于E: : S在5 Km以上，并非越多越好 初速度与S呈零级反应 初速度与E呈一级反应（2）外界条件：最佳温度、最佳PH、最佳离子强度（3）反应体系有适宜的辅助因子、激活剂 酶的活力测定注意P336Vmax = Kcat E 酶的活力测定（1）反应进程曲线：是指酶反应时间与产物生成量(或底物减少量)之间的关系曲线。在酶反应的最初阶段里，底物或产物
29、的变化量一般随反应时间而线性地增加，反应速度恒定 。换言之，测定酶活力应该在进程曲线的初速度时间范围内进行。（2）酶浓度曲线： 初速度-酶浓度曲线，确定线性关系的酶浓度（3）对照：酶失活2.活力单位酶的活力单位（U）（表示酶量多少：速率表示酶量）活力单位：一定时间内将一定底物转化成产物所需要酶量P336（1）、习惯单位：人们习惯沿用的单位，表示方法不统一。 如：淀粉酶的活力单位可用每小时催化1克淀粉的酶量表示（1g/hr）。也可用每小时催化1ml 2% 淀粉所要的酶量表示。 测定酶的活力就是酶的定量测定，用活力单位数来测定酶的活力就是酶的定量测定，用活力单位数来表示。表示。 酶的活力单位（U）
30、（表示酶量多少）（2）. 国国际际单单位位IU:(International Unit）：在最适条件下，每分钟内催化1微摩尔（mol）底物转化为产物的酶量为一个酶活力单位。既：1IU = 1mol/min（3）. 国际单位国际单位Kat单位（Katal）：每秒钟能催化1摩尔（mol）底物转化为产物的酶 量定为一个Kat单位。 既： 1Kat = 1mol/s. Kat与IU的换算如下：1Kat = 60106 IU酶的比活力 Specific activity 定义：每毫克每毫克酶蛋白所具有的酶活力。（有时用每毫升） 单位：U/mg蛋白质。 酶的比活力是分析酶 纯度的重要指标纯度的重要指标。
31、比活力=活力Umg蛋白 =总活力U/总蛋白mg3、酶的比活力酶纯度的重要指标酶纯度的重要指标所以，酶的定量就是测定酶的活力，也即测定酶促反应的速度，比活力测定就是酶的纯度测定。什么是酶的活力和比活力？2009年中科院生物化学年中科院生物化学思考题1. 称取50mg商品蛋白酶粉，配制成25ml酶溶液。取出0.1ml酶液，在以酪蛋白为底物的测活体系中检测蛋白酶活力得知，30min后，可以产生900g的酪氨酸(Tyr);另取5ml酶液，用凯氏定氮法测得蛋白氮为0.40mg。以每分钟产生1g Tyr的酶量为1个活力单位，请计算：(1)每ml的酶溶液的酶活力1U = 1g/min900g 30min 0
32、.1ml =300U厦门大学2007生物化学思考题 称取50mg商品蛋白酶粉，配制成25ml酶溶液。取出0.1ml酶液，在以酪蛋白为底物的测活体系中检测蛋白酶活力，得知，30min后，可以产生900g的酪氨酸(Tyr);另取5ml酶液，用凯氏定氮法测得蛋白氮为0.40mg。以每分钟产生1gTyr的酶量为1个活力单位，请计算：(1)每ml的酶溶液的酶活力=(300U) (2) 1毫升酶液含有 酶蛋白 = 0.40mg5ml16%=0.40.8=0.5mg 酶的比活力 = 300U 0.5mg = 6000U/mg(3) 1 克（1000mg)样品所具有的总活力单位。 300U (50mg 25m
33、l) 1000 = 1.5105U 思考题- -课后题(13) 称取25mg蛋白酶粉配制成25毫升酶溶液，从中取出0.1毫升酶液，以酪蛋白为底物，用Folin-酚比色法测定酶活力，得知每小时产生1500微克酪氨酸。另取2毫升酶液，用凯氏定氮法测得蛋白氮为0.2毫克（蛋白质中氮的含量比较固定：16）。若以每分钟产生1微克酪氨酸的酶量为1个活力单位计算。根据以上数据求：（a）1毫升酶液中所含蛋白质量及活力单位。（b）比活力。 （c）1克酶制剂的总蛋白含量及总活力。P349思考题答（1）蛋白浓度=0.26.25mg/2mL=0.625mg/mL； 活力单位= (1500微克/60min) 0.1ml
34、=250U （2）比活力= 1500/601ml/0.1mL0.625mg/mL=400U/mg （3）总蛋白=0.625mg/mL1000mL=625mg； （4）总活力=625mg400U/mg=2.5105U。思考题分析 (1)由题意可知,2ml酶液中含氮0.2毫克,则1ml酶液中含氮0.1g.因为蛋白质的平均含氮量为16%,所以0.1氮相当于蛋白质的量为0.1 / 16%=0.625(毫克),即1毫升酶液中所含的蛋白质量为0.625g.又知0.1ml酶液每小时产生1500mg酪氨酸.根据定义:每分钟产生1mg酪氨酸的酶量为1个活力单位(或一个酶单位u).因此,1毫升酶液所含的酶单位为1
35、50010 / 60=250(u).(2)酶比活力是指每毫克酶蛋白所具有的酶活力,一般用单位/毫克蛋白表示. 0.625毫克酶蛋白含有250酶单位,那么,1毫克酶蛋白含有的酶单位数为:2501 / 0.625=400(酶单位/毫克酶蛋白)(3)由题意可知每毫升醇含1毫克蛋白酶粉(酶制剂).由(1)得到每毫升酶制剂含0.625毫克酶蛋白,所以每克酶制剂含0.625克酶蛋白.又因为总活力=比活力酶蛋白总量,即总活力=400625=2.5105(酶单位)思考题2. 今将某酶制剂稀释到10mg蛋白质/ml，测得比活力为300U/mg蛋白。（1） 若底物浓度达到饱和，1ml反应液中含10l酶稀释液的反应
36、初速度是多少？ 1ml = 1000 l 300U/mg = 300 mol/min /mg 10l酶稀释液中酶蛋白（mg数）=(10mg 1000) 10 300 （ 10mg 100010 ）= 30 mol / min（2） 若要将反应速度控制在45mol/min以内，1ml反应液里最多能加多少酶稀释液？ 45 mol/min （30 mol/min 10l）= 15l华南师范大学2003生物化学1 IU = 1 mol / min思考题 (3). 若该酶的Km值为2.210-4mol/L，当底物浓度为0.8mol/L时测得反应速度为160mol/min。若底物浓度为10-4 mol/L
37、，反映初速度是多少？华南师范大学2003生物化学思考题3. 称取100 mg粗酶样品配定容成100 mL溶液。取该溶液进行SDS-PAGE电泳，考马斯蓝染色后，经软件光密度积分计算出酶蛋白在粗酶中含量为10%；另取0.1 mL溶液测酶活力，结果每小时可以水解酪蛋白产生 1500 g酪氨酸。假定1个酶活力单位定义为每分钟产生 1g酪氨酸的酶量，请计算：（1）粗酶粗酶样品中酶比活；（2）理论上（100%回收）纯化每克纯酶制剂的需要的粗酶样品量及纯酶比活。（10分）昆明理工大学2012考研生物化学100 mg/100 mL1mg/ mL0.1 mL溶液含溶液含纯酶制剂纯酶制剂= 0.1 1mg/ m
38、L 10% = 0.01mg酶蛋白在粗酶中含量为酶蛋白在粗酶中含量为10%0.01mg 酶的活力单位酶的活力单位 = 1500/60 = 25U0.1 mL溶液含溶液含粗酶粗酶蛋白蛋白 = 0.1 mg思考题4. 有一克淀粉酶制剂，用水溶解成1000毫升，从中取出1毫升测定淀粉酶活力，测知每5分钟分解0.25克淀粉，计算每克酶制剂所含的淀粉酶活力单位数?(已知淀粉酶活力单位的定义为：在最适条件下每小时分解l克淀粉的酶量称为1个活力单位。 提示：已知：lml酶制剂相当于1mg酶制剂，根据酶活力单位定义：每小时分解1克淀粉的酶量为1个活力单位，则lmg酶制剂每小时分解淀粉的酶的活力单位=0.25g
39、/5分钟601=3活 力 单 位 每 克 酶 制 剂 所 含 活 力 单 位 =3个 活 力 单 位1000=3000活力单位1. 化学反应的速率及其测定：测产物化学反应的速率及其测定：测产物 （1）分光光度法(Spectrophotometry) 利用底物和产物在紫外或可见光部分的光吸收的不同。 （2）荧光法(Fluorometry) 酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe残基以及一些辅酶。 （3）电化学法和（4）同位素法 L-乳酸+ NAD+丙酮酸 + NADH + H+乳酸脱氢酶 例: 人血清乳酸脱氢酶活力的测定（二）、反应速率、初速率和酶活力测定P336分光光度法测乳酸脱氢酶活力 LDH
40、可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH, NAD+ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢醇脱氢酶酶、醛脱氢酶、甘油-3-磷酸脱氢酶等。 测乳酸脱氢酶活力测乳酸脱氢酶活力，是在一定条件下，向含丙酮酸及NADH的溶液中，加入一定量乳酸脱氢酶提取液，观察NADH在反应过程中340 nm 处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义是：在25，pH7.5条件下每分钟A340下降值为1.0的酶量为1个单位（二）、酶的
41、分离纯化 P337酶的分离纯化即蛋白质的分离纯化：包括酶制剂的浓缩与纯化。判断分离提纯方法的优劣的两个指标：判断分离提纯方法的优劣的两个指标：总活力的回收， 比活力的提高。酶的分离纯化：低温下进行！选材破碎抽提保存结晶分离纯化总活力总活力 = 活力单位数/ml酶液总体积（ml）比活力比活力 = 活力单位数/ml蛋白（氮）=总活力单位数/总蛋白（氮）mg纯化倍数 回收率（产率） 100%第一次比活力每次比活力每次总活力第一次总活力酶的分离纯化 酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。 （判断判断）在酶的纯化中，通常酶的比活力逐渐增大，最后不变。蛋白质纯化的一般注意事项操作尽可能置于冰
42、上或者冷库内进行；不要太稀，蛋白质浓度维持在g/mlmg/ml；合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲液pH避免与pI相同；使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解；避免样品反复冻融和剧烈搅拌，以防蛋白质变性；缓冲溶液成分尽量模拟细胞环境； P338蛋白质纯化的一般注意事项在缓冲溶液加入0.11mmol/L DTT（或-巯基乙醇），防止蛋白质的氧化；加110 mmol/L EDTA金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白的破坏；使用灭菌溶液，防止微生物生长。在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力。 P338思考题思考题1. 某种酶纯化后的活力单位比粗提取
43、的活力单位还要高，为某种酶纯化后的活力单位比粗提取的活力单位还要高，为什么？什么？ 2013年山东大学生命科学学院年山东大学生命科学学院2. 用生物化学方法提取酶要进行酶活力跟踪，说说你对这个用生物化学方法提取酶要进行酶活力跟踪，说说你对这个研究方法的看法研究方法的看法。 2013年中国农业大学年中国农业大学思考题思考题- -课后题课后题1518010201809P349酶的活力测定2009年南京农业大学大学 4000100=400 60001000=6400 6 =？思考题(课后11） 4. 某同学欲测定水稻叶片中某种酶的活力，可是没有找到测定方法，只从资料中找到了动物组织中酶活力的测定方法
44、，并按照该材料对水稻叶片进行测定，测定的酶活力很低，请说明可能的原因。（12分）南京农业大学南京农业大学2013年年3酶的保存将酶制品浓缩，结晶，以便保存（-20）注意：酶易失活，不可烘干。可用的方法： (1) 低温保存浓缩的酶液：注意注意：酶溶液浓度越低越易变性，不能保存酶的稀溶液。 思考题1、酶的纯化过程中最需要关注的指标是( )A. 总蛋白量变化和总活力变化 B. 蛋白质浓变化和比活力变化 C. 比活力变化和总活力变化 D. 总活力变化和蛋白质浓度变化2、在酶的分离纯化中最理想的结果是（ ） A. 纯化倍数高，蛋白含量低B. 回收率小但纯化倍数高 C. 蛋白回收率最高 D. 比活力最大
45、中科院2006年思考题4. 在测定酶活性时要测定酶促反应的初速度，其目的是: A.为了提高酶促反应的灵敏度 B.为了节省底物的用量 C.为了防止各种干扰因素对酶促反应的 D.为了节省酶的用量 3 一个酶经多次纯化过程后，下列哪个说法正确:A. 总蛋白增加，比活力增高 B. 总蛋白增加，比活力减少 C. 总蛋白增加，比活力不变 D. 总蛋白减少，比活力增高 E. 总蛋白减少，比活力降低 F. 总蛋白减少，比活力不变中国药科大学中国药科大学2005年生物化学年生物化学思考题思考题5. 测定酶活性时要测定酶促反应的初速度,其目的是为了A 为了节约底物B为了使酶促反应速度与酶浓度成正比C 为了尽快完成
46、测定工作 D为了防止出现底物抑制E为了使反应不受温度的影响6. 酶促反应的初速度（ ） A. 与温度成正比 B. 与Km成正比 C. 与I成正比 D. 与E成正比7. 判断一个纯化酶的工作的重要指标是（ ） A. 酶的纯度 B. 活性回收率 C. 重复性 D. 综合以上三种因素厦门大学厦门大学2009生物化学生物化学思考题思考题9. 如果要从一种粗制酶中分离分离和纯化纯化出-淀粉酶， 并对其结果进行评价，请你： 写出该实验的主要纯化纯化方法（至少3种或3种方法以上）和简要步骤； 用什么指标评价该酶的纯化纯化质量和效率； 介绍一种-淀粉酶活性测定的原理和方法。（12分） 南京农业大学2006年生
47、物化学试题8、酶的某次纯化后总活力提高了，可能原因是什么？酶的活力测定华东师范大学大学基础生物化学考研考研真题（2007）判断10.1 酶活力的测定实际上就是酶的定量测定。10.2 有1g粗酶制剂经纯化后得到10mg电泳纯的酶制 剂，那么酶的比活力较原来提高100倍。10.3. NADH脱氢酶是指以NAD+为辅酶的脱氢酶的 总称。11. 请解释什么是酶的活力和比活力，并说出这两个指标在酶的纯化过程中可以说明什么？2008年江南大学大学 七、核酶(ribozyme)1、定义定义：核酶(Ribozyme)是一类具有生物催化功能的RNA2、发发现现： (1) 1982年,美国的T.Cech发现原生动
48、物四膜虫的26S rRNA前体能够在完全没有蛋白质的情况下,自我加工,拼接,得到成熟的rRNA. 1986年,T.Cech发现在一定条件下,L19 RNA可以催化Poly C的切割与连接。(2) 1983年,S.Atman和Pace发现,将RNase P的蛋白质与RNA分离,发现蛋白质部分没有催化活性,而RNA部分具有与全酶相同的催化活性.为此Cech和Altman共同获得了1989年度诺贝尔化学奖。核糖体23S rRNA具肽酰转移酶活性名词解释：核酶2010年中科院生化与分子真题原生动物四膜虫的26S rRNA自我加工第一次转酯反应第二次转酯反应第三次转酯反应3次转酯反应 L19 RNA的催
49、化作用 Ribozyme一词于1982年由Thomas Cech 首先提出的，关于其译名有几个，如核糖酶、核酶、类酶RNA 以及酶RNA等。目前，对此译名尚无定论，有待商榷。 3、核酶的种类按作用底物方式不同分为，自然界现有n（1）催化分子内反应的核酶， 自我剪接核酶（四膜虫 rRNA，需鸟苷和Mg2+） 自我剪切核酶 (不需鸟苷)n（2）催化分子间反应RNA的核酶。自我切割区内有锤头结构 4、Ribozyme发现的重大意义：（1）RNA具有酶的催化活性，向酶的化学本质是蛋白质这一传统概念提出了挑战。（2）在理论上，对于生物起源和生命进化的研究具有重要 启示。 （3）生物催化分子进化的可能性：
50、 RNA RNA-蛋白质 蛋白质-RNA 蛋白质-辅酶或辅基 蛋白质 （4）在实践上，由于Ribozyme的内切酶活性，可定点切割mRNA，破坏mRNA，抑制基因表达，为基因、病毒和肿瘤治疗提供了可行途径。思考题思考题1、 生物化学中把核苷酸酶称为核酶。（判断） 南开大学南开大学20062006 2、判断：核酶主要是指在细胞核中的酶类。华南理工大学华南理工大学20062006年年 核酶具有高度的专一性 需要特定的结构特定的结构 符合动力学米氏方程 对竞争性抑制剂敏感核酶和一般酶的共性（一）抗体酶（一）抗体酶（abzyme）是指既是抗体又具有催化功能的一类特殊蛋白质。因为它是具有催化活性的抗体，
51、故又称为“催化性抗体（catalytic antibody）。 1986年Richard Lerrur and Peter Schaltz根据过渡态理论和免疫学原理，运用单克隆抗体技术成功地制备了具有酶活性的抗体，得到了抗体酶 。他们成功地关键是巧妙地利用了过渡态类似物作为半抗原，再结合蛋白质成为结合抗原，然后免疫动物，制备单克隆抗体，经过筛选获得具有催化功能的抗体。名词解释：抗体酶2011年中科院生化与分子真题八、抗 体 酶(Abzyme) 抗 体 酶(Abzyme) 将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入法、化学修饰法等途径。诱导法是利用（反应过渡态类似物反应过渡态类似物）为半抗原制作单
52、克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶。拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的。（酶（做抗原）抗体抗抗体）引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能。化学修饰法对抗体进行化学修饰，使抗体与催化基团相连。抗体酶的应用前景： 1.为蛋白质结构的研究提供新手段 2.设计抗肿瘤等的新型生物药物 3.应用于工业制药（立体专一性抗体酶） 抗体酶意义及应用抗体酶具有酶的一切性质（判断+）抗体酶是指具有催化活性的抗体（判断+）。北京大学北京大学20042004 这些抗体酶具有下列特点：1、可使所催化的反应加速102-105倍；2、符合米氏方
53、程式；3、具有专一性；4、催化活性依赖于PH值、温度、并可被抑制剂抑制。 南开大学南开大学20052005九、酶工程简介（一）、酶工程的定义和分类：1、定义：定义：酶工程指酶制剂在工业上的大规模生产及应用 2、酶工程分类酶工程分类：化学酶工程、生物酶工程（二）、化学酶工程亦称初级酶工程 1、定义：定义：主要由酶学与化学工程技术相互结合而形成2、分类分类化学酶工程分类（1）食品工业、制药工业等-使用自然酶（2）医学上治疗及研究-对纯酶进行化学修饰以改善性能（3）固定化酶固定化酶-指被结合到特定支持物上并能发挥作用的一类酶。是化学酶工程中具有强大生命力的主干。四种方法四种方法吸附、交联、共价结合、
54、包埋 a、可以用离心法或过滤法很容易地将酶与反应液分离开来。在生产中十分方便有利b、可以反复使用,达上千次,节约成本 c、稳定性能好（4）人工酶-模拟酶的生物催化功能，用化学半合成法或化学全合成法合成的酶称人工酶 优点：优点：化学酶工程固定化酶的方法：（）（）（）（）2011年天津大学生物化学考研试题名词解释：固定化酶 2006年苏州大学生物化学考研试题（1）、定义：在化学酶工程基础上发展起来的，是以酶学和DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。亦称高级酶工程。（2）、分类：（a）用DNA重组技术大量地生产酶（克隆酶）（b）对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶（突变酶）（c）设计新的酶
55、基因，合成自然界不曾有过的能稳定、催化效率更高的新酶（二）. 生物酶工程 第9章 酶促反应动力学q概念研究各种因素对酶促反应速度的影响，并加以定量的阐述。q影响因素包括有底物浓度：底物浓度：米氏方程酶浓度酶浓度：Vmax=K3 E抑制剂抑制剂：可逆抑制剂和不可逆抑制剂激活剂：激活剂：pH：最适PH温度：温度：最适温度 VVmaxSKm + S 1. 酶促反应的初速度不受哪一因素影响: A. S B. E C. pH D. 时间 E. 温度2. 在测定酶促反应的初速度时，酶促反应的初速度不受哪一因素影响不受哪一因素影响: A.S B.E C.pH D.时间3. 是非题：酶促反应的初速度与底物浓度
56、无关。（ ）思考题华南理工大学华南理工大学20062006，20092009年年 中国科学技术大学生物化学中国科学技术大学生物化学20022002年年4、苏州大学2007 1）测酶活性时，反应速度对底物应呈（） A 一级反应 B 混合级反应 C 零级反应 D 二极反应 2）酶促反应达到最大速度后，增加底物浓度不能加快反应速度的原因是（） A、全部酶与底物结合成E-S复合体 B、过量底物对酶有负反馈抑制 C 、过量底物与激活剂结合影响底物与酶的结合 D、改变了化学反应的平衡点 E、以上都不是 思考题一、化学动力学基础化学热力学：反应进行的方向、方向、 可能性与限度可能性与限度化学反应的动力学：反
57、应的速度反应的速度和反应机制(酶的影响酶的影响) )化学动力学基础活化能活化能自由能差自由能差平衡常数相关转化率相关反应速率相关1. 酶催化底物时将产生哪种效应（单选） A、提高产物能量水平 B、降低反应的活化能 C、提高反应所需活化能 D、降低反应物的能量水平 暨南大学暨南大学2011年生物化学年生物化学 (一)化学反应的速率及其测定化学动力学基础 (二)反应分子数、反应级数及特征1. 反应分子数单分子数 2 分子数 3 分子数 4 分子数2. 反应级数及特征一级反应：一级反应：反应速率与反应物的浓度的一次方成正比二级反应二级反应：反应速率与两种物质浓度的乘积成正比。 零级反应：零级反应：反
58、应速率与反应物浓度无关的反应。 混合级反应： v = k A A + B C + Dk A Bk v = k A B A Bk v = k E P352 米氏方程（Michaelis-Mentent equation）:表示一个酶促反应的起始速度（）与底物浓度(s)关系的速度方程 条件：单底物，单产物的反应理论基础：中间产物学说假设：反义速率(v)和ES成正比发展: (1) 最初.Michaelis和Menten 是根据“快速平衡假说” 推出米式方程。 (2) 以后.Briggs和Haldane的“稳态平衡假说”及其对米式 方程的发展： 二、底物浓度底物浓度对酶促反应速度的影响（一）（一） 中
59、间复合物假说中间复合物假说 中间产物学说认为：当酶催化某个反应时, 酶和底物先结合形成一个(中中间间复复合合物物) ), 然后中间复合物再分解, 生成产物并释放出酶。一般以产物的生成速度代表整个酶催化反应速度，而产物的生成取决于中间物的浓度. 因此, 整个酶促反应的速度取决于中间物的浓度.（1）：）：S P （2）：E + S ES E + P 中间复合物假说1903年Henri用蔗糖酶水解蔗糖实验1903年Henri用蔗糖酶水解蔗糖实验非酶催化：非酶催化：S P（无饱和效应无饱和效应）酶催化酶催化：E + S ES E + P（有饱和效应有饱和效应） v = k S v = k ES一 级
60、反 应当底物浓度较低时：反应速度与底物浓度成正比关系；反应为一级反应。SSVVmax混合级反应随着底物浓度的增高：反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。SSVVmax零级反应当底物浓度高达一定程度：反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应SSV VVmax中间产物假说证据： （1）竞争性抑制实验（2）底物保护酶不变性 （3）结晶ES复合物的获得。(4)底物和酶共沉降（5）ES复合物被电子显微镜或X-射线衍射法观察到。中间产物假说证据思考：酶溶液加热时,随着时间的推移,酶的催化活性逐渐丧失.这是由于加热导致天然酶的构象去折叠.己糖激酶溶液维持在45 12分钟后,活性丧失百分之五十.但是
61、若己糖激酶与大量的底物葡萄糖共同维持在 45 12分钟,则活性丧失仅为3%.请解释,为什么在有底物存在下,己糖激酶的热变性会受到抑制 答:酶-底物复合物比单独的酶更稳定. 四川大学2007生物化学酶在有底物存在时比没有底物存在时更稳定，解释原因酶在有底物存在时比没有底物存在时更稳定，解释原因 山东大学2012生物化学1、米式方程的推导在反应的初始阶段，S远远大于E，因此，S可以认为不变可以认为不变。因为研究的是初速度，P的量很小，由P+E ES可以忽略不记可以忽略不记。 游离的酶与底物形成ES的速度极快（快速平衡），而ES形成形成 产物产物的速度极慢，的速度极慢，故故ES 的动态平衡与的动态平
62、衡与ES P+E没有关系没有关系（既（既 K1、K2 K3 ）（1）早期的米氏方程基于）早期的米氏方程基于(快速平衡假快速平衡假)说：三个假定说：三个假定（二）.酶促反应动力方程式V = k3 ESES的生成速度的生成速度 = K1（Et - ES）SES的分解速度的分解速度 = K2 ES 所以所以：K1（Et - ES）S = K2ES自由酶：自由酶：E = Et - ES早年的米式方程V = k3 ES酶以E 和ES两种状态存在 K1（Et - ES）S = K2ESKS现在称为底物常数表示对底物的亲和力 令：Ks =K2K1 Vmax = k3EtS中间产物假说认为：中间产物假说认为：
63、V = k3 ES Vmax S V = - k s + S早年的米式方程 （2）.Briggs和Haldane的“稳态平衡假说” 其中两个同快速平衡假说的和相同 在反应的初始阶段，底物浓度远远大于酶浓度,因此,底 物浓度S可以认为不变.因为研究的是初速度,P的量很小,由P+E ES可以忽略 为不变.第个不同：必须考虑ES分解成产物P对于ES动态平衡的影响稳态平衡假说的贡献在于发展了快速平衡学说的第点。因为并不总是K3 E，Vmax is linearly proportional to the EFixed, saturating S 反应速度与酶浓度成正比反应速度与酶浓度成正比 Vmax=KcatE判断：（华东理工大学）（华东理工大学）1. 某一酶反应的最适pH和最适温度都是恒定的，为酶的 特征常数 （ ）2. 酶促反应的速度与酶浓度成正比（+？）3. 所有酶的最适PH值都在生理PH值（）思考题华南理工大学华南理工大学20094. 酶活力的大小即酶（ ），酶的比活力代表酶的（ ）。5. 酶促反应的初速度不受哪一因素影响？ A. S B. E C. pH D. 时间 E. 温度 华南理工大学华南理工大学2009
