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1、第第8章章 RNA的转录合成的转录合成Section 8 RNA Transcriptionq原核生物原核生物RNA的转录的转录q真核生物真核生物RNA的转录的转录qRNA转录的抑制作用转录的抑制作用1q原核生物原核生物RNA的转录的转录 RNA Transcription in Prokaryotesv转录的基本原则转录的基本原则 Basic Principles of Transcription v大肠杆菌大肠杆菌RNARNA聚合酶聚合酶 Escherichia Coli RNA Polymerase v大肠杆菌大肠杆菌7070启动子启动子 The E.coli 70 promoter v
2、转录的起始转录的起始, , 延伸与终止延伸与终止 Transcription, initiation, elongation and termination 2转录转录:以以DNA为模板为模板,在依赖于在依赖于DNA的的RNA聚合酶催化之下的一系列聚合酶催化之下的一系列RNA酶促合成过程叫做转录酶促合成过程叫做转录,包括包括RNA链的起始、延伸、终止等步骤。链的起始、延伸、终止等步骤。 v转录的基本原则转录的基本原则 Basic Principles of Basic Principles of TranscriptionTranscription3Antisense strandSense
3、strandAntisense strandSense strand4v大肠杆菌大肠杆菌RNA聚合酶聚合酶 E.coli RNA Polymerase155kDa36.5kDa151kDa11kDa36.5kDa70kDaHoloenzyme 全酶核心酶51 亚基亚基: 核心核心RNA聚合酶有聚合酶有2个个亚基亚基,由由rpoA基因编码基因编码.功能功能：1）参与）参与RNA核心酶的组装核心酶的组装,尚未发现有明确的转录功能。尚未发现有明确的转录功能。2）参与全酶和）参与全酶和启动子启动子的牢固结合。的牢固结合。3）当）当RNA聚合酶核心酶沿着模板移动进行聚合酶核心酶沿着模板移动进行RNA链的
4、延伸时链的延伸时,保证保证DNA双螺旋的不断地在前面解开双螺旋的不断地在前面解开,在后面恢复双螺旋。在后面恢复双螺旋。62 亚基亚基: 是是RNA聚合酶的聚合酶的催化中心催化中心, 由由rpoB 基因编基因编码码.可能含有两个结构域可能含有两个结构域, 分别负责转录的分别负责转录的起始和延伸起始和延伸.具体是具体是 ：结合核苷酸：结合核苷酸 底物并催化磷酸二酯键形成底物并催化磷酸二酯键形成证据证据:(1)抗生素利福平抗生素利福平:与与亚基结合亚基结合,阻止阻止RNA聚合酶聚合酶 转录的开始转录的开始; (2)利迪链菌素也与利迪链菌素也与亚基结合亚基结合,抑制转录延伸抑制转录延伸.73 亚基亚基
5、:是是RNA聚合酶的聚合酶的催化中心，催化中心，由由rpoC 基因编码基因编码, 负责核心酶与模板负责核心酶与模板DNA的结合的结合。 84 因子因子: 大肠杆菌中最常见的大肠杆菌中最常见的因子是因子是70. 特性特性:（1）与核心酶结合形成了全酶）与核心酶结合形成了全酶,在启动子识别中在启动子识别中 起关键性的作用；起关键性的作用；（2）原核生物含有多种）原核生物含有多种因子，以能识别各种类型的启动子；因子，以能识别各种类型的启动子；（3）RNA链延伸至链延伸至8-9nt时，时， 因子就离开核心酶；因子就离开核心酶；（4） 因子数量只有核心酶的因子数量只有核心酶的30%，因此在任何时刻只有，
6、因此在任何时刻只有1/3的聚的聚 合酶是全酶。合酶是全酶。95 亚基：亚基：亚基的功能尚不清楚亚基的功能尚不清楚,也有人认为也有人认为亚基对于亚基对于RNA聚合酶的结构和功能没有太大的影响。聚合酶的结构和功能没有太大的影响。10v 大肠杆菌大肠杆菌7070 启动子启动子 The E.coli 70 promoter1. 70在基因中的位置及序列在基因中的位置及序列为了方便为了方便, ,人们将人们将mRNAmRNA开始转录的一个碱基开始转录的一个碱基( (转录起始点转录起始点) )定为定为+1,+1,沿转录方向顺流而下均用正值表示沿转录方向顺流而下均用正值表示; ;溯流而上的溯流而上的启动子部分
7、启动子部分, ,均用负值表示。均用负值表示。112. 70的特征的特征大小大小40-60bp; -10序列序列, 也叫也叫pribnow框框,含有保守序列含有保守序列 TATAAT, 其中其中带底线的称为保守带底线的称为保守T,它存在于目前已知的几乎所有启动子它存在于目前已知的几乎所有启动子中中,一般位于一般位于6(5)到到9(8).该序列是聚合酶启动该序列是聚合酶启动DNA解解旋的序列旋的序列.122. 70的特征的特征(续上续上) -35序列序列, 也叫也叫Sextama框框,也是也是RNA聚合酶覆盖的部分。聚合酶覆盖的部分。 RNA聚合酶依靠其聚合酶依靠其亚基识别该位点亚基识别该位点,因
8、此又称为因此又称为RNA聚合酶聚合酶识别位点。其保守序列为识别位点。其保守序列为TTGACA。132. 70的特征的特征(续上)启动子区域的共同功能启动子区域的共同功能: (1) -35序列组成增强与聚合酶序列组成增强与聚合酶因子相识别和相互作用的识因子相识别和相互作用的识别区；别区； (2) -10序列直接影响序列直接影响DNA的解旋速度；的解旋速度；TTGACA.16-18bp.TATAAT5-8bp.CG/AT-35sequence -10sequence +114启动子效率启动子效率-10序列和序列和-35序列之间距离的改变影响启动子的活序列之间距离的改变影响启动子的活性。间隔性。间隔
9、17bp活性最强（活性最强（16-18，15-20bp）弱启动子没有弱启动子没有-35序列。如：序列。如：lac启动子，启动子，lac基因的基因的表达需要一个辅助激活因子受体蛋白表达需要一个辅助激活因子受体蛋白CAP(cyclic AMP receptor proteizod) 与靠近启动子上的与靠近启动子上的CRP位点结合，位点结合，以增强启动子与以增强启动子与RNA聚合酶的结合从而进行转录起始。聚合酶的结合从而进行转录起始。15v 转录的起始、延伸与终止转录的起始、延伸与终止 Transcription, Initiation , Elongation and Termination1 启
10、动子结合启动子结合 Promoter binding2 DNA解旋解旋 DNA unwinding3 RNA链起始链起始 RNA chain initiation4 RNA链延伸链延伸 RNA chain elongation5 RNA链终止链终止 RNA CHAIN TERMINATION6 依赖的依赖的转录终止转录终止 Rho-dependent termination161.Promoter binding2. DNA Unwinding and initiation三聚复合物闭合复合物开放复合物3. ElongationDNA解旋区(转录泡)1712bp17bp3. Elongatio
11、n18Termination (1)不依赖不依赖因子的转录终止因子的转录终止(Rho-indepent termination)发夹结构发夹结构特点特点:回文回文序列中富序列中富含含G.C碱碱基对基对,在回在回文序列的文序列的下游方向下游方向又常有又常有6个个8个个AT碱基对；碱基对；1920(2) 依赖依赖因子的转录终止因子的转录终止 (Rho-depent termination)结合RNA上72个核甘酸发夹结构特发夹结构特点点:依赖依赖因因子的终止子子的终止子中回文序列中回文序列的的G-C对含对含量较少。在量较少。在回文序列下回文序列下游方向的序游方向的序列没有固定列没有固定特征特征,其
12、其A-T对含量比前对含量比前一种终止子一种终止子低低。 21因子是因子是RNA聚合酶的聚合酶的一种重要的蛋白质辅助一种重要的蛋白质辅助因子。催化解开因子。催化解开DNA-DNA和和RNA-DNA双螺双螺旋结构。旋结构。22q真核生物真核生物RNA的转录的转录Transcription in Eukaryotesv真核生物的真核生物的RNA聚合酶聚合酶 Eukaryotic RNA Polymerases v真核生物的启动子真核生物的启动子 Eukaryotic Promoter23v真核生物真核生物RNA聚合酶聚合酶Eukaryotic RNA Polymerases 真核细胞中有三种真核细胞
13、中有三种RNA聚合酶聚合酶：RNA聚合酶聚合酶I、RNA聚合酶聚合酶、RNA聚合酶聚合酶。除了这除了这3种聚合酶以外种聚合酶以外,真核生物细胞中的线粒体真核生物细胞中的线粒体和叶绿体还含有其他的和叶绿体还含有其他的RNA聚合酶聚合酶243种种RNA聚合酶的性质和功能聚合酶的性质和功能TypeLocationFunctionTo -amanitinRNA Pol INucleoli核核仁仁Transcribes Most rRNAs geneInsensitiveRNA PolNucleo-plasm核质核质Transcribes all protein-coding genes and som
14、e snRNA genesVery sensitiveRNA Pol Nucleo-plasmtRNAs, 5S rRNA,U6 snRNA and other small RNAs genesModerately sensitive中度敏感中度敏感25RNA聚合酶亚基聚合酶亚基 RNA polymerase subunits三种聚合酶均含有三种聚合酶均含有12个以上的亚基个以上的亚基,其中编码每一个其中编码每一个RNA聚合酶聚合酶两个大亚基的两个大亚基的DNA序列具有同源序列具有同源.三种聚合酶均含有与三种聚合酶均含有与E. coli RNA Pol 核心核心 ( 2)亚基亚基相同相同 源的
15、亚基源的亚基. 其中最大亚基与其中最大亚基与E. coli RNA Pol 中的中的 亚基相亚基相似似,第二大亚基与第二大亚基与E. coli RNA Pol 的含有活性位点的的含有活性位点的 亚基相似亚基相似.RNA Pol I 和和III,共存两个亚基共存两个亚基,Pol II 专有亚基与专有亚基与E. coli RNA Pol 的的 亚基具有同源性亚基具有同源性.至少还有至少还有5种小亚基普遍存在于这种小亚基普遍存在于这3种聚合酶中种聚合酶中,此外仅存在于某此外仅存在于某一特定聚合酶中的亚基还有一特定聚合酶中的亚基还有4-7个个.26 真核生物真核生物RNA聚合酶的活性聚合酶的活性Euk
16、aryotic RNA polymerase activity 真核生物的真核生物的RNA聚合酶与原核生物的共同点：聚合酶与原核生物的共同点：（1）转录方向为53,合成与反义模板链互补的RNA（2）转录起始时不需要引物,只需要前体核苷酸ATP, GTP, CTP,UTP27真核生物的真核生物的RNA聚合酶与原核生物的不同点：聚合酶与原核生物的不同点：（1）有三个聚合酶。（2）真核生物RNA聚合酶在与启动子结合、起始转录之前需要一些额外的起始蛋白（转录因子转录因子）的参与。（3） RNA 聚合酶II的羧基端含有一段7个氨基酸的重复序列，称作羧基末端结构域，即CTD (carboxyl termi
17、nal domain )；这7个氨基酸的重复序列是Tyr（酪）-Ser（丝）-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser。在老鼠中重复52次，在酵母中重复26次。这种结构对酶的活性是必要的。28真核生物的转录因子真核生物的转录因子（1）基本转录因子（）基本转录因子（basal factor）（2）上游因子（）上游因子（upstream factor）（3）诱导因子（）诱导因子（inducible factor）29v真核生物的启动子真核生物的启动子 Eukaryotic Promoter启动子：启动子是指位于基因启动子：启动子是指位于基因5 端上游，能够被端上游，能够被RNA 聚合酶和其他转录因子
18、识别并与之结合，从而起始基聚合酶和其他转录因子识别并与之结合，从而起始基因转录的一段因转录的一段DNA 序列，是基因表达调控中非常重要序列，是基因表达调控中非常重要的顺式作用元件。的顺式作用元件。 调控元件：顺式作用元件调控元件：顺式作用元件(启动子，增强子，沉默子），启动子，增强子，沉默子），反式作用因子反式作用因子启动子类型：启动子类型：I型启动子、型启动子、II型启动子、型启动子、III型启动子型启动子301.rRNA 基因(rDNA)人类rDNA编码产生一个45S的rRNA转录物 (13000nt)，这一转录物随后被切成18S (2000nt), 5.8S (160nt) 和 28S
19、(5000 nt)各1个的 rRNA. 人类细胞在不同的染色体上分布有5簇rDNA重复基因（串联基因簇），每簇有40个拷贝，拷贝之间被非转录的间隔序列分开（图）这种RNA多基因拷贝的连续转录是产生足够且加工的rRNA。rRNA和蛋白质结合形成了核糖体(1) I型启动子（型启动子（ RNA聚合酶聚合酶I启动子）启动子）3145S rRNAprocessed intorDNA32每一个每一个rRNA簇被称为簇被称为一个核组织区域一个核组织区域（nucleolar organizer regions）. 在在rRNA合成活跃阶段，合成活跃阶段，前前rRNA转录物与转录物与rDNA捆扎在一起可在显微镜
20、下捆扎在一起可在显微镜下看到看到“圣诞树圣诞树” （Christmas tree structures）样的结构样的结构.（图）（图） 332. I 型启动子的特征型启动子的特征I型启动子由两部分的转录控制区域构成型启动子由两部分的转录控制区域构成:核心元件核心元件(Core element，CE) 和上游控制元件和上游控制元件(Upstream control element, UCE)前 rDNA RNA Pol I promoters in human cells34上游结合因子上游结合因子(Upstream binding factor1, UBF1)：一种特异一种特异DNA结合蛋白结
21、合蛋白, 与与UCE和核心元件上游的一段序和核心元件上游的一段序列结合列结合,UBF1可使转录速率大大增强可使转录速率大大增强.UBF1的两个结合位点序列之间没有明显的相似性的两个结合位点序列之间没有明显的相似性, UBF1的分子先结合一个序列元件的分子先结合一个序列元件,随后通过蛋白随后通过蛋白-蛋白之间蛋白之间的互作结合的互作结合,导致在两个位点间的导致在两个位点间的DNA形成一个环状结构形成一个环状结构.3. RNA聚合酶与转录因子聚合酶与转录因子35选择因子选择因子1(Selectivity factor1, SL1)：聚合酶：聚合酶I 转录所必需转录所必需.SL1结合并稳定结合并稳定
22、UBF-DNA复合物复合物,且与核心元件游离的且与核心元件游离的下游部分相互作用下游部分相互作用.SL1本身没有与启动子特异结合的特性本身没有与启动子特异结合的特性,它促使它促使Pol I与与UBF-DNA复合物的结合并起始转录复合物的结合并起始转录.UBF1UBF13637(2) II型型启动子：启动子：RNA聚合酶聚合酶II识别识别RNA Pol II (RNA聚合酶聚合酶II)1.1）RNA Pol II 存在于核质中2.2）负责所有编码基因和一些snRNA基因的转录3.3）合成的前mRNA需经过一系列的加工,如RNA 5端生成帽子结构、RNA 3端加上poly A 尾巴以及内含子剪接3
23、8Typical RNA Pol II genes 39II型启动子型启动子 Promoter特征特征： （1）TATA box：在上游约在上游约-25-35bp位置，有位置，有7对共有碱基序列对共有碱基序列5-TATA（A/T）A（A/T）-3。决定决定RNA Pol II 的位置或正确的起始的位置或正确的起始转录。转录。（2）帽子位点（）帽子位点（Cap site):即转录的起始位点，大都为即转录的起始位点，大都为A碱基。碱基。（3）CAAT box：即上游调控元件（即上游调控元件（UREs）。）。保守序列为保守序列为GG（C/T）CAATCT，一般位一般位 于于-75bp附近。该序列确保
24、启动子的附近。该序列确保启动子的有效转录。有效转录。A40其他真核生物的启动子：其他真核生物的启动子：（ 1）缺乏）缺乏TATA框，只含起始元件，如老鼠的末端脱氧框，只含起始元件，如老鼠的末端脱氧核苷酸转移酶基因，其起始元件位于转录起始点附近，核苷酸转移酶基因，其起始元件位于转录起始点附近，从从-6至至+11，序列为，序列为GCCCTCATTCTGGAGAC。（2）没有没有TATA框，也不含起始元件，只有框，也不含起始元件，只有20-50bp的的GC区。区。 这些启动子的转录效率很低。这些启动子的转录效率很低。41食用菌食用菌gpd启动子：启动子：1 ATTCAAGCAGTCAATGGATTG
25、GAGTGTATTTAGAATCGAAGGTTGTGGAA51 CAAGGAAAAGATGCGGACGAAAAACACAACTGATCCTTTTATAGATAATC101 GCGCTTCAGTCAAATCTTGATTGCGTGATGTTGTGACTTCGACAATAGCC151 CTAAAGTCTAGACCTTAGAACACTTTAGTACCTCGGACCTGCGATTGGGT201 AGGATTTACTGGCCGAGTCCTTTGGGATGGACTGCCAATCAGCAAACGTT251 CTTCAGTTCTATCGCCCCATGACTAAGGTTGCCTGGAACCGTGCTCGAGC30
26、1 TTTGGATGGAAGTGCCTTTGAAAAGCCCTGCAAAGTCTTGCAAATGCTAC351 AGCTTCCTCCCTGGCCTGGGTTTGTTGTTCTAGAACTACTCTCATTCTTA401 TCTTCTGCATACAACCATTTCATGCTATCCCAGGATACACCGGTTTCACC451 GTAGTAGCCTTATGGATGCAACTTTGACGCACTGACAATCTGACTGATAT501 CGACCAATAAGAATAGATAAAACTCCCTGTCCGAGTCCTTTCCGTGATAC551 ATGTGGCTCTCCGACTGCACTCTAACGC
27、CGATAGGATACGGGCCCGCTCA601 GATAACCAGCA42uGfp基因在灰盖鬼伞菌丝中的表达基因在灰盖鬼伞菌丝中的表达ck- pLg-gfp转化子Lg2 pGg-gfp转化子Gg1 普普通通光光源源蓝蓝光光激激发发ck- pLg-gfp转化子Lg2 pGg-gfp转化子Gg1 l荧荧光光显显微微镜镜下下的的菌菌丝丝荧荧光光图图43ck- pLg-gfp转化子Lg2 pGg-gfp转化子Gg1 pLr-gfp转化子 Lr1l共共聚聚焦焦显显微微镜镜下下菌菌丝丝荧荧光光图图片片44Fluorescence microscope45u增强子增强子Enhancer ：在远离转录起始
28、点（上游或下游）的在远离转录起始点（上游或下游）的一段可增强启动子活性的调控元件，大小为一段可增强启动子活性的调控元件，大小为100-200bp。最最初在初在DNA病毒病毒SV40的基因组中发现。的基因组中发现。特性：特性：（1）加强相连基因从正确起始位点的转录活性；）加强相连基因从正确起始位点的转录活性；（2）增强子无论是在下游或在上游均可激活转录；）增强子无论是在下游或在上游均可激活转录；（3）无论是在下游或在上游，可在远离起始位点）无论是在下游或在上游，可在远离起始位点1Kb以上以上发挥作用；发挥作用；（4）两个启动子串联在一起时，增强子优先激活距离最近）两个启动子串联在一起时，增强子优
29、先激活距离最近的那一个。的那一个。u沉默子沉默子Silencer:46IIII型基因转录的转录因子和转录起始复合物型基因转录的转录因子和转录起始复合物转录因子转录因子：真核生物RNA聚合酶转录需要的各种蛋白质辅助因子称之。以TFIIX表示，以发现顺序命名，如：TFIIA、TFIIB等。转录起始复合物的组装过程：转录起始复合物的组装过程：p268-26947（3）III型型启动子：启动子：RNA聚合酶聚合酶III识别识别RNA聚合酶聚合酶III:1）Contains at least 16 different subunits2）Located in nucleoplasm(核质核质)3）Syn
30、thesizes the precursor of 5S rRNA, the tRNAs and other snRNAs and small cytosolic(胞质胞质) RNAs III型启动子的类型（下图）：型启动子的类型（下图）：基因内启动子基因内启动子转录起点上游启动子转录起点上游启动子48 Promoters for RNA polymerase IIIMay consist of bipartite(双向的双向的) sequences downstream of the startpoint, with boxA separated from either boxC or bo
31、xB. Or they may consist of separated sequences upstream of the startpoint (Oct, PSE, TATA box).5SrRNA基因U6等基因tRNA基因49tRNA 的基因内启动子的基因内启动子(1) Transcription control regions (promoters) of tRNA lies after the start site.(2) Two highly conserved sequences within the tRNA coding region, called A box (5-TGG
32、CNNAGTGG) and B box (5-GGTTCGANNCC). These sequences also encode important sequences in the tRNA itself, the D-loop and T C-loop (tRNA二级结构形式二级结构形式).Highly conserved sequence in tRNAs are also highly conserved promoter DNA sequences. 50(3)Two complex DNA-binding factorsa. TFIIIC binds to both the A a
33、nd B boxesb. TFIIIB: the true initiation factorbinds 50 bp upstream from the A box.Consists of 3 subunits, including TBP, BRF and BTFIIIC remove without affecting transcription51v转录的终止转录的终止Transcriptional terminationRNA polymerases III 的终止只需要一个简单的核苷酸序列, 这个核苷酸序列由成簇的dA残基构成, 但其终止序列受到周围的序列的影响.如Xenopus b
34、orealis体细胞中5SrRNA基因的一个有效的终止信号, 其序列为: 5-GCAAAAGC-3其他终止信号可能也是U序列的发夹结构和富含 G-C的区域。52qRNA转录的抑制作用转录的抑制作用RNA的转录抑制剂有三类：的转录抑制剂有三类：（1）嘌呤和嘧啶类似物）嘌呤和嘧啶类似物:53（）（）DNA模板功能的抑制物模板功能的抑制物: 1）烷化剂：氮芥、磺酸酯、氮丙啶、乙撑亚胺。）烷化剂：氮芥、磺酸酯、氮丙啶、乙撑亚胺。 2 ）放线菌素：）放线菌素： 3）嵌入染料：溴化乙锭等）嵌入染料：溴化乙锭等（3）RNA聚合酶的抑制物：聚合酶的抑制物： 1）利福利福平平霉素：利福平霉素：利福平 2）链霉素）链霉素 3）-鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱 4）放线菌素）放线菌素54作业：1）术语解释：转录、模板链、转录泡、启动子、增强子、 沉默子。2）真核生物的RNA聚合酶与原核生物的RNA聚合酶有哪些 异同点？3）简述原核生物的启动子的结构特点。4）简述真核生物的启动子类型及其结构特点。5）原核生物和真核生物的转录是如何终止的？55
