《蛋白质工程的崛起ppt医学课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质工程的崛起ppt医学课件（27页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、蛋白质工程的崛起1 1. . 蛋白质工程的崛起蛋白质工程的崛起2 2. .旁栏思考题 你知道人类蛋白质组计划吗？它与蛋白质工程有什么关系？你知道人类蛋白质组计划吗？它与蛋白质工程有什么关系？我国科学家承担了什么任务？我国科学家承担了什么任务？ 人类蛋白质组计划是继人类基因组计划人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，之后，生命科学乃至自然科学领域生命科学乃至自然科学领域一项重大一项重大的科学命题。的科学命题。20012001年，国际人类蛋白质组组年，国际人类蛋白质组组织宣告成立。之后，该组织正式提出启动了织宣告成立。之后，该组织正式提出启动了两项重大国际合作行动：一项是两项重大国际合作行动：一
2、项是由中国科学由中国科学家牵头家牵头执行的执行的“人类肝脏蛋白质组计划人类肝脏蛋白质组计划”；另一项是以美国科学家牵头执行的另一项是以美国科学家牵头执行的“人类血人类血浆蛋白质组计划浆蛋白质组计划”，由此拉开了人类蛋白质，由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕。组计划的帷幕。 3 3. .“人类肝脏蛋白质组计划人类肝脏蛋白质组计划”是国际上是国际上第一个人类组织器官的蛋白质组计划，第一个人类组织器官的蛋白质组计划，由我国贺福初院士牵头，这是中国科学家由我国贺福初院士牵头，这是中国科学家第一次领衔的重大国际科研协作计划，总第一次领衔的重大国际科研协作计划，总部设在部设在北京北京，目前有，目前有16个国
3、家和地区的个国家和地区的80多个实验室报名参加。它的科学目标是揭多个实验室报名参加。它的科学目标是揭示并确认肝脏的蛋白质，为重大肝病预防、示并确认肝脏的蛋白质，为重大肝病预防、诊断、治疗和新药研发的突破提供重要的诊断、治疗和新药研发的突破提供重要的科学基础。科学基础。 人类蛋白质组计划的深入研究将是对蛋人类蛋白质组计划的深入研究将是对蛋白质工程的有力推动和理论支持。白质工程的有力推动和理论支持。4 4. .基因工程的实质是什么基因工程的实质是什么? 将一种生物的基因转移到将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以另一种生物体内，后者可以产生它本来不能产生的蛋白产生它本来不能产生的蛋白质，进
4、而表现出新的性状。质，进而表现出新的性状。5 5. .干扰素干扰素利用大肠杆菌及酵母菌生产干扰素利用大肠杆菌及酵母菌生产干扰素6 6. .一、蛋白质工程崛起的缘由 通过基因工程能够大规模生产生物体内微量存通过基因工程能够大规模生产生物体内微量存在的活性物质，并借助转基因而改变动植物性状，在的活性物质，并借助转基因而改变动植物性状，得以在人类医疗保健中进行基因诊断和基因治疗。得以在人类医疗保健中进行基因诊断和基因治疗。然而在广泛利用自然界各种蛋白质的过程中就发现，然而在广泛利用自然界各种蛋白质的过程中就发现，这些蛋白质只是适应生物自身的需要，而对它们进这些蛋白质只是适应生物自身的需要，而对它们进
5、行产业化开发往往不合意，需要加以改造。行产业化开发往往不合意，需要加以改造。1983年年Ulmer首先提出蛋白质工程，它是指按照特定的需首先提出蛋白质工程，它是指按照特定的需要，对蛋白质进行分子设计和改造的工程。自此以要，对蛋白质进行分子设计和改造的工程。自此以后，蛋白质工程迅速发展，已成为生物工程的重要后，蛋白质工程迅速发展，已成为生物工程的重要组成部分。组成部分。7 7. . 在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业应用于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工生产，这些酶虽
6、然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生产中每一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机产中每一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高，在这种条件下，大多溶剂存在，反应温度较高，在这种条件下，大多数酶会很快变性失活。提高蛋白质的稳定性是工数酶会很快变性失活。提高蛋白质的稳定性是工业生产中一个非常重要的课题。一般来说，提高业生产中一个非常重要的课题。一般来说，提高蛋白质的稳定性包括：延长酶的半衰期，提高酶蛋白质的稳定性包括：延长酶的半衰期，提高酶的热稳定性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于的热稳定性，延长药用蛋白的
7、保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。8 8. .例如例如:干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干扰素的人的干扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病毒活性为的干扰素的抗病毒活性为106 U/mg，只相当于天，只相当于天然产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的然产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的-干扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式干扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究存在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究发现，发
8、现，-干扰素蛋白质中有干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第个半胱氨酸（第17位、位、31位和位和141位），推测可能是有一个或几个半胱氨位），推测可能是有一个或几个半胱氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第17位的位的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结果使大肠杆菌中生产的果使大肠杆菌中生产的-干扰素的抗病性活性提干扰素的抗病性活性提高到高到108 U/mg，并且比天然，并且比天然-干扰素的贮存稳定干扰素的贮存稳定性高很多。性高很多。9 9. .“后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”，即从对基因信息的研究转向对蛋白
9、质信息的研究，包括研究蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。蛋白质工程就是在对蛋白质的化学、晶体学、动力学等结构与功能认识的基础上，对蛋白质人工改造与合成，最终获得商业化的产品。1010. .1.4 蛋白质工程的崛起蛋白质工程的崛起一、蛋白质工程崛起的缘由一、蛋白质工程崛起的缘由1、基因工程在原则上只能生产自然、基因工程在原则上只能生产自然 界已存在的蛋白质界已存在的蛋白质2、天然蛋白质不一定完全符合人类、天然蛋白质不一定完全符合人类 生产和生活的需要生产和生活的需要蛋白质工程的目的：蛋白质工程的目的： 生产符合人们生活需要的生产符合人们生活需要的并非并非自然界自然界已存在的已存在的蛋
10、白质蛋白质例如例如1111. .二、蛋白质工程的基本原理二、蛋白质工程的基本原理、蛋白质工程的目标、蛋白质工程的目标 P26、蛋白质工程流程图：、蛋白质工程流程图：P27（原理：基因改造）（原理：基因改造）预期预期功能功能DNA合成合成分子分子设计设计生物生物功能功能转录转录翻译翻译中心法则？中心法则？折叠折叠P27讨论题讨论题1212. .蛋白质工程操作程序的基本思路与基因蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？工程有什么不同？答：答：基因工程是遵循基因工程是遵循中心法则中心法则，从，从DNAmRNA蛋白质蛋白质折叠产生功能，折叠产生功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。基本上是
11、生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质工程是按照以下思路进行的：蛋白质工程是按照以下思路进行的：确确定蛋白质的功能定蛋白质的功能蛋白质应有的高级结蛋白质应有的高级结构构蛋白质应具备的折叠状态蛋白质应具备的折叠状态应有的应有的氨基酸序列氨基酸序列应有的碱基排列，可以创应有的碱基排列，可以创造自然界不存在的蛋白质。造自然界不存在的蛋白质。1313. .4.4.蛋白质工程的主要步骤通常包括：蛋白质工程的主要步骤通常包括：蛋白质工程的主要步骤通常包括：蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；）测定其氨基酸序列；（3）借借助助核核磁
12、磁共共振振和和X射射线线晶晶体体衍衍射射等等手手段段，尽尽可可能能地地了了解解蛋蛋白质的二维重组和三维晶体结构白质的二维重组和三维晶体结构;（4）设设计计各各种种处处理理条条件件，了了解解蛋蛋白白质质的的结结构构变变化化，包包括括折折叠叠与与去去折折叠叠等对其活性与功能的影响；等对其活性与功能的影响；（5）设设计计编编码码该该蛋蛋白白的的基基因因改改造造方方案，如点突变；案，如点突变；（6）分分离离、纯纯化化新新蛋蛋白白，功功能能检检测测后投入实际使用。后投入实际使用。1414. .（一）蛋白质的分子设计与改造（一）蛋白质的分子设计与改造 蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，蛋白质工程首先是
13、以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质的一级结构、晶体结构和溶液构象的通过蛋白质的一级结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累了成千上万蛋白质一级结构和高级结研究，积累了成千上万蛋白质一级结构和高级结构的数据资料，并编制成系统的数据库，得以从构的数据资料，并编制成系统的数据库，得以从中找出蛋白质分子间的进化关系、一级结构和高中找出蛋白质分子间的进化关系、一级结构和高级结构的关系、结构与功能的关系方面的规律。级结构的关系、结构与功能的关系方面的规律。1515. . 蛋白质作为生物大分子是生物化学和分子生物学的蛋白质作为生物大分子是生物化学和分子生物学的研究重点，大量蛋白质被分离纯化，测定了它们的结构、研究
14、重点，大量蛋白质被分离纯化，测定了它们的结构、性质和生物学作用。分子生物学有关基因组的研究，也性质和生物学作用。分子生物学有关基因组的研究，也可以用以推测出一些未知蛋白质的结构与功能。采用定可以用以推测出一些未知蛋白质的结构与功能。采用定位诱变的方法，可以对编码蛋白质的基因进行核苷酸密位诱变的方法，可以对编码蛋白质的基因进行核苷酸密码子的插入、删除、置换和改组，其结果为分子改造提码子的插入、删除、置换和改组，其结果为分子改造提供新的设计方案。现有的蛋白质是生物长期进化的结果，供新的设计方案。现有的蛋白质是生物长期进化的结果，蛋白质工程则是对生物进化的模拟，按照蛋白质形成的蛋白质工程则是对生物进
15、化的模拟，按照蛋白质形成的规律，改造蛋白质或构建新的蛋白质。规律，改造蛋白质或构建新的蛋白质。 蛋白质的改造通常需要先经周密的分子设计，然后依蛋白质的改造通常需要先经周密的分子设计，然后依赖基因工程获得突变型蛋白质，以检验其是否达到了预赖基因工程获得突变型蛋白质，以检验其是否达到了预期的效果。如果改造的结果不理想，还需要从新设计再期的效果。如果改造的结果不理想，还需要从新设计再进行改造，往往经历多次实践摸索才能达到改进蛋白质进行改造，往往经历多次实践摸索才能达到改进蛋白质性能的预定目标。性能的预定目标。1616. .（二）蛋白质改造工程举例（二）蛋白质改造工程举例1水蛭素改造水蛭素改造水蛭素是
16、水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有多种变异体，由它有多种变异体，由65或或66个氨基酸残基组成。水个氨基酸残基组成。水蛭素在临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。蛭素在临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。为提高水蛭素活性，在综合各变异体结构特点的基为提高水蛭素活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭素主要变异体础上提出改造水蛭素主要变异体HV2的设计方案，的设计方案，将将47位的位的Asn（天冬酰胺）变成（天冬酰胺）变成Lys（赖氨酸），（赖氨酸），使其与分子内第使其与分子内第4或第或第5位位Thr（苏氨酸）间形成氢（苏氨酸）间形成氢键来
17、帮助水蛭素键来帮助水蛭素N端肽段的正确取向，从而提高凝端肽段的正确取向，从而提高凝血效率，试管试验活性提高血效率，试管试验活性提高4倍，在动物模型上检倍，在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高验抗血栓形成的效果，提高20倍。倍。1717. .2生长激素改造生长激素改造生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体的生生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体的生长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还可以结合长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还可以结合许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发其他生理过程。许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发其他生理过程。在治疗过程中为减少副作用，需使人
18、的重组生长激素只与在治疗过程中为减少副作用，需使人的重组生长激素只与生长激素受体结合，尽可能减少与其他激素受体的结合。生长激素受体结合，尽可能减少与其他激素受体的结合。经研究发现，二者受体结合区有一部分重叠，但并不完全经研究发现，二者受体结合区有一部分重叠，但并不完全相同，有可能通过改造加以区别。由于人的生长激素和催相同，有可能通过改造加以区别。由于人的生长激素和催乳激素受体结合需要锌离子参与作用，而它与生长激素受乳激素受体结合需要锌离子参与作用，而它与生长激素受体结合则无需锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基体结合则无需锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基的氨基酸侧链，如第的氨基酸侧链，
19、如第18和第和第21位位His（组氨酸）和第（组氨酸）和第17位位Glu（谷氨酸）。实验结果与预先设想一致，但要开发作（谷氨酸）。实验结果与预先设想一致，但要开发作为临床用药还有大量的工作要做。为临床用药还有大量的工作要做。1818. .3胰岛素改造胰岛素改造天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素B23-B28氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改
20、变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰岛素改变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。1919. .4治癌酶的改造治癌酶的改造 癌症的基因治疗分二个方面：药物作用于癌细胞，癌症的基因治疗分二个方面：药物作用于癌细胞，特异性地抑制或杀死癌细胞；药物保护正常细胞免受化学药特异性地抑制或杀死癌细胞；药物保护正常细胞免受化学药物的侵害，可以提高化学治疗的剂量。疱疹病毒（物的侵害，可以提高化学治疗的剂量。疱疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（胸腺嘧啶激酶（TK）可以催化胸腺嘧啶和其它结构类似物）可以催化胸腺嘧啶和其它结构类似物磷酸化而
21、使这些碱基磷酸化而使这些碱基3-OH缺乏缺乏,从而阻断从而阻断DNA的合成，杀的合成，杀死癌细胞。死癌细胞。HSVTK催化能力可以通过基因突变来提高。催化能力可以通过基因突变来提高。从大量的随机突变中进行筛选出一种酶从大量的随机突变中进行筛选出一种酶,在酶活性部位附近在酶活性部位附近有有6个氨基酸被替换，催化能力个氨基酸被替换，催化能力20倍以上。倍以上。蛋白质工程的发展很快，研究工作很多，以上仅介绍了几蛋白质工程的发展很快，研究工作很多，以上仅介绍了几个例子。蛋白质工程除了用于改造天然蛋白质或设计制造新个例子。蛋白质工程除了用于改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质外，其本身还是研究蛋白质结构功
22、能的一种强有力的蛋白质外，其本身还是研究蛋白质结构功能的一种强有力的工具，它在解决生物理论方面所起的作用，可以和任何重的工具，它在解决生物理论方面所起的作用，可以和任何重大的生物研究方法相提并论。大的生物研究方法相提并论。2020. .何谓蛋白质工程？ 5.在现代生物技术中，蛋白质工程出现在现代生物技术中，蛋白质工程出现得最晚，是在得最晚，是在20世纪世纪80年代初期出现年代初期出现的。的。1983年年 “蛋白质工程蛋白质工程”这个名词这个名词出现后，随即被广泛接受和采用。出现后，随即被广泛接受和采用。 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,
23、对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。 2121. .三、蛋白质工程的进展和前景蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照
24、人类意愿改造、创造符合人类需要的创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。蛋白质的新时期。2222. .练习1、以下关于蛋白质工程的说法正确的是：、以下关于蛋白质工程的说法正确的是：( ) A. 蛋白质工程以基因工程为基础蛋白质工程以基因工程为基础 B. 蛋白质工程就是用蛋白酶对蛋白质进行改造蛋白质工程就是用蛋白酶对蛋白质进行改造 C. 蛋白质工程只能生产天然的蛋白质蛋白质工程只能生产天然的蛋白质 D. 蛋白质工程的实质是改造蛋白质蛋白质工程的实质是改造蛋白质A2323. .2、蛋蛋白白质质工工程程的的基基本本流流程程正正确确的的是是：( )设计蛋白质分子结构设计蛋白质分子结构
25、DNA合成合成 预预期期蛋蛋白白质质功功能能 据据氨氨基基酸酸序序列列推推出出脱脱氧核苷酸序列氧核苷酸序列 A. B. C. D. D2424. .讨讨 论论答答：（：（1）每种氨基酸都有对应的三联密码子，只要查）每种氨基酸都有对应的三联密码子，只要查一下遗传密码子表，就可以将上述氨基酸序列的编码一下遗传密码子表，就可以将上述氨基酸序列的编码序列查出来。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基序列查出来。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三联密码子编码，因此其碱基排列组合起酸是由多个三联密码子编码，因此其碱基排列组合起来就比较复杂，至少可以排列出来就比较复杂，至少可以排列出16种种，可以根
26、据学过，可以根据学过的排列组合知识自己排列一下。首先应该根据三联密的排列组合知识自己排列一下。首先应该根据三联密码子推出码子推出mRNA序列为序列为GCU（或（或C或或A或或G）UGGAAA（或（或G）AUGUUU（或（或C），再根据碱），再根据碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列：基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列：CGA（或（或G或或T或或C）ACCTTT（或（或C）TACAAA（或（或G）。）。（2）确定目的基因的碱基序列后，就可以根）确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改造它，通过据人类的需要改造它，通过人工合成人工合成的方法的方法或从或从基因库基因库中获取。中获取。2525.
27、.（1）干扰素在体外保存困难）干扰素在体外保存困难（2）玉米中赖氨酸的含量低）玉米中赖氨酸的含量低解决方法解决方法 ：解决方法解决方法 ： 半胱氨酸半胱氨酸 丝氨酸丝氨酸变成变成天冬氨酸激酶：苏氨酸天冬氨酸激酶：苏氨酸 异亮氨酸异亮氨酸变成变成二氢吡啶二羧酸合成酶：天冬酰胺二氢吡啶二羧酸合成酶：天冬酰胺 异亮氨酸异亮氨酸变成变成2626. .； http:/ 大连婚纱摄影排名 大连婚纱摄影哪家好 qtz42pts 好了，能帮咱们把地里家里今年的活计做完，已经是很够意思了，让他回家吧。只是啊，你这身子骨儿，我看一时半会儿的很难恢复成以前那样了，可咱们尚武还太年轻”李长善说：“咱们就是再难，也不能
28、再这样耽误耿兄弟了，他的心里已经够苦了”李妻轻轻地叹一口气，说：“唉，那咱们就多给他带点儿银子，让他趁着秋后雨水稀少的季节回去吧！”李长善点点头说：“好，那我就抽空和他说说这事吧！”李长善低落的情绪，耿老爹全都看在了眼里；而他的心事，耿老爹也猜得八九不离十。于是，还没有等到李长善先开口，耿老爹就主动跟他提起了这事儿。那天晚饭后，尚英帮着娘洗刷完锅碟碗筷以后，就过义父这边来练习打算盘。此时，尚武已经爬在桌子上开始写生字了。耿老爹吩咐尚英：“英子，你今儿个练练打百子吧！”“好嘞！”看到尚英已经在按照练习规则打算盘了，耿老爹就走出屋来。他想去和李长善夫妇好好谈一谈自己的打算，以消除这位善良大哥的后顾
29、之忧。一出屋门，正好看到尚文扶着父亲小解了从茅房出来，耿老爹走上前和尚文一起把李长善扶到屋里上床坐了，自己拉把椅子挨床边上也坐下，伸手轻轻给李长善揉着膝盖说：“李大哥，咱今年多好的年景啊，应该高兴呢！你眼下身体有些不爽，可千万不要着急啊，有我和尚文呢，咱们什么事情也耽误不了！”李长善的眼眶有些发热，声音里透着几分沙哑：“耿兄弟啊，你的心意大哥明白，看我现在这个样子，你是不放心走啊！可你现在已经完全康复了，我，还有你嫂子和娃儿们不能再耽误你了！回家去吧，家里兄弟媳妇和小侄女还在等着你呢！”耿老爹亲切地看着李长善的眼睛坚定地摇摇头，再抬头看看站在床边上憨厚善良的大义子尚文，落地有声地说：“李大哥，
30、我会回老家去的，但不是现在！你只管放心养病，给我们出谋划策就行！我已经决定了，四年之后再离开！到那时，我们的尚文就该是一个顶天立地的当家人了，你也可以不用再多操心”李长善连连摆手，说：“不行，这绝对不可以”李妻也流着眼泪说：“耿兄弟，再耽误你四年这，这不可以啊”耿老爹却诚恳地说：“大哥大嫂，不要再说了。这没有什么不可以的，我必须得看着李大哥完全好起来，或者尚文能够挑起咱家大梁的时候再走！”听了义父的话，李尚文激动地流下了眼泪。他声音颤抖地说：“义父有能力有学识，我一定好好跟您学习，争取快快成长起来，好让您早日回家与义母和小妹妹团聚”不幸被华老郎中言中了，李长善腰腿痛的老疾患非但没有能够再好转起来，反而越来越严重了。一年后，这个还不到五十岁的李家顶梁柱竟然迈不开步，走不了路了。耿老爹就施展自己有限的木工手艺，精心为他制作了一个结结2727. .
