《病理学常用研究方法 ppt演示课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《病理学常用研究方法 ppt演示课件（23页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 病理学常用研究方法1 1. .整体水平整体水平：尸体解剖尸体解剖尸体解剖尸体解剖 autopsyautopsyautopsyautopsy动物实验动物实验动物实验动物实验 animal experimentanimal experimentanimal experimentanimal experiment细胞水平：细胞水平：光镜组织切片光镜组织切片光镜组织切片光镜组织切片 light-microscopelight-microscopelight-microscopelight-microscope细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养 cell culturecell culturecell
2、culturecell culture流式细胞技术流式细胞技术流式细胞技术流式细胞技术 flow flow flow flow cytometrycytometrycytometrycytometry组织芯片组织芯片组织芯片组织芯片 tissue micro-arraytissue micro-arraytissue micro-arraytissue micro-array组织微切割技术组织微切割技术组织微切割技术组织微切割技术 micro-dissectionmicro-dissectionmicro-dissectionmicro-dissection电镜电镜电镜电镜 透射、扫描、免疫电
3、镜透射、扫描、免疫电镜透射、扫描、免疫电镜透射、扫描、免疫电镜2 2. .蛋白水平：蛋白水平：蛋白水平：蛋白水平：1.1.1.1.免疫组化免疫组化免疫组化免疫组化 immunohistochemstryimmunohistochemstryimmunohistochemstryimmunohistochemstry2.Western Blotting2.Western Blotting2.Western Blotting2.Western Blotting3.3.3.3.组织芯片组织芯片组织芯片组织芯片 tissue micro-arraytissue micro-arraytissue mi
4、cro-arraytissue micro-array基因水平：基因水平：基因水平：基因水平：1.1.1.1.原位分子杂交原位分子杂交原位分子杂交原位分子杂交( ( ( (组织、染色体组织、染色体组织、染色体组织、染色体Fish)Fish)Fish)Fish) in situ hybridization in situ hybridization in situ hybridization in situ hybridization2.2.2.2.基因芯片基因芯片基因芯片基因芯片 gene chipgene chipgene chipgene chip3.3.3.3.组织芯片组织芯片组织芯片组
5、织芯片 tissue micro-arraytissue micro-arraytissue micro-arraytissue micro-array4.PCR4.PCR4.PCR4.PCR及测序等及测序等及测序等及测序等 PCR and sequencePCR and sequencePCR and sequencePCR and sequence3 3. .一、免疫组化标准化问题探讨本世纪本世纪本世纪本世纪70707070年代问世年代问世年代问世年代问世抗体种类急速增加，交叉反应存在抗体种类急速增加，交叉反应存在抗体种类急速增加，交叉反应存在抗体种类急速增加，交叉反应存在免疫组化技术方法
6、不断问世免疫组化技术方法不断问世免疫组化技术方法不断问世免疫组化技术方法不断问世使用的试剂或实验室条件不同使用的试剂或实验室条件不同使用的试剂或实验室条件不同使用的试剂或实验室条件不同操作人员的熟练程度操作人员的熟练程度操作人员的熟练程度操作人员的熟练程度病理医生的结果判定水平及关联知识病理医生的结果判定水平及关联知识病理医生的结果判定水平及关联知识病理医生的结果判定水平及关联知识解决标准化的问题势在必行解决标准化的问题势在必行解决标准化的问题势在必行解决标准化的问题势在必行4 4. .(一)方法的选择目前常用的免疫组化方法有：目前常用的免疫组化方法有：PAPPAP、ABCABC、APAAPA
7、PAAP法、法、S-PS-P方法等方法等各种方法只要运用得好，都会得到满各种方法只要运用得好，都会得到满意意的结果的结果建议：在我们省内都采用建议：在我们省内都采用S-PS-P法法5 5. .S-P法的优点 方法统一方法统一 有配套的即用型抗体、试剂盒和显色试剂盒有配套的即用型抗体、试剂盒和显色试剂盒 一般一般2-32-3小时小时(30(30-60-60) )，而，而ABCABC法需法需1 1天，分天，分 子量小子量小(60KD)(60KD)，穿透力强，穿透力强 灵敏性高，特异性强，灵敏性高，特异性强，4 4个亚基都能于二抗上的生个亚基都能于二抗上的生 物素结合，而且结合键强物素结合，而且结合
8、键强 背景低，非特异性反应少，等电点为背景低，非特异性反应少，等电点为6.56.5，接近于，接近于 中性，不与内源性凝集素样物质结合中性，不与内源性凝集素样物质结合, ,而而ABCABC法为法为10106 6. .S-P法与ABC法的区别S-PS-P法：法：StreptaridinStreptaridin peroxidaseperoxidase conjugataedconjugataed method method 链霉菌素抗生物素蛋白链霉菌素抗生物素蛋白过氧化物酶连接法过氧化物酶连接法ABCABC法：法： AvidinAvidin-Biotin -Biotin peroxidaseper
9、oxidase complex method complex method 卵白素亲生物素卵白素亲生物素过氧化酶复合物法过氧化酶复合物法S-PS-P法中的链霉菌素抗生物素蛋白取代了法中的链霉菌素抗生物素蛋白取代了ABCABC方法中的卵白方法中的卵白 素和生物素素和生物素即：卵白素中的即：卵白素中的4 4个亚基一方面与第二抗体上的生物素结个亚基一方面与第二抗体上的生物素结 合，另一方面还与复合物中的生物素结合合，另一方面还与复合物中的生物素结合7 7. .一一抗抗二二抗抗卵卵白白素素生生物物素素过过氧氧化化物物酶酶A-B-C一一抗抗二二抗抗链菌素抗生物素链菌素抗生物素蛋白蛋白过氧化过氧化物酶物酶
10、ABCABC法：法：S-PS-P法法：8 8. .(二) 固定、包埋固固定定液液：一一般般10%10%中中性性缓缓冲冲福福尔尔马马林林，PH7.3-7.4(PBSPH7.3-7.4(PBS配制配制) )固固定定时时间间：应应少少于于2424小小时时，固固定定时时间间越越长长，抗原丢失越多抗原丢失越多固固定定液液量量或或组组织织块块大大小小：组组织织为为1/31/3，固固定定液液2/32/3大体标本：切下一块固定大体标本：切下一块固定9 9. .包包埋埋：起起初初免免疫疫组组化化对对蜡蜡温温的的要要求求很很严严，温温度度一一高高会会严严重重影影响响结结果果。现现在在由由于于抗抗体体质质量量的的提
11、提高高，以以及及抗抗原原恢恢复复方方法法的的问问世世，多多数数人人又又忽忽视视了了蜡蜡温温的的问问题题。个个人人认认为为：尽尽管管有有抗抗原原修修复复方方法法，但但不不如如开开始始就就不不使使抗抗原原破破坏坏，另另外外，蜡蜡温温过过高高，组组织织变变脆脆，不不易易切切成成大大片片，容易脱片。因此，要控制蜡温在容易脱片。因此，要控制蜡温在6565以下以下1010. .(三) 抗原修复(抗原暴露、抗原复原)组织中存在某种抗原、但用特异性抗体，却为阴性组织中存在某种抗原、但用特异性抗体，却为阴性其原因是：其原因是：固固定定、包包埋埋后后部部分分抗抗原原决决定定簇簇与与核核酸酸或或其其它它蛋蛋白白抗抗
12、原发生了交联，形成网络原发生了交联，形成网络固定液中的醛基本身也会发生交联，而封闭抗原固定液中的醛基本身也会发生交联，而封闭抗原1111. .抗原修复的目的：就就是是要要打打开开交交联联，暴暴露露抗抗原原决决定定簇簇，有有利利于于抗抗原原抗抗体体反反应，抗原修复的方法从大的方面讲有两种应，抗原修复的方法从大的方面讲有两种：只限于需要抗原修复的只限于需要抗原修复的抗体抗体热热微波微波高压锅高压锅水浴锅水浴锅酶酶 消消化化胰蛋白酶胰蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶1212. .热修复： 0.01M0.01M柠檬酸缓冲液，柠檬酸缓冲液，PH=6.0PH=6.0，9595，1010分钟分钟注意：注意：脱片多脱片
13、多多聚多聚L L赖氨酸赖氨酸 干片干片 选医用微波炉选医用微波炉酶消化：1.1.细胞内抗原细胞内抗原0.1%0.1%胰蛋白酶胰蛋白酶 20203737 2. 2.间质抗原间质抗原4%4%胃蛋白酶胃蛋白酶3737，4-84-8小时小时1313. .( (八八) )免疫组织化学的发展免疫组织化学的发展1. 1. 免疫免疫PCRPCR：主要用于临床生物分子检测方面：主要用于临床生物分子检测方面 血清血清(Ag)(Ag)电泳电泳+ +AbAb+ +无关引物扩增无关引物扩增显色显色 意意义义：1. 1. 原原来来较较弱弱、水水平平较较低低的的酶酶等等，用用免免疫疫PCRPCR就可以检测出来就可以检测出来
14、 2. 2. 需要较长或一定时间才能查出来需要较长或一定时间才能查出来用免疫用免疫PCRPCR法，就可提前查出来法，就可提前查出来如：病毒性心肌炎、血肿如：病毒性心肌炎、血肿CPKCPK检测检测 心梗早期心肌酶谱的检测等心梗早期心肌酶谱的检测等心梗预报：心绞痛心梗预报：心绞痛一般认为没有酶一般认为没有酶 谱改变，设想用免疫谱改变，设想用免疫PCRPCR就可能发现改变就可能发现改变1414. .2. 2. 原位免疫原位免疫PCRPCR在组织切片上有定位在组织切片上有定位 Ag+Ab1+Ab2Ag+Ab1+Ab2卵卵白白素素洗洗净净生生物物素素标标记记的的DNADNA片片断断洗洗净净原原位位PCR
15、PCR扩扩增增洗洗净净ACBACB或或S-PS-P显色显色 特点：特点：提高阳性率提高阳性率 定位好定位好1515. .2. 2. 扩增扩增：Total: 25lTotal: 25l PCR buffer 2.5l PCR buffer 2.5l mixed mixed dNTPdNTP 2.0l 2.0l dH dH2 2O 16.375lO 16.375l primer 1 1.0l primer 1 1.0l primer 2 1.0l primer 2 1.0l TaqTaq 0.125l 0.125l DNA template 2.0l DNA template 2.0l94 94
16、2525” 55 55 2525” 72 72 4040” 30 30 cyclescycles1616. .3. 3. AgaroseAgarose 2-5% 2-5%，用，用1 1TBETBE电泳电泳 扩增后液扩增后液 5l + 1l loading buffer5l + 1l loading buffer 溴化乙淀染色溴化乙淀染色 2020，UVUV照射下确认泳带照射下确认泳带照相照相4. DNA4. DNA收集收集 RECOCHIPRECOCHIP法法1717. .三、三、Western BlottingWestern Blotting1. 1. 提取蛋白提取蛋白 500l500l的的
17、hypotonic hypotonic buffer buffer + + 组组织织2mm2mm3 3匀匀浆浆器器粉碎粉碎 冰上放置冰上放置3030 15000 15000转转/ /分，分，44，3030。上清：细胞质蛋白，上清：细胞质蛋白，+250l 3+250l 3loading loading bufferbuffer沉淀物沉淀物 + 750l + 750l loading buffer loading buffer再次粉碎、离心，上清为细胞膜蛋白再次粉碎、离心，上清为细胞膜蛋白 2-2-氢硫基乙醇氢硫基乙醇 7.5l(1/100)7.5l(1/100)混合混合 9595沸腾沸腾5 5分
18、钟分钟 冰上放置冰上放置1818. .2. 2. 蛋白定量蛋白定量 标准蛋白浓度制备：标准蛋白浓度制备：BSABSA，0 0，0.50.5，1 1，2mg/ml2mg/ml 比色：测定系数比色：测定系数 换算成含量换算成含量 计算出每个样品加样量计算出每个样品加样量3. 3. 电泳电泳 丙烯酰胺丙烯酰胺 上部胶、下部胶上部胶、下部胶 markermarker样品样品4. 4. 转膜转膜5. 5. 洗膜洗膜 一抗、二抗一抗、二抗 显色或自显影显色或自显影1919. .四、组织芯片四、组织芯片(Tissue Micro-Array, TMA)(Tissue Micro-Array, TMA) 组组
19、织织芯芯片片技技术术是是一一种种特特殊殊生生物物芯芯片片技技术术，它它是是将将几几十十个个或或几几百百个个不不同同个个体体的的临临床床组组织织标标本本按按预预先先设设计计的的顺顺序序排排列列在在一一张张玻玻片片进进行行分分析析研研究究，是是一一种种高高通通量量、多多样样本本的的分分析析工工具具。它它使使科科研研人人员员第第一一次次有有可可能能同同时时对对几几百百甚甚至至上上千千种种正正常常或或疾疾病病以以及及疾疾病病发发展展不不同同阶阶段段的的自自然然病病理理生生理理状状态态下下的的组组织织样样本本，进进行行某某一一个个或或多多个个特特定定的的基基因，或与其相关的表达产物的研究。因，或与其相关
20、的表达产物的研究。2020. .应用应用l免疫组化免疫组化lDNADNA或或RNARNA原位杂交原位杂交lFISHFISHl原位原位PCRPCR低密度芯片低密度芯片(50-70(50-70个标本个标本) )、高密度芯片、高密度芯片(500(500个标本个标本) )2121. .制作过程制作过程1. 1. 组织处理：固定、石蜡包埋、组织处理：固定、石蜡包埋、HEHE染色、组织定位染色、组织定位2. 2. 组织打孔组织打孔/ /阵列仪钻取组织，直径阵列仪钻取组织，直径0.6mm0.6mm3. 3. 制制作作阵阵列列蜡蜡块块，将将钻钻取取的的组组织织按按设设定定的的位位置置放放入入空白蜡块内空白蜡块内4. 4. 切切片片厚厚度度为为5m5m，以以4040为为宜宜，5656烤烤片片3 3小小时时，备用备用2222. .好的组织芯片好的组织芯片1. 1. 制片过程中组织片不移位、不脱落制片过程中组织片不移位、不脱落2. 2. 组织样本的厚度以组织样本的厚度以3mm3mm为佳为佳3. 3. 每张组织芯片为每张组织芯片为5m5m4. 4. 一个芯片蜡块可切片一个芯片蜡块可切片100-200100-200张张注注：0.6mm0.6mm组组织织片片上上约约有有30,00030,000个个细细胞胞，2mm2mm的组织芯片约有的组织芯片约有100,000100,000个细胞个细胞2323. .
