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1、质粒质粒质粒质粒DNADNA的提取、的提取、的提取、的提取、定量定量定量定量与酶切鉴定与酶切鉴定与酶切鉴定与酶切鉴定ExtractionandIdentificationofPlasmidDNA实验流程图实验流程图一、碱裂解法提取质粒一、碱裂解法提取质粒三、质粒酶切三、质粒酶切二、质粒定量二、质粒定量四、酶切产物的琼脂糖电泳检测四、酶切产物的琼脂糖电泳检测最后做最后做 掌握碱裂解法提取质粒的方法掌握碱裂解法提取质粒的方法 掌握紫外吸收测定掌握紫外吸收测定DNADNA的方法的方法 了解质粒酶切鉴定原理了解质粒酶切鉴定原理 掌握琼脂糖凝胶电泳技术掌握琼脂糖凝胶电泳技术实验目的实验目的实验材料实验材
2、料大肠杆菌大肠杆菌DH5a菌株菌株pMD18-T载体载体易瑞质粒小量提取试剂盒易瑞质粒小量提取试剂盒TakaraEcoRI限制性内切酶限制性内切酶TakaraHindIII限制性内切酶限制性内切酶Takara10M酶切缓冲液酶切缓冲液BioWest电泳琼脂糖干粉电泳琼脂糖干粉0.5TBE核酸电泳缓冲液核酸电泳缓冲液EB核酸荧光染料核酸荧光染料Takara6电泳上样缓冲液电泳上样缓冲液实验仪器实验仪器微量移液器微量移液器离心机离心机恒温水浴箱恒温水浴箱紫外检测仪紫外检测仪电泳仪电泳仪水平电泳槽水平电泳槽独立于细菌染色体独立于细菌染色体以外，能独立自主以外，能独立自主复制的闭合环状复制的闭合环状D
3、NA分子分子基因工程常采用的基因工程常采用的载体载体一、碱裂解法提取质粒一、碱裂解法提取质粒DNA碱裂解法碱裂解法；煮沸裂解；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法；羟基磷灰石柱层析法；质粒质粒DNA释放法；释放法；酸酚法等酸酚法等质粒提取方法：质粒提取方法：碱裂解法碱裂解法基本原理基本原理基于染色体基于染色体DNA与质粒与质粒DNA的变性与复性的的变性与复性的差异而达到分离目的。差异而达到分离目的。染色体染色体DNA：氢键断裂，：氢键断裂，变变性性。质粒质粒DNA：大部分氢键断裂，：大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。条互补链不会完全分离。（不完全变性
4、）（不完全变性）质粒质粒DNA：复性复性，溶于溶液中，溶于溶液中染色体染色体DNA：不能复性不能复性；形成缠连；形成缠连的网状结构。的网状结构。pH=12.6（碱性）（碱性）NaAc溶液溶液（pH4.8）pH=中性中性染色体染色体DNA与不稳定的大分子与不稳定的大分子RNA、蛋白质蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来复合物等一起沉淀下来离心离心u溶液溶液S1（细菌悬浮液）（细菌悬浮液）u裂解液裂解液S2u中和液中和液S3u洗涤液洗涤液Wu洗脱液洗脱液uRNaseA(100mg/ml)uDNA吸附柱吸附柱试剂盒的组成：试剂盒的组成：溶液溶液S1： 50mmol/L葡萄糖葡萄糖10mmol/LEDT
5、A25mmol/LTris-HCl(pH8.0)2毫克毫克/毫升溶菌酶毫升溶菌酶裂解液裂解液S2：200mmol/LNaOH1%SDS中和液中和液S3：3mol/LNaAc(pH4.8)溶液溶液实验流程实验流程1.5mL菌液菌液12000rpm1min菌体沉淀菌体沉淀溶液溶液S1250l剧烈震荡剧烈震荡裂解液裂解液S2250l颠倒混匀颠倒混匀4-6次次中和液中和液S3350l温和地温和地颠倒混匀颠倒混匀6-8次次12，000rpm10min室温静置室温静置35min至出现白色至出现白色絮状沉淀絮状沉淀取取600l上清至上清至吸附柱管吸附柱管12，000rpm30s12，000rpm30s洗涤液
6、洗涤液W600l12，000rpm30s12，000rpm2min取吸附柱至取吸附柱至另一新另一新EP管管洗脱液洗脱液50l12，000rpm1min室温静置室温静置1min弃滤液弃滤液空柱空柱收集洗脱液备用收集洗脱液备用洗涤液洗涤液W600l弃滤液弃滤液弃滤液弃滤液2.2.悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞1.1.收集细胞收集细胞收集细胞收集细胞3.3.裂解细胞裂解细胞裂解细胞裂解细胞4.4.中和中和中和中和6.6.洗柱洗柱洗柱洗柱7.7.洗脱洗脱洗脱洗脱5.5.过柱分离过柱分离过柱分离过柱分离二、质粒二、质粒DNA定量测定定量测定利用核酸在利用核酸在260nm处有紫外吸收的特性处有紫外吸收的
7、特性基本原理基本原理紫外分光光度计紫外分光光度计操作步骤操作步骤1.取取5 l提取的质粒提取的质粒DNA，加入，加入95 l蒸馏水蒸馏水2.混合均匀混合均匀3.用紫外分光光度计测定用紫外分光光度计测定A260DNA或或RNA的定量的定量A260=1.0相当于相当于50g/ml双链双链DNA40g/ml单链单链DNA（或（或RNA）20g/ml寡核苷酸寡核苷酸紫外光吸收法紫外光吸收法：DNA纯品纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品纯品:OD260/OD280=2.0DNA或或RNA的纯度判定的纯度判定三、质粒三、质粒DNA的酶切分析的酶切分析质粒质粒DNA:3kb载体载体:pMD18-
8、T2.7kb基因基因:CHD51.4kb限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列限制酶识别序列的的特殊特殊DNA序列之内或其附近的序列之内或其附近的特异位点特异位点上，并在此上，并在此切切割双链割双链DNA。分子克隆中常用的为分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为型限制酶，其识别位点长度为46个核苷酸的个核苷酸的反向重复序列反向重复序列。限制性内切酶限制性内切酶GGATCCCCTAGGEcoR和和Hind的识别序列和切口是：的识别序列和切口是：EcoR：GAATTCHind：AAGCTTpMD18-T反应物反应物体积（体积（l)10M酶切缓冲液酶切缓
9、冲液2质粒质粒DNA10Hind III1EcoRI1H2O6在一个洁净的在一个洁净的1.5ml离心管中混匀下列反应物：离心管中混匀下列反应物：混合后混合后37水浴水浴12h质粒质粒DNA的酶切分析操作的酶切分析操作1234影响酶切反应的因素影响酶切反应的因素底物底物DNA的纯度的纯度反应系统：反应系统：(反应缓冲液反应缓冲液)反应体积：反应体积：甘油浓度甘油浓度5%保温时间与温度保温时间与温度四、琼脂糖凝胶电泳四、琼脂糖凝胶电泳电泳：电泳：带电粒子在电场中泳动的现象带电粒子在电场中泳动的现象影响迁移率的因素？影响迁移率的因素？电场电场样品：样品：大小（分子量）大小（分子量）形状（构型）形状（
10、构型）电荷电荷共价闭环超螺旋共价闭环超螺旋DNA线性线性DNA开环的双链环状开环的双链环状DNA质粒质粒DNA三种构型：三种构型：共价闭环超螺旋共价闭环超螺旋线性线性开环的双链环状开环的双链环状胶浓度（）胶浓度（）线性线性DNA分子大小分子大小（kb）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.242.00.13本次电泳使用本次电泳使用1.0%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶浓度与琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围分子的有效分离范围琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备上样：上样：加样前，样品先与加样前，样品先与6上样缓冲液混匀上样缓冲液混匀电泳电泳：电压电压1
11、00v；30min结果观察：结果观察：凝胶成像仪凝胶成像仪琼脂糖凝胶电泳操作琼脂糖凝胶电泳操作琼脂糖凝胶电泳上样琼脂糖凝胶电泳上样1：DNAMarker（5 l）2：提取的质粒：提取的质粒DNA（5 l）3：质粒：质粒DNA酶切产物酶切产物（10 l）+-1234每组上每组上2个样品个样品DNAMarker(ladder)LoadingBuffer上样缓冲液上样缓冲液EDTA甘油甘油增大溶液密度增大溶液密度溴酚蓝溴酚蓝指示剂指示剂二甲苯胺蓝二甲苯胺蓝指示剂指示剂组成组成0.5TBE,0.5-1.4%浓度的胶中，浓度的胶中，迁移率迁移率溴酚蓝溴酚蓝=300bp二甲苯胺蓝二甲苯胺蓝=4kbp染色染
12、色溴化乙锭溴化乙锭(EthidiumBromide，EB):3,8-二二氨基氨基-5-乙基乙基-6苯基菲啶溴盐，能插入苯基菲啶溴盐，能插入DNA分子碱基对之间并与之结合分子碱基对之间并与之结合,在紫外光照射在紫外光照射下呈现红橙荧光下呈现红橙荧光,优点：优点：染色操作简便，快速染色操作简便，快速；灵敏度高灵敏度高缺点：缺点：有致癌性有致癌性( (使用时一定要戴手套使用时一定要戴手套) )1 2M3 45 6 75000300020001000bpM:DNAMarkerDL50001.PCR产物产物;2.PCR产物产物2.3.质粒质粒DNA;4.质粒质粒DNA3.5.酶切产物酶切产物;6.酶切产物酶切产物结果分析结果分析
