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1、第十章第十章 临床分子生物学诊断临床分子生物学诊断（ Clinical Molecular Biology Diagnosis ）1学习内容学习内容v 了解流式细胞术及染色体检测在临床中的应用v 熟悉分子生物学常用技术及在临床诊断中的地位v 掌握基因诊断的定义及在临床诊断中的应用（重点）2分子生物学概念分子生物学概念 在在分分子子水水平平上上研研究究生生命命现现象象的的科科学学。通通过过研研究究生生物物大大分分子子( (核核酸酸、蛋蛋白白质质) )的的结结构构、功功能能和和生生物合成等方面内容，阐明各种生命现象的本质。物合成等方面内容，阐明各种生命现象的本质。正常生命现象本质正常生命现象本质
2、疾病诊断疾病诊断3 运用分子生物学的理论和技术，对来自人体的血液、骨髓、体腔液、排泄物、分泌物和组织细胞等标本进行各种检测，获得有关病原体、核酸及蛋白质改变等方面的实验信息，为疾病诊断、治疗方案选择、疗效监测、预后评估等提供客观依据，并为疾病的防治、健康普查与咨询等做出正确的评价。临床分子生物学检测概念临床分子生物学检测概念4Gene Diagnosis第一节第一节 基因诊断基因诊断5以DNA或RNA为检查对象，应用分子生物学技术，通过检查基因的结构或表达量的改变，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。遗传物质可以是外源性基因，也可以是内源性基因。一、基因诊断的定义：一、基因诊断的定义：6基因
3、诊断的主要内容基因诊断的主要内容基因突变分析基因突变分析基因连锁分析基因连锁分析基因表达分析基因表达分析病原体诊断病原体诊断7表型诊断（传统方法）表型诊断（传统方法）基因诊断基因诊断（一）诊断依据（一）诊断依据 疾病表型变化基因结构异常和表达异常（二）分类（二）分类 血液学诊断生化学诊断免疫学诊断微生物学诊断DNA诊断RNA诊断（三）特异性（三）特异性 表型改变在很多情况下是非特异性的利用分子杂交原理具有很高的特异性（四）敏感性（四）敏感性 相对较低诊断灵敏度高，标本只需微量，DNApg水平即可（五）早期诊断（五）早期诊断 因为表型改变往往出现较晚，难以早期诊断在表型改变之前，基因结构或表达已
4、发生改变，故往往可以早期诊断。二、基因诊断在诊断学中的位置二、基因诊断在诊断学中的位置8 基因诊断的基础是医学基础，专业基础是医学分子生物学和医学遗传学，不同的是我们在基因水平上研究：基因结构（解剖）、基因转录翻译等（生理）、基因结构异常（病理），基因表达异常（病生），然后主要应用分子生物学技术手段进行基因诊断。基因诊断遵循诊断学的基本原则基因诊断遵循诊断学的基本原则基因诊断是诊断学的基因诊断是诊断学的续写续写，是诊断学的，是诊断学的新篇章新篇章91.1.染色体数量变异染色体数量变异：包括整倍体和非整倍体2.2.染色体结构变异：染色体结构变异：染色体在体内外因素作用下，发生断裂 和愈合过程中的
5、异常改变。三、遗传变异三、遗传变异缺失：缺失：指染色体部分丢失，主要有末端和中间缺失两种倒位：倒位：指一条染色体发生两处断裂，中间部分颠倒顺序再连接易位：易位：某个染色体断片位置移到另一处或另一个染色体的新位 置上插入插入：两处断裂产生的中间一段染色体转移到同一染色体或另 一条染色体的一个断裂处并重新连接重复重复：染色体中增加的额外染色体成分，是染色体个别区带或 片段的重复10转换：转换：指DNA上发生的单个碱基的置换，一种嘌呤被另一种嘌呤所置换；或一种嘧啶被另一种嘧啶所置换。颠换：颠换：指一种嘌呤被另一种嘧啶所置换，或一种嘧啶被另一种嘌呤所置换。缺失：缺失：指DNA链被删除一个或多个碱基对，
6、常引起严重的表型改变。插入：插入：指DNA链中插入一对或几对碱基。四、基因突变四、基因突变指DNA中核苷酸排列顺序或组成发生的变化（一）按基因突变性质划分（一）按基因突变性质划分突变可分为长度变化和点突变，后者又分为两种：转换和颠换111错义突变：错义突变：DNA中核苷酸发生置换后，改变了遗传密码，使一种氨基酸变成另一种氨基酸，影响到所合成蛋白质的结构和功能。2无义突变：无义突变：当DNA突变后，使原来编码某一氨基酸的密码子变成终止密码子时，多肽链停止合成，提前释放出不完全的蛋白质，造成功能丧失。3同义突变：同义突变：指由于遗传密码是兼并的，决定一种氨基酸的密码子常常不止一个，因此DNA中某些
7、碱基置换只造成三联密码中第三个核苷酸发生改变，不改变氨基酸。4移码突变移码突变：即DNA链中插入或缺失一个或多个碱基对后，使读码格式发生改变，自突变点3方向以后的一系列密码都改变，造成肽链大范围错误。（二）按基因突变结果划分（二）按基因突变结果划分根据突变发生的位置和突变性质，会使遗传密码的阅读框和蛋白质翻译发生变化，可分为：12五、基因诊断常用技术五、基因诊断常用技术核酸分子杂交核酸分子杂交DNA序列测定序列测定聚合酶链反应聚合酶链反应连接酶链式反应连接酶链式反应单链构象多态性分析单链构象多态性分析限制性片段多态性分析限制性片段多态性分析单核苷酸多态性单核苷酸多态性DNA芯片技术芯片技术So
8、uthern、Northern印迹杂交、斑点杂交、原位杂交13（一）核酸分子杂交技术（一）核酸分子杂交技术核酸分子杂交是指两条互补单链核酸（核酸分子杂交是指两条互补单链核酸（DNA或或RNA）在）在一定条件下按碱基互补原则退火形成双链的过程一定条件下按碱基互补原则退火形成双链的过程特点：特点：分子杂交的基础是碱基对之间非共价键形成稳定的双链区杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA之间进行都采用了同位素或非同位素标记的探针14待测核酸制备待测核酸制备滤膜上核酸滤膜上核酸固化固化杂杂 交交去除未参与杂交的探针去除未参与杂交的探针检检 测测 杂杂 交交 信信 号号 制备探针核酸片段制
9、备探针核酸片段探探 针针 标标 记记加入标记核酸探针加入标记核酸探针核酸分子杂交的流程示意图核酸分子杂交的流程示意图151. Southern印迹法印迹法 是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片段，而且能进行分子量大小测定，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。主要步骤：主要步骤：不同来源DNA样品（限制性内切酶切割）凝胶电泳分离碱变性使DNA解离成单链毛细管虹吸或电转移法到硝酸纤维素膜洗涤、凉干、80烤箱中加温2小时用于杂交探针于100变性处理显色16斑点杂交结果斑点杂交结果2. Northern印迹法印迹法 用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析同Southern杂
10、交注意RNA酶的处理电泳须在含甲醛或乙二醛的变性凝胶中进行主要步骤：主要步骤：3. 斑点杂交斑点杂交 Dot Blotting 用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及半定量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高。17组织或细胞的原位杂交，是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，并可显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。4. 原位杂交原位杂交 In Situ Hybridization 18确定DNA双股链上每一个独立结构单元或碱基的确切顺序
11、的过程（二）（二）DNA序列测定序列测定DNA测序的方法测序的方法链终止法测序化学降解法测序自动化测序（DNA Sequencing）191、链终止法测序、链终止法测序基本原理基本原理: 在合成与单链DNA互补的多核苷酸链时，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而可读取待测DNA分子的顺序。20O碱基CPOH H12345O碱基CPOH H12345OHO碱基CPOH12345O碱基CPOH H12345H2O脱氧核苷酸的连接脱氧核苷酸的连接21双脱氧核苷酸不能连接双脱氧核苷酸不能连接O碱基CPHH12345O碱基CPOH H12345OH22制备单链模
12、板 将单链模板与引物退火 加入DNA多聚酶及4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列技术路线技术路线23四套反应体系1-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddATP2-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddCTP3-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddGTP4-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddTTPATGCGGTACCAT53测序模板5TA5TACGCCA5TACGCCATGGTACCC第一套反应第二套反应55524AGCTATGGTACCGCAT252、化学降解法测序、
13、化学降解法测序基本原理基本原理: 在选定的核苷酸碱基中引入化学基团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降解。双链DNA变性为单链 同一方向末端标记，以显示DNA条带 不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体电泳,读取DNA核苷酸顺序技术路线技术路线: 26碱基碱基特异修饰方法特异修饰方法GPh8.0,用硫酸二甲酯对N7进行甲基化,使C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去C1.5mol/LNaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶Maxam-Gilbe
14、rt 法所用的化学技术法所用的化学技术27哌啶化学法测序实例化学法测序实例283、自动化测序、自动化测序基本原理基本原理: 与链终止法测序原理相同，只是用不同的荧光素分别标记ddNTP，如ddATP标记红色荧光，ddCTP标记蓝色荧光，ddGTP标记黄色荧光，ddTTP标记绿色荧光。由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色，而简化为由1个泳道同时判读4种碱基。293031（三）聚合酶链式反应（三）聚合酶链式反应类似于DNA的天然复制过程，扩增产物大小依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物模板模板DNA的变性：的变性：94数分钟，双链解离成单链模板模板DNA与引与引 物退火：物退火：55左右，引物
15、与模板DNA互补序列结合引引物物的的延延伸伸：在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的新链PCR（体外核酸扩增技术）基本原理（体外核酸扩增技术）基本原理 ：PCR由变性由变性-退火退火-延伸三个基本反应步骤构成：延伸三个基本反应步骤构成：（Polymerase Chain Reaction，PCR）32v特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化；v能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；v可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量
16、的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR（体外核酸扩增技术）特点（体外核酸扩增技术）特点 ：33变性变性退火退火延伸延伸百万倍扩增百万倍扩增34PCRPCR技术技术生命生命科学科学医学医学工程工程考古学考古学法医学法医学疾病疾病诊断诊断遗传遗传工程工程PCR技术已广泛应用技术已广泛应用35（四）连接酶链式反应（四）连接酶链式反应连接酶链反应，是一种新的DNA体外扩增和检测技术程程序序：在模板DNA、DNA连接酶、寡核苷酸引物存在条件下，加热94变性，双链打开，然后降温退火(65)，引物与之互补的模板DNA结合并留下一缺口，引物与靶序列完全互补，DNA连接酶即可连接封闭这一缺口，则LCR反应的三步骤
17、(变性-退火-连接)就能反复进行，否则空间结构发生变化，连接反应不能进行。应应用用：点突变、微生物病原体、单碱基遗传病，微生物的种型鉴定等研究。（ligase Chain Reaction, LCR）36单链构象多态性检测是一种基于单链DNA构象差别检测点突变的方法。单链DNA片段呈复杂的空间构象，主要是由其内部碱基相互作用力维持的，当某个碱基发生改变时，其空间构象发生改变，相同长度的单链DNA形成的构象不同，由此形成单链构象多态性，在非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)中受排阻大小不同，可以将构象上有差异的分子分离开。（五）单链构象多态性（五）单链构象多态性（Single Strand Conf
18、ormation Polymorphism, SSCP）37SSCP 示意图示意图38限制性内切酶可特异识别DNA碱基序列并对其进行切割，当基因组中的核苷酸发生突变时可造成限制酶切位点的改变，用限制酶切割基因所产生的限制性片段的数目和每个片段的长度就不同，称之为限制性片段长度多态性。能导致限制性片段发生改变的酶切位点又称为多态性位点。（六）限制性片段长度多态性分析（六）限制性片段长度多态性分析（ Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP ）39RLFPRLFP分析法分析法4041是指在基因组上单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,包括置换
19、、颠换、缺失和插入。是人类可遗传的变异中最常见的一种，在人群中的发生率大于1%。1.密度高2.具有疾病关联性3.遗传稳定性4.检测手段易实现自动化（七）单核苷酸多态性（七）单核苷酸多态性（ Single Nucleotide Polymorphism，SNP ）特点：特点：42指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片技术（八）基因芯片技术（八）
20、基因芯片技术43基基因因芯芯片片441.优生优育与遗传性疾病2.对疾病做出诊断3.器官、组织移植的配型4.病原体诊断5.环境对人体影响检测6.法医学方面的鉴定应用范围：应用范围： 通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。451.遗传性疾病的基因诊断2.感染性疾病的基因诊断3.肿瘤的基因诊断4.法医学中的应用六、基因诊断在临床医学中的应用六、基因诊断在临床医学中的应用46第二节第二节 流式细胞术及临床应用流式细胞术及临床应用47FALSSensorLaser一、流式细胞仪的基本介绍一、流式细胞
21、仪的基本介绍 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。48集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞仪流式细胞仪（Flow Cytometer)49单细胞悬液单细胞悬液或生物颗粒或生物颗粒 分析速度高分析速度高多参数多参数精度高精度高当代最先进的细胞当代最先进的细胞定量分析技术定量分析技术可分选可分选流式细胞仪特点流式细胞仪特点50v液流系统液流系统流动室液流驱动系统v光学系统光学系统激光光源光收集系统v电子系统电子系统光电转
22、换数据处理系统v细胞分选系统细胞分选系统二、流式细胞仪的基本构造二、流式细胞仪的基本构造51信号产生信号产生- -散射光信号散射光信号当颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）与激光束垂直的称为侧向角散色光信号（SSC）52FSC，前向角散射光，代表细胞大小SSC，侧向角散射光，代表细胞粒度Right Angle Light Detector Cell ComplexityForward Light Detector Cell Surface AreaIncident Light Source53信号产生信号产生- -荧光信号荧光信号 当荧光抗体
23、或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。54v 单参数直方图v 双参数图l 二维散点图l 等高线图和密度图l 假三维图v 三维图三、流式细胞仪数据显示方式三、流式细胞仪数据显示方式55vX轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“道数”表示，根据选择放大器类型不同，可以是线性标度或对数标度vY轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率单参数直方图单参数直方图56 细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。在二维图上，横轴代表第一个测量参
24、数，纵轴代表第二个测量参数。双参数数据显示双参数数据显示57纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,在图中每一个点代表一个细胞二位散点图二位散点图58用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。二位等高线图和密度图二位等高线图和密度图59利用计算机技术对二维等高线图的之中视觉直观的表现方法，纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。假三维图假三维图60三维图三维图任意选择三个参数为X、Y、Z轴构成的图像，三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。61流式细胞仪检测范围流式细胞仪检测范围细胞大小细胞粒度细胞表面面积DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白
25、质含量细细胞胞结结构构特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细细胞胞功功能能凡细胞内能进行荧光标记的成分或变化都可用流式细胞仪进行检测凡细胞内能进行荧光标记的成分或变化都可用流式细胞仪进行检测四、流式细胞仪的应用四、流式细胞仪的应用62Sub G1发生凋亡的细胞由于核内DNA裂解成许多小片段，在乙醇固定过程中小分子DNA片段穿过胞膜丢失，造成凋亡细胞内DNA含量减少，出现一个DNA含量小于2n的亚”G1”峰。2. 细胞凋亡分析细胞凋亡分析643. 细胞增值的检测与分析细胞增值的检测与分析CFSE单参数法单参数法vCFDA-SE（羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰
26、亚胺酯）是一种非极性分子，进入细胞后可以被分解成CFSE，不可逆地和细胞内蛋白的Lysine残基或其它氨基结合。v被CFDA-SE标记的非分裂细胞的荧光非常稳定，稳定标记的时间可达数个月。当细胞分裂时。CFSE标记物平均分配到两个子代细胞，因此其荧光强度是亲代的一半。65图中细胞被标记并刺激后，可跟踪细胞的分裂。配合使用Modfit软件分析，可确定每代的细胞数。细胞增殖的检测与分析细胞增殖的检测与分析664. 细胞相对大小和颗粒性分析细胞相对大小和颗粒性分析675. 细胞活性分析细胞活性分析FluoresceinDiacetate（二乙酸荧光素）进入活细胞后,被胞内酯酶降解，生成荧光底物.活细
27、胞会发绿色荧光68GranulocytesMonocytesEosinophilsBasophilsNeutrophilsLymphocytesT TBNKT HelperTCytotoxicPeripheral White Blood CellsCD45+CD3+CD4+CD3+CD8+CD3+CD3-CD19+HLA-DR+CD3-CD16+CD56+Monocytes6. 细胞表面分子的检测与分析细胞表面分子的检测与分析Lysed Whole Blood Components69 T淋巴细胞淋巴细胞T淋巴细胞检测淋巴细胞检测 淋巴细胞淋巴细胞70B淋巴细胞检测淋巴细胞检测 淋巴细胞淋巴细
28、胞B淋巴细胞淋巴细胞71NK细胞检测细胞检测淋巴细胞淋巴细胞NK细胞细胞72第三节第三节 荧光原位杂交荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)73利用生物素或地高辛等非放射性物质标记探针，并通过荧光素偶联的抗原-抗体检测系统，在组织、细胞及染色体上对DNA或RNA进行定性或定位分析。标标 记记 物：物：脱氧尿嘧啶三磷酸Bio-11-dUTP(生物素)Dig-11-dUTP(地高辛)标记方法：标记方法：缺口平移法，随机引物法74特点特点1荧光试剂和探针经济、安全；2探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、
29、定位准确；4可定位1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5多色FISH通过显示不同颜色可同时检测多种序列；6既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。75荧光标记原位杂交原理荧光标记原位杂交原理实验流程：实验流程：FISHFISH样本的制备样本的制备探针的制备探针的制备探针标记探针标记杂交杂交 （染色体显带）（染色体显带）荧光显微镜检测荧光显微镜检测结果分析。结果分析。76整条染色体涂染探针整条染色体涂染探针染色体重复序列探针染色体重复序列探针染色体专一位点探针染色体专一位点探针染色体染色体FISH探针探针实验流程：实验流程：FISHFISH样本的制备样本的制备探针的制备探针的制备探针标记探针标记杂交杂交 （染色体显带）（染色体显带）荧光显微镜检测荧光显微镜检测结果分析。结果分析。77整条染色体涂染易位染色体染色体重复序列探针染色体专一位点探针7879
