《结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀课件（74页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、结核病细菌学检验结核病细菌学检验(jinyn)(jinyn)的标准的标准化与新诊断技术进展化与新诊断技术进展王甦民2012年4月第一页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀展海淀强化(qinghu)(qinghu)结核病实验室诊断标准化的必要性1、全球结核病控制的三大挑战：耐药结核病、HIV/艾滋病合并结核病、移民(ymn)（流动人口）2、我国结核病疫情依然严重3、目前结核病实验室诊断技术的不足第二页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀第三页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术
2、进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀分类分类(fn li)(fn li)结核分枝杆菌属原核生物界、厚壁菌门、裂植菌纲、放线菌目、分枝杆菌科的分枝杆菌属，分枝杆菌属种类甚多，目前已命名的有200多种，一般可分为缓慢生长(shngzhng)和快速生长(shngzhng)两大类。第四页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀结核结核(jih)(jih)(jih)(jih)分枝杆菌特点分枝杆菌特点q结核菌生长缓慢，在一般培养基上分裂(fnli)一代需要10-20小时q细胞壁厚度为1035nm，较一般细菌的细胞壁厚，含有大量脂类，具有坚韧
3、性和疏水性。q抗酸性是分枝杆菌的重要特征。第五页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀结核病细菌学检查的重要结核病细菌学检查的重要(zhngyo)(zhngyo)作作用用细菌学检查细菌学检查(jinch)是结核病最客观、最科学和是结核病最客观、最科学和最重要诊断方法和流行病学研究工具。因此最重要诊断方法和流行病学研究工具。因此结核病的实验室检验仍然面临着较多的问题。结核病的实验室检验仍然面临着较多的问题。第六页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀细菌学检验存在(cnzi)(cnzi
4、)的问题不易于标准化操作误差较大（可达到30%） 1、个人操作误差 2、标本性状 3、标本来源对结果的理解差异可影响检验结果对临床治疗(zhlio)的参考或指导意义。第七页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀主要主要(zhyo)(zhyo)的细菌学检验技术的细菌学检验技术1 1、痰涂片抗酸染色、痰涂片抗酸染色(rns)(rns)(rns)(rns)、镜检技术、镜检技术2 2、分枝杆菌分离培养技术、分枝杆菌分离培养技术3 3、分枝杆菌快速培养技术、分枝杆菌快速培养技术4 4、药物敏感性实验技术、药物敏感性实验技术5 5、分枝杆菌菌种鉴定技
5、术、分枝杆菌菌种鉴定技术第八页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀展海淀标准标准(biozhn)(biozhn)(biozhn)(biozhn)的痰涂片抗酸染色、镜检技的痰涂片抗酸染色、镜检技术术标本的收集，特别是痰标本的采集、保存制片和染色过程的标准化读片操作的熟练程度和标准化对结果(jigu)的理解第九页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀痰标本痰标本(biobn)(biobn)的采集、保存和运送的采集、保存和运送k脓样、干酪样或脓性粘液样痰为合格标本，痰量应为脓样、干酪样或脓性粘
6、液样痰为合格标本，痰量应为3-53-5毫升。毫升。k难以获得合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注明标本性状，难以获得合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注明标本性状，以供分析结果时参考。以供分析结果时参考。k容器上应注明与检验单一致的病人姓名、编号及日期。容器上应注明与检验单一致的病人姓名、编号及日期。k不能及时检验的痰标本应置不能及时检验的痰标本应置4C4C冰箱保存，冰箱保存，k如需转运如需转运(zhun yn)(zhun yn)，外送前要认真核对检验单与痰瓶上标注，放在，外送前要认真核对检验单与痰瓶上标注，放在专用的转运专用的转运(zhun yn)(zhun yn)箱内运送。箱内运送。第
7、十页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀标本标本(biobn)(biobn)的采集的采集标本留取方法痰标本的留取应在医护人员的指导下进行。医护人员应告知病人如何咳痰，合格的痰标本是深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物，并说明唾液检出的可能性很小。检验人员检查痰标本的性状(xngzhung)，并在登记本和检验报告单上注明（按干酪痰、血痰、黏液痰和唾液分类登记）。第十一页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀如何(rh)(rh)正确留痰查痰对于结核病的诊断是非常重要的，通过痰检可以知道您是
8、否痰中带菌。如果痰中带有结核菌说明您患有肺结核，具有(jyu)传染性，应该及时遵医嘱治疗。 送检痰标本的质量直接影响检验结果的准确性。请您一定按照下列要求和方法留取合格的痰标本。每个痰盒应分别留取12口痰，请不要将1口痰分开放到2或3个痰盒中。正确的咳痰方法： 1、咳嗽前应缓慢地深吸气，吸气后稍屏气片刻。 2、躯干略向前倾，两侧手臂屈曲，平放在两侧胸壁下部，内收并稍加力。 3、咳嗽时腹肌用力快速收缩，使腹壁内陷。一次深吸气，可连续咳嗽三声。 4、停止咳嗽后，收缩腹肌将剩余的气体尽量呼尽。 5、重复缓慢吸气动作或平静呼吸片刻，准备再次咳嗽的动作。* 注意：部分人如果忽然深吸气容易诱发咳嗽，您可以
9、尝试缓慢或分几次吸气，争取肺泡内充分充气，以增加咳嗽的效率。在这一过程中，要注意动作的连贯性，一气呵成。同时，也可以叩击前胸，或由家属协助叩击后背胸壁。这样震动支气管内的分泌物，能够增加咳嗽排痰的力度。第十二页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀直接直接(zhji)(zhji)痰涂片检查法痰涂片检查法萋尔-尼尔逊氏（ZiehlNeelsen）抗酸染色法 （热染法）第十三页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀细菌学常规细菌学常规(chnggu)(chnggu)检查检查 直接涂片法直
10、接涂片法操作操作(cozu)(cozu)流程流程涂涂痰痰膜膜自自然然干干燥燥复复红红加加热热初初染染5 5分分钟钟自自然然干干燥燥镜镜检检流流水水冲冲洗洗美美兰兰复复染染3030秒秒盐盐酸酸酒酒精精脱脱色色流流水水冲冲洗洗流流水水冲冲洗洗第十四页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀载玻片载玻片（一一）新新载载玻玻片片必必须须经经95%95%乙乙醇醇脱脱脂脂，检检查查无无划划痕痕后后 方方可使用。可使用。（二）一张载玻片只能涂抹（二）一张载玻片只能涂抹1 1份痰标本。份痰标本。（三）载玻片只允许一次性使用，严禁清洗后重复用于（三）载玻片只
11、允许一次性使用，严禁清洗后重复用于AFBAFB检查。检查。（四四）载载玻玻片片正正面面一一侧侧1/31/3处处标标注注实实验验室室序序号号( (如如使使用用的的载载玻玻片片一一端端无无磨磨砂砂面面，必必须须使使用用玻玻璃璃刻刻刀刀注注明明编编号号；如如使使用用的的载载玻玻片片一端有磨砂面，可使用一端有磨砂面，可使用2B2B铅笔在磨砂面上直接书写铅笔在磨砂面上直接书写) )。（五五）载载玻玻片片正正面面另另一一侧侧2/32/3中中央央处处均均匀匀(jnyn)(jnyn)涂涂抹抹成成面面积积为为1020 mm1020 mm的卵圆形痰膜。的卵圆形痰膜。 第十五页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化
12、与新技术进结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀展海淀染色染色(rns)(rns)（一）严格按照操作规范完成（一）严格按照操作规范完成(wn chng)(wn chng)染色程序。染色程序。（二二）染染色色后后的的痰痰膜膜应应呈呈均均匀匀亮亮蓝蓝色色，无无红红色色斑块。斑块。（三三）将将染染色色后后的的玻玻片片放放置置在在报报纸纸上上，如如果果透透过过痰痰膜膜不不能能分分辨辨报报纸纸上上的的文文字字，则则表表明明该该玻片涂抹过厚，或染色过程有误。玻片涂抹过厚，或染色过程有误。（四四）染染色色后后的的痰痰膜膜脱脱落落部部分分应应小小于于整整个个涂涂抹抹面积的面积的10%10%。 第十六页，共七
13、十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀展海淀（一一）为为防防止止抗抗酸酸杆杆菌菌的的交交叉叉污污染染，严严禁禁油油镜镜头直接接触玻片上的痰膜。头直接接触玻片上的痰膜。（二）仔细观察（二）仔细观察300300以上的视野。以上的视野。（三三）每每个个工工作作日日，一一名名镜镜检检人人员员的的玻玻片片阅阅读读量一般不应超过量一般不应超过2525张。张。（四四）连连续续(linx)(linx)阅阅读读10101212张张玻玻片片后后，应应休休息息2020分钟左右。分钟左右。镜检读片镜检读片第十七页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进结核病细菌学检
14、验的标准化与新技术进展海淀展海淀痰涂片痰涂片(t pin)抗酸菌浓度与阳性结果机率抗酸菌浓度与阳性结果机率 检出菌数检出菌数 每毫升标本估算菌数每毫升标本估算菌数 阳性结果机率阳性结果机率0/100或更多视野或更多视野 1000 101-2/300视野视野 5000 - 10000 501-9/100视野视野 约约30000 801-9/10视野视野 约约50000 90（cv）1-9/每视野每视野 约约100000 96.2（cv）10或更多或更多/每视野每视野 约约500000 99.95（cv）第十八页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展
15、海淀海淀查痰次数与阳性机率关系查痰次数与阳性机率关系为什么诊断前强调为什么诊断前强调(qing dio)三涂两培（三涂两培（3S 2C） 1 2 3 4 5第十九页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀细菌学常规细菌学常规(chnggu)(chnggu)检查检查 直接涂片法直接涂片法显微镜检报告方式：显微镜检报告方式：0 0条条/300/300视野：视野： 萋萋- -尼氏抗酸杆菌阴性尼氏抗酸杆菌阴性(ynxng)(ynxng)1-81-8条条/300/300视野：实报菌数视野：实报菌数3-93-9条条/100/100视野：萋视野：萋- -
16、尼氏抗酸杆菌阳性（尼氏抗酸杆菌阳性（+ +）1-91-9条条/10/10视野：视野： 萋萋- -尼氏抗酸杆菌阳性（尼氏抗酸杆菌阳性（2+2+）1-91-9条条/1/1视野：视野： 萋萋- -尼氏抗酸杆菌阳性（尼氏抗酸杆菌阳性（3+3+） 1010条条/1/1视野：视野： 萋萋- -尼氏抗酸杆菌阳性（尼氏抗酸杆菌阳性（4+4+）第二十页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀细菌学常规检查细菌学常规检查 直接直接(zhji)(zhji)涂片涂片法法注意事项：注意事项：选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分涂片阳性率较选择痰标本中脓性、血样、干酪
17、样的部分涂片阳性率较高；高；一张玻片只涂一份标本，玻片一次性使用，防止交叉一张玻片只涂一份标本，玻片一次性使用，防止交叉污染；污染；打开痰盒、涂抹痰膜时容易产生气溶胶，应注意正确打开痰盒、涂抹痰膜时容易产生气溶胶，应注意正确操作和自身防护；操作和自身防护；石炭酸复红初染时必须石炭酸复红初染时必须(bx)加温。加温。第二十一页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀细菌学常规检查细菌学常规检查(jinch)(jinch) 直接涂片法直接涂片法直接涂片法直接涂片法优点：优点：是直接发现原菌的检查方法，适用于痰、尿、便、体是直接发现原菌的检查方法
18、，适用于痰、尿、便、体液、组织等几乎一切标本，有重要的临床诊断价值。液、组织等几乎一切标本，有重要的临床诊断价值。是发现和确定传染源的重要途径，是考核和评价疗效是发现和确定传染源的重要途径，是考核和评价疗效的重要指标，有重要的流行病学意义；的重要指标，有重要的流行病学意义；操作简便，价格低廉，适于各级实验室开展；操作简便，价格低廉，适于各级实验室开展；快速，数小时快速，数小时(xiosh)可报告结果。可报告结果。第二十二页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀细菌学常规细菌学常规(chnggu)(chnggu)检查检查 直接涂片法直接涂片
19、法缺点：缺点：敏感性低：通常每毫升含敏感性低：通常每毫升含5000-100005000-10000条以上抗酸菌条以上抗酸菌才可得到阳性结果才可得到阳性结果(ji gu)(ji gu)；特异性较低：只能报告特异性较低：只能报告“抗酸菌阳性抗酸菌阳性”，不能区分结核，不能区分结核和非结核分支杆菌；和非结核分支杆菌；镜下只能观察菌体形态，不能辨别死、活菌。镜下只能观察菌体形态，不能辨别死、活菌。第二十三页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀涂片镜检质量保证系统涂片镜检质量保证系统(xtng)(xtng) 室内质控室内质控室内质控室内质控标本收
20、集、染色液制备、涂片染色程序、显微镜标本收集、染色液制备、涂片染色程序、显微镜镜检、显微镜的保养和维护、结果的报告镜检、显微镜的保养和维护、结果的报告(bogo)(bogo)和和登记、痰片的分类保存等应按照国家参比实验室登记、痰片的分类保存等应按照国家参比实验室的统一标准严格进行操作。的统一标准严格进行操作。复查方式：复查方式：自查：试验员当日对已查涂片抽样复查。自查：试验员当日对已查涂片抽样复查。互查：由本实验室其他试验员抽查当日互查：由本实验室其他试验员抽查当日10%10%涂片。涂片。第二十四页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀涂
21、片涂片(t pin)(t pin)镜检质量保证系统镜检质量保证系统室间质控室间质控以现场和非现场督导为主要方式。以现场和非现场督导为主要方式。现场督导：质控实验室人员赴被质控实验室就实现场督导：质控实验室人员赴被质控实验室就实验室布局、安全防护、污染物处理、涂片验室布局、安全防护、污染物处理、涂片(t pin)染染色操作、显微镜维护状况、日常实验记录等进行色操作、显微镜维护状况、日常实验记录等进行考核和指导，并以盲法、按比例抽取涂片考核和指导，并以盲法、按比例抽取涂片(t pin)复复查。查。非现场督导：防治人员依据盲法、按比例的原则抽取涂非现场督导：防治人员依据盲法、按比例的原则抽取涂片交实
22、验室复查。片交实验室复查。第二十五页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀复检玻片样本量复检玻片样本量1.1.样样本本量量估估算算：盲盲法法复复检检的的关关键键是是复复检检结结果果(ji (ji gu)gu)能能否否真真正正代代表表被被督督导导实实验验室室的的实实际际水水平平。世世界界卫卫生生组组织织推推荐荐80%80%灵灵敏敏度度、100%100%特特异异性性（针针对对阴阴性性玻玻片片）、误误差差为为0 0的的可可接接受受数数量量以以及及95%95%可可信信限限样样本本量量表表，可可以以极极大大地地减减少少样样本本量量，保保证证了了盲盲
23、法法复复检检在在统统计计学学意意义义上上可可以以代代表表被被评评估估实实验验室室的的总体水平。总体水平。第二十六页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀复检样本量计算复检样本量计算复检样本量计算复检样本量计算(j sun)(j sun)表表表表上一年阴性上一年阴性玻片的总数玻片的总数 玻片阳性率玻片阳性率2.5%5.0%7.5%10.0%13.0%15.0%18.0%300185 129 101 80 67 59 50 400217 143 108 86 70 61 51 500243 154 114 89 71 62 52 700281
24、 167 121 92 75 65 54 1000318 180 128 96 76 66 55 2000376 197 135 100 79 68 56 5000423 208 141 103 80 69 57 10000441 213 142 104 80 69 5720000450 215 143 104 82 69 57第二十七页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀复检样本量计算复检样本量计算(j sun)(j sun)表说明：表说明： a a、玻玻片片阳阳性性率率：指指所所有有检检测测的的玻玻片片中中阳阳性性玻片的比例（平均阳
25、性率）。玻片的比例（平均阳性率）。b b、上上一一年年阴阴性性玻玻片片总总数数：每每年年玻玻片片的的总总数数减去全年减去全年(qun nin)(qun nin)阳性玻片数。阳性玻片数。c c、抽抽样样时时，当当上上一一年年阴阴性性玻玻片片数数量量和和玻玻片片阳阳性性率率不不在在选选择择点点，阴阴性性玻玻片片数数值值采采用用区间上限，玻片阳性率采用区间下限。区间上限，玻片阳性率采用区间下限。第二十八页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀复检结果复检结果(ji gu)(ji gu)评价评价盲盲法法复复检检的的目目的的不不是是为为了了验验证证
26、某某个个病病人人诊诊断断(zhndun)(zhndun)正正确确与与否否, ,而而是是评评价价整整个个实实验验室室操操作作水水平平。评评价价的的内内容容除除了了玻玻片片镜镜检检结结果果存存在在的的误误差差之之外外，还还包包括括检检查查标标本本的的质质量量（合合格格标标本本与与不不合合格格标标本本的的比比例例）、涂涂抹抹的的大大小小和和厚厚度度、染染色色质质量量如如何何等等, ,以以便便采取纠正措施，提高实验室的工作质量。采取纠正措施，提高实验室的工作质量。第二十九页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀1.误差分类：分为定性(dng xn
27、g)误差和定量误差（1 1）定性误差包括高假阳性和高假阴性）定性误差包括高假阳性和高假阴性高假阳性（高假阳性（High False Positive HFPHigh False Positive HFP）：）：阴性片被错误地判读为阴性片被错误地判读为2 2以上的阳性。以上的阳性。高假阴性（高假阴性（High False Negative HFNHigh False Negative HFN）：）：2 2以上的阳性玻片被错误地判读为阴性。以上的阳性玻片被错误地判读为阴性。第三十页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀（2 2）定量误差包括量
28、化误差、低假阳性和低假阴性）定量误差包括量化误差、低假阳性和低假阴性v量化误差（量化误差（Quantification Error Quantification Error ，QEQE）：同一张阳性玻）：同一张阳性玻片初检者和复检者阳性判断级别的差异。片初检者和复检者阳性判断级别的差异。v低假阳性（低假阳性（Low False Positive Low False Positive ，LFPLFP）：阴性玻片被）：阴性玻片被错误错误(cuw)(cuw)地判断为地判断为1 1及以下的阳性。及以下的阳性。v低假阴性（低假阴性（Low False NegativeLow False Negative
29、， LFN LFN）：）：1 1及以下及以下玻片被错误地判断为阴性。玻片被错误地判断为阴性。第三十一页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀常见常见(chn jin)(chn jin)“误差误差”原因原因误差类型误差类型 可能原因可能原因 建议建议 假阳性假阳性（FPFP） 1)1)例如染料沉渣或结晶等被误识为抗酸杆例如染料沉渣或结晶等被误识为抗酸杆菌菌2)2)原始报告后着色的抗酸杆菌退色原始报告后着色的抗酸杆菌退色1 1）对技术人员复训。）对技术人员复训。2 2）对假阳性玻片重新染色）对假阳性玻片重新染色并复检。并复检。 假阴性假阴性（
30、FNFN） 1 1）观察玻片的视野数量不足）观察玻片的视野数量不足2 2）镜检技术能力差）镜检技术能力差3 3）染色操作不规范（抗酸杆菌颜色暗淡、）染色操作不规范（抗酸杆菌颜色暗淡、背景对比不足或过高）背景对比不足或过高）4 4）显微镜存在问题）显微镜存在问题5 5）染液质量差）染液质量差 1 1、2 2、3 3）对技术人员复训）对技术人员复训4 4）现场检查显微镜工作状）现场检查显微镜工作状态态5 5）重新购置质量合格的染）重新购置质量合格的染料并重新配制染液料并重新配制染液 量化误差量化误差（QEQE） 1 1）观察玻片视野数量不足）观察玻片视野数量不足2 2）阳性玻片的分级报告标准掌握差
31、）阳性玻片的分级报告标准掌握差3 3）镜检技术能力差）镜检技术能力差4 4）显微镜存在问题）显微镜存在问题 1.2.31.2.3）对技术人员复训）对技术人员复训4 4）现场检查显微镜工作状）现场检查显微镜工作状态态 第三十二页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀实验室诊断(zhndun)(zhndun)的新进展1、扩大开展液体培养(piyng)和药敏试验2、引入现代分子生物学快速检测技术3、引入现代免疫学快速检测技术第三十三页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀1、现代分子生物学
32、检测(jinc)(jinc)主要技术实时(sh sh)荧光定量PCR环介导等温扩增基因检测 ( Loop ( Loop mediated isothermal amplificationmediated isothermal amplification， LAMP)LAMP)分子线性探针（分子线性探针（Hain Hain 技术）技术） (2008 (2008WHOWHO推推荐荐) )基因芯片技术基因芯片技术GeneXpert MTB/RIF GeneXpert MTB/RIF 快速诊断技术快速诊断技术第三十四页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进
33、展海淀海淀（1.1）聚合酶链反应（PCR）PCR诞生于1985年，由美国 Muliis等发明。PCR是一种根据脱氧核糖核酸（DNA）复制原理而设计的体外DNA或核糖核酸（RNA）扩增方法，由高温变性、低湿退火及适温延伸等反应组成一个周期，经过n个周期后，理论上可以获得2n双链DNA分子(fnz)，使DNA特定区段大量扩增。此检测技术灵敏度高、特异性强、简便、快速，但也存在假阴性、假阳性、污染等方面的问题，研究人员对其进行了不懈的研究，使该技术不断得到改善，新的PCR及其衍生技术不断建立。第三十五页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀实时
34、荧光实时荧光(ynggung)(ynggung)(ynggung)(ynggung)定量定量PCRPCR实时定量PCR(Real Time Quantitative PCR) 是指在PCR反应体系加入荧光基团，利用荧光积累能够监控PCR扩增的每一个循环，在靶扩增的同时可获得定量的结果.即在同一个反应体系内完成扩增和扩增产物的检测,从而省去了靶扩增后复杂(fz)的定量检测工作。第三十六页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀实时荧光实时荧光(ynggung)(ynggung)(ynggung)(ynggung)定量定量PCRPCR该技术(j
35、sh)的优势在于其扩增产物的自动和实时检测,减少了常规产物检测步骤,也减少了人工判断结果的主观性，提高了结果的客观性和可比较性。同时工作效率大大提高。研究发现，该方法的特异性和敏感性较普通有所提高。与Southern杂交和酶促化学发光技术检测的灵敏度相似,但要比酶促比色法提高10倍。第三十七页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀（1.2）环介导等温扩增基因(jyn)(jyn)检测( ( LoopmediatedisothermalamplificationLoopmediatedisothermalamplification， LAMP
36、)检测是连续等温进行的。扩增效率十分高，反应灵敏(ln mn)。采用4条引物，识别6个位点，特异性强。不需要特殊的试剂与仪器，总费用很低。反应不需要开盖，在一管内完成全部检测。利用Bst酶的链置换功能进行反应。加入反转录酶，可以完成的一步法检测。第三十八页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀PurificationforUltraRapidExtraction(PURE)(PURE)LAMP 方法方法(fngf)PURE 方法方法(fngf)等温反应高扩增效率高特异性实验周期短(几乎(jh)一个小时)简单去除核酸扩增抑制因子缩短处理时间
37、Pre-treatmentkitLAMPtestSampleLysisMixtureFilterDNA第三十九页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀LAMP检测(jinc)(jinc)阴性(ynxng)阳性(yngxng)不需要离心,等温,快速(整个过程只需一个小时)；DNA与SYBRGreen结合现示绿色，Bst聚合酶于30分钟到一个小时内可将毫微微克/毫升(fg/ml)（或500-100拷贝/毫升）的DNA或RNA扩增到10微克左右。第四十页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海
38、淀LAMP敏感度101001000NCcopies/reaction模板:纯化的TB基因组DNA反应(fnyng)条件:67,40min第四十一页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀LAMP结果(jigu)(jigu)分析仪器特点：1.LAMP检测专用，每隔6秒测定反应产物的浊度2.可以设定相应的反应条件与检测要求3.测定结果可直接输入电脑进行实时分析(fnx)4.检测结果（图像等）可以打印5.可同时检测32个样本，联管适用第四十二页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀（1.3）
39、、分子(fnz)(fnz)线性探针（Hain技术）原理：基于PCR扩增的检测方法。扩增后的产物与预先固化在膜上的特异性探针杂交，通过显色反应判断(pndun)结果，可以鉴定TB和NTM、鉴定TB复合群、快速检测RIF、INH、EMB、喹诺酮类、氨基糖苷类耐药性第四十三页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀 GenoType分支分支(fnzh)(fnzh)杆菌杆菌试剂盒系列盒系列GenoTypeMTBC （来自于培养（来自于培养标本的本的结核分枝杆菌复合群菌核分枝杆菌复合群菌种种间的的鉴定定(jindng)）GenoTypeMycobac
40、teria Direct（来自于病人（来自于病人标本的本的结核分枝杆核分枝杆菌复合群，非菌复合群，非结核分枝杆菌复合群的核分枝杆菌复合群的鉴定）定）GenoTypeMycobacterium CM（来自于培养物的（来自于培养物的结核分枝杆菌核分枝杆菌复合群，非复合群，非结核分枝杆菌的核分枝杆菌的鉴定）定）GenoTypeMycobacterium AS（来自于培养物的其他非（来自于培养物的其他非结核分枝杆菌的核分枝杆菌的鉴定）定）GenoTypeMTBDRplus （结核分枝杆菌利福平、异烟核分枝杆菌利福平、异烟肼耐耐药性性检测）GenoTypeMTBDRsl （结核分枝杆菌乙胺丁醇、核分枝杆
41、菌乙胺丁醇、喹诺酮类、氨基、氨基糖苷糖苷类耐耐药性性检测）第四十四页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀技术设备TwinCubator 手工(shugng)杂交仪第四十五页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀自动操作(cozu)(cozu)-全自动杂交仪GT-Blot48 或 GT-Blot 20第四十六页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀GenoType MTBDRplus结果结果(ji gu)MTBC及其对利福平和/
42、或异烟肼的耐药性第四十七页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀适用于培养物和痰液。 检测快速，对于直接采集的样本或阳性培养物在数小时后内即可完成检测； 检测INH单耐药型TB、MDR和XDR； 符合(fh)WHO推荐的线性探针分析标准。GenoType MTBDRplus/sl 优点点(yudin)第四十八页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀验证(ynzhng)(ynzhng)数据产品品目的目的材料材料靶点靶点敏感性敏感性 专属性属性 对照方法照方法 *GenoType Myc
43、obacterium CM普通分支杆菌的普通分支杆菌的鉴定定阳性的固体阳性的固体/液体培养物液体培养物DNA97 %93,5 %测序；序；生化技生化技术GenoType Mycobacterium AS其他菌种的其他菌种的鉴定定阳性的固体阳性的固体/液体培养物液体培养物DNA96 %94 %测序；序；生化技生化技术GenoType MTBC 结结核分支杆菌复合群的菌核分支杆菌复合群的菌种区分种区分阳性的固体阳性的固体/液体培养物液体培养物DNA100 %100 % 生化技生化技术；分子分子遗传学方学方法法GenoType MTBDRplus结结核分支杆菌复合群的核分支杆菌复合群的鉴鉴定及其定及
44、其对对利福平和利福平和/或异或异烟烟肼肼的耐的耐药药性性直接采集的直接采集的标标本（本（显显微微镜检查镜检查阳性，阳性，经过纯经过纯化）；化）；阳性的阳性的固体固体/液体培养物液体培养物DNA直接采集的直接采集的标标本本RMP: 96,8 %INH: 90,2 %固体固体/液体培养液体培养物物RMP: 98,7 %INH: 92 %直接采集的直接采集的标标本本RMP: 95%INH: 100 %固体固体/液体培养液体培养物物RMP: 100 %INH: 100 %传统传统的的药药敏敏试试验验 (DST)GenoType MTBDRsl结结核分支杆菌复合群的核分支杆菌复合群的鉴鉴定及其定及其对对
45、氟氟喹诺酮类喹诺酮类和和/或氨基糖苷或氨基糖苷类类/环肽环肽和和/或或乙胺丁醇的耐乙胺丁醇的耐药药性性直接采集的直接采集的标标本（本（显显微微镜检查镜检查阳性，阳性，经过纯经过纯化）；化）；阳性的阳性的固体固体/液体培养物液体培养物DNA 直接采集的直接采集的标标本本氧氟沙星：氧氟沙星： 88,9 %阿米卡星阿米卡星/卷曲霉素：卷曲霉素： 75 %乙胺丁醇：乙胺丁醇： 38,5 %固体固体/液体培养液体培养物物*氧氟沙星：氧氟沙星： 90,6 %阿米卡星阿米卡星/卷曲霉素：卷曲霉素： 84,8 %乙胺丁醇：乙胺丁醇： 69,2 %直接采集的直接采集的标标本本氧氟沙星：氧氟沙星： 100 %阿米
46、卡星阿米卡星/卷曲霉素：卷曲霉素： 100 %乙胺丁醇：乙胺丁醇： 100 %固体固体/液体培养液体培养物物氧氟沙星：氧氟沙星： 100 %阿米卡星阿米卡星/卷曲霉素：卷曲霉素： 100 %乙胺丁醇：乙胺丁醇： 100 %传统传统的的药药敏敏试试验验 (DST)GenoType Mycobacteria Direct结结核分支杆菌复合群核分支杆菌复合群鸟鸟分分支杆菌支杆菌M. avium、胞内、胞内分支杆菌分支杆菌M. intracellulare、堪、堪萨萨斯斯分支杆菌分支杆菌M. kansasii、玛玛尔尔摩分支杆菌摩分支杆菌M. malmoense的的鉴鉴定定经纯经纯化后的化后的直接采集
47、的直接采集的标标本本RNA涂片阳性涂片阳性样样本本97,5% 涂片阴性涂片阴性样样本本83,3 %涂片阳性涂片阳性样样本本99 %培养培养第四十九页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀结论(jiln)(jiln)DNA-Strip技术系列涵盖了分枝杆菌菌种鉴定、TB-复合群的区分和药敏试验。所有检测都采用通用(tngyng)试剂盒和相同的方案进行扩增和杂交。 所有检测均可在4-5小时内完成。本法适用于大样本量的检测（每天检测数百份样品）。第五十页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海
48、淀（1.4）、基因芯片(jynxnpin)(jynxnpin)技术科学的发展人类的进步要求进行大规模基因信息的解析 鉴于基因芯片的多种用途和其远大的发展前景，不少生命科学研究机构和生物技术公司都先后参与了这项技术的研究。据不完全统计目前仅国内就有十多家单位从事该技术的研究与开发工作，全世界估计至少有二三十家。它已象半导体技术一样成为一个(y )重要的产业方向。当前已正被广泛地应用于诸多领域，包括生物医学、临床诊断学和基因组学研究。第五十一页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀什么(shnme)(shnme)是基因芯片基因芯片指对数以千记
49、的DNA片段同时进行处理分析的技术，诸如基因组DNA突变谱和mRNA表达谱的检测(jin c)等（Trends in Biotechnology)。 该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。第五十二页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀基因芯片技术(jsh)(jsh)的主要特点技术操作简单自动化程高序列数量大检测效率高应用范围广成本(chngbn)相对低第五十三页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术
50、进展海淀海淀博奥分枝杆菌菌种鉴定(jindng)(jindng)试剂盒(DNA微阵列芯片法)主要分为样品制备、芯片反应和结果判读三部分。首先，将检测(jin c)菌的DNA从培养、分离纯化的菌株或者直接从临床样品中提取出来；然后，对样品中的靶基因进行扩增和荧光标记；接着，将扩增并荧光标记的基因序列与芯片上的探针进行杂交反应；最后芯片扫描成像，用配套软件进行判读。第五十四页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀芯片(xnpin)(xnpin)扫描结果1第五十五页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技
51、术进展海淀海淀临床(lnchun)(lnchun)验证第五十六页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀（1.5）GeneXpert MTB/RIF快速诊断(zhndun)(zhndun)技术Cepheid MTB/RIF: 可直接检测痰液，检可直接检测痰液，检测结核分支测结核分支(fnzh)杆菌的同时，鉴定是否有利杆菌的同时，鉴定是否有利福平耐药性，福平耐药性， 2小时出结果。小时出结果。GeneXpert检测平台采用实时荧光定量检测平台采用实时荧光定量PCR检测原理。检测原理。所有检测均无需提取核酸，手工操作时间不所有检测均无需提取核酸
52、，手工操作时间不超过超过2分钟。分钟。第五十七页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀GeneXpert最大程度简化(jinhu)(jinhu)TB检测！将痰液加入处理瓶，放置15分钟；将处理后的样品加入样品反应盒；将该盒子放置在GeneXpert中，轻松按下“开始”键；得到结果（2小时）：检测是否(shfu)含有结核分支杆菌的同时，可对利福平耐药性进行判读。第五十八页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀Xpert MTB/RIF检测检测(jin c)(jin c)操作步骤操作步骤
53、1、痰液加入处理(chl)瓶， 放置15分钟。2、取处理后的痰液 2mL加入Xpert反应 试剂盒3、将反应试剂盒放入 GeneXpert仪器， 点击“开始”（手工操作至此结束！手工操作至此结束！）4、自动过滤洗涤样品5、自动超声破碎，纯化 样品6、荧光定量PCR扩增7、巢氏PCR扩增8、自动结果判读 （MTB/RIF）第五十九页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀“Sample in. Answer out.”全自动操作完全封闭系统污染可能性小减少(jinsho)人为错误结果精确度高检测时间短无需(wx)专业技术人员和特殊实验室第六十
54、页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀研究人数研究人数 1,700 Patients秘秘鲁鲁、南非、阿塞拜疆、南非、阿塞拜疆( si bi jin)、 、印度印度涂片阳性涂片阳性(yngxng)样品：样品：灵敏性灵敏性98.2%,特异性特异性99.2%涂片阴性涂片阴性, 培养阳性样品：培养阳性样品：三次检测灵敏性三次检测灵敏性 90.2% 一次检测灵敏性一次检测灵敏性72.5% 对利福平耐药性检测：对利福平耐药性检测：灵敏性灵敏性97.6%,特异性特异性98.1%第六十一页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检
55、验的标准化与新技术进展海淀海淀结论(jiln)(jiln)GeneXpert检测Mtb简单、易于(yy)操作，对操作者技术要求不高：只需要把痰液、反应液加入仪器即可得出诊断报告；GeneXpert检测Mtb快速：整个过程大约2小时。GeneXpert检测Mtb对操作人员安全：整个检测过程全封闭、一次性完成。高灵敏性：BCG176 cfu/ml；H57Rv112 cfu/ml耐药性诊断：可对利福平耐药性进行检测第六十二页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀现代免疫学诊断现代免疫学诊断(zhndun)(zhndun)技术技术1、体液免疫诊断
56、技术：是利用结核分枝杆菌或其提取物抗原检测结核病患者血清抗体的方法。目前，通过检测抗结核杆菌的抗体(IgG)诊断结核病的商品化试剂盒已较多。采用(ciyng)的方法包括：酶联免疫吸附试验（ELISA)和免疫金标记技术的免疫层析法和胶体金标记的渗滤法等，采用(ciyng)的抗原也各不相同。第六十三页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀体液体液(ty)(ty)免疫学诊断技术的意义免疫学诊断技术的意义在国内应用较广泛，是结核病的辅助诊断方法之一,尤其对肺外结核、菌阴肺结核的诊断具有应用价值。不足之处：单独使用时，其检测的特异性和灵敏度都有些缺
57、点。目前国际上反对使用该项技术(jsh)的呼声在增加。原因主要是特异性问题。第六十四页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀2、细胞、细胞(xbo)(xbo)免疫学诊断技术免疫学诊断技术细胞免疫诊断技术应用较少，过去主要应用PPD皮试技术皮试技术，近年来英国和澳大利亚研制了ELISpot 、T-Spot技术和QFT-Gold 。此项技术用于感染情况的检测(jin c)是一项特异性较强、灵敏度较高很有希望的新技术。第六十五页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀酶联免疫斑点(ELISp
58、ot)技术 是检测细胞(xbo)分泌细胞(xbo)因子的一种实验方法，采用可定量的夹心ELISA方法，利用结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6 & CFP-10刺激和激活免疫活性细胞(xbo)使其产生IFN-，并检测IFN-的浓度变化进行诊断的方法。通过ELISpot酶联斑点分析系统对加底物后形成的斑点分析后得出结果。ELISpot具有较高的特异性和敏感性。第六十六页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀ELISPOT技术(jsh)(jsh)原理细胞免疫主要由T淋巴细胞发动，T淋巴细胞分成效应T淋巴细胞和记忆T淋巴细胞。记忆T淋巴细胞在首次
59、感染病原体后长期存在免疫系统中。当再次受到感染刺激后。这些记忆T淋巴细胞发出信号分子(fnz)并增殖成为效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞分泌细胞因子，如 干扰素(INF- )。所以无论是否有临床症状，检测效应T淋巴细胞在血中的水平可作为机体是否被感染的指标。第六十七页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀ELISPOT在结核病诊断(zhndun)(zhndun)中的应用在在MTBMTB潜伏感染诊断中的应用潜伏感染诊断中的应用早期诊断MTB潜伏感染对控制结核病意义重大。目前(mqin)诊断MTB潜伏感染仍沿用100年来使用的 TST，但 TS
60、T不能区分MTB感染患者和接种BCG的健康人以及感染环境中的分枝杆菌患者。Lalvani在土耳其检查了暴露于肺结核家庭环境中的908名健康儿童。皮试结果表明580名儿童患有潜伏性肺结核,需要进行药物治疗,以免转化为活动性肺结核;而ELISPOT结果发现只有380名儿童患有潜伏性肺结核。通过ELISPOT检测,只需要治疗380名儿童,而不是580名,但却能够预防同样数量的活动性肺结核病例发生。因此，ELISPOT 比TST筛选结核潜伏感染更有效,而且ELISPOT检测结果与MTB的接触程度相关性更强。第六十八页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展
61、海淀海淀 ELISPOT早期技术评估 英国Ewer等用ELISpot检测对结核分枝杆菌分泌的抗原有特异性反应的T淋巴细胞来诊断早期结核病。这项研究共纳入了结核流行区有不同程度结核病接触史的535名学生，结果显示结核菌素皮肤试验(TST)和ELISpot的一致性达89%(P0.0001)。但ELISpot与研究对象结核病接触程度之间的正相关性显著强于TST。在接种过BCG的儿童中，TST假阳性的可能性较大，而BCG接种对ELISpot结果没有影响。作者认为ELISpot可开始(kish)替代TST，这将使更多的人能在感染仍处于隐匿期时就可进行预防，而不至于发展成为严重的结核病。第六十九页，共七十
62、四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀ELISPOT法的优点(yudin)(yudin)(1)灵敏、特异，能从100万个细胞中测出1个分泌INF细胞；只有MTB和少数非结核分枝杆菌才会出现阳性反应，而BCG及多数非结核分枝杆菌因不分泌ESAT-6和CFP-10蛋白，因此本法能区别BCG接种出现的阳性反应。 (2)快速(kui s)：能早期诊断结核感染，检测全过程2天。 (3)应用面广：在肺结核、肺外结核及免疫抑制的结核患者均能检测。 (4)疗效评估：当结核菌被消灭后，效应T淋巴细胞即消失，测定效应T淋巴细胞也可检测机体是否清除了结核菌，进行临床疗
63、效评估 。第七十页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀ELISPOT技术(jsh)(jsh)的缺点细胞培养及抗原刺激时,有发生细菌污染的可能,以致实验失败; 实验过程步骤较多,实验人员需有一定的理论(lln)基础并经多次操作的培训方能胜任; 目前试剂价格比较昂贵。第七十一页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀结束语结核病准确、快速(kuis)的诊断是结核病防治人员多年期盼的。随着科技不断进步，今天企盼已经成为可能。经过不断的对现有技术的优化和继续努力开发更新的技术，相信未来的结核
64、病实验室诊断，一定可以最大限度的满足临床和防治工作的需要。第七十二页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀谢谢谢谢(xi xie)！第七十三页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀海淀内容(nirng)总结结核病细菌学检验的标准化与新诊断技术进展。5、重复缓慢吸气动作或平静呼吸片刻，准备再次咳嗽的动作。如使用的载玻片一端有磨砂面，可使用2B铅笔在磨砂面上直接书写)。以现场和非现场督导为主要方式。（1）定性误差包括高假阳性和高假阴性(ynxng)。5）重新购置质量合格的染料并重新配制染液。与Southern杂交和酶促化学发光技术检测的灵敏度相似,但要比酶促比色法提高10倍。固体/液体培养物*。谢谢第七十四页，共七十四页。结核病细菌学检验的标准化与新技术进展海淀
