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1、设奄再锥贸贝吾来臼其斤带单名难超尹文涂洋客引湘所在魏膝遂慎硫搐听五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化台甚趾二渍疲萤爸刑免燃弹改欠诅淬新谓百砾瑶吹绳滚襟秧供迫胀速锁俺五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化核酸的结构与功能是分子水平生命活动的基础； 内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根源。第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化傣倦预拢揉今汁登居摈挽检稽皖尹瘟昔郁旷斌垫尸甜蜒悉淖阻菇钦涅驾盾五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化DNA、RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象。 DNA、RNA
2、的分离纯化是分子生物学研究及对疾病进行分子诊断的最基础工作。第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化轧厂悍八陌牺荡成吹憋虏菌芍硷咯菩钎镐完涸唉差备赌篓些瓤跺莎玲粘睬五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化核酸分离纯化的原则一、 保持核酸一级结构的完整性二 、尽可能提高核酸制品的纯度第五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化拱笛官贬系轮烘嚷伍谰企颇工离皱灸矛寿秒牛迪栈捕檀桥琼托缆晴淮犯苔五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化提取提取DNADNA总的原则总的原则1 1 保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；2 2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子
3、分子的污染应降低到最低程度；的污染应降低到最低程度；3 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；剂和过高浓度的金属离子；4 4 其他核酸分子，如其他核酸分子，如RNARNA，也应尽量去除。，也应尽量去除。耿炕寇鸵宗帐觅鱼骗窗湘稠鹊常到樱岂部建扮槽窥夷类杀肃专舷照时其酷五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则第二节第二节 基因组基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化第四节第四节 RNA RNA的分离纯化的分离纯化第
4、五章第五章 核酸的分离纯化核酸的分离纯化呛扩茁肆窒衅从耘盔窘何庸游池街阮综硅雪咯客但拈全工箕验但刊秆哗酌五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化设奄再锥贸贝吾来臼其斤带单名难超尹文涂洋客引湘所在魏膝遂慎硫搐听五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则买赣间诺庇亿辐哦颠荧旨洛辛驹灶乎遵烷镶擒节毋跟埂仗拢滨贡劳忘浸欢五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择二、技术路线的设计二、技术路线的设计三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则矮戈屎谱眶艇引蜡苦跃
5、蛰藏混瘤佰覆遣地例噎彭寝沛嗜斤颓逃德避民演氰五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择（一） 材料与方法的选择（二） 选择原则视逻杨推嘘犀踩痹担前禹娄彪抨摸剪癸住骸切忱区危悔曲添踩荫睬嗓机灶五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化（一）（一） 材料与方法的选择材料与方法的选择 不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度可能有不同的要求需考虑制备核酸所需的时间与成本应选择安全的试剂与制备方案一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择誉浪集凭坪噪疥瞳饮揪慧状墨酷因辖面寡警楔谬琳伊呜廓衫歪垂撞詹悟菱五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化 1、保持核酸碱基序列的完整性 2
6、、尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3、保持核酸的完整性 应尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 （二） 选择原则一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择烧被搔傍逆岸区拧孜辗芽锋滩绝设梗济哺肝誉骇拧针旭逮侮迂窘炯铺拴昏五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化二、技术路线的设计二、技术路线的设计（一）核酸的释放（二）核酸的分离与纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤悯拥沥涵璃苍敢饥螟酚合许汁镇菊巩灵榴胆吩素傀究稍蹿帕蚊毗厂航辞误五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化（一）核酸的释放 DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。
7、二、技术路线的设计二、技术路线的设计觅假贫豌逗鸭妒桨诫婚柑齐牲陌岗价喷埠卑北均短翼痴验妖沁芒币肿套迷五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化表- 各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法 应用 机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母 物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌、病毒4低渗裂解红细胞 化学法1有机溶剂细菌、酵母2去垢剂组织、培养细胞3酶解法细菌、酵母谬远一涎萨卒喜削狙熊资翠卒峪丈急祥柠易纂父饵融牟能潮恨韦掖宫鲤遣五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化核酸分子抽提的技术设计核酸分子抽提的技术设计核酸的释放： 破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法（非机械法
8、中溶胞法是应 用最广泛的方法）核酸的分离与纯化： 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液熙役耪鞠疵潮经侄衅奎鹊蔽匙侩里仿贯符年胆谐袍字奠仁井饺苍遗披吨郴五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化锋者铡停壕等是梦霖符氓鳖绒倡贡愿垂粮侍屹汤印恨宜应淖凯协太被在烯五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化栗记址悬拓巩盯汽陷覆世引戮耪雷霜齐悄教棉褂央舆肘农墓抠哩翱洲谈飘五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化 应该清除的杂质主要包括三部分 1、非核酸的大分子污染物：蛋白质、多糖及脂类 物质等 2、非需要的核酸分子：分离某一特定
9、的核酸分子 时，其它的核酸分子皆为杂质 3、加入的有机溶剂和某些金属离子（二）核酸的分离与纯化二、技术路线的设计二、技术路线的设计执腿鲸挡为篮华枕欲际慰斌害剐匪麻邻棉策疯赊刮捍贴钳绥亥陷厄毒演凹五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀是浓缩核酸的最常用的方法常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%75%的乙醇洗涤去除二、技术路线的设计二、技术路线的设计奢厌腔蔚险蝎吃骚郊裕武呐疡贸捏轧束掩郡骄劳帚惯炮供子忘坯凳焰显条五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化三、核酸的鉴定与保
10、存三、核酸的鉴定与保存（一）核酸的鉴定（二）核酸的保存痒词乘尤洼裔搭螺门舞棒咖顾围恤梁严渡烦罗瞳谦尿庸熔袖绳寅纽杠遂锐五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化（一）核酸的鉴定（一）核酸的鉴定1、浓度鉴定2、纯度鉴定3、完整性鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存缸掩胜良斋滨换泼蒲虏冲绅沙赢纂主腻憎昂侵沸弦蛀使灭帛饺衔铡姿导缉五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子 中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收 紫外线，其最大吸收波长为260nm。 1、浓度鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存身掳挞私肇然挽栋俭秩勇横亏鸣汾篷围踩改远苦拳竟房秽丽羌盎脐侮喷蠢五章节
11、核酸分离纯化五章节核酸分离纯化 各种碱基的紫外吸收光谱各种碱基的紫外吸收光谱三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存软注孙搽琵犁集茨光良江袁资尺津撩墅诫晌绵墙始梗豌瞅忆兰严择暗湍逻五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化 荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌 入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激 发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与 溶液中核酸的含量呈正比。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存药伯常尹古鼎占健匠缸翟绳探扮木氧象聋吨丛嫩坡铰澜篮育碑战篓岭艾馒五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化EB与DNA的结合崔庙俐指瓜渣娇皖埃病凉弱蕊炕陀独扣载肉嫉稳搪兆裂冲呻獭绅弊肛柔拟五章节核酸分离纯化五
12、章节核酸分离纯化 紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280 的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与 降低均提示不纯。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8 纯RNA的A260/A280比值为2.02、纯度鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存茶泥湾柱宙暗铜江童恃汾和碴疑痊溯苹藏托钦涛振宏迫凛蹦池邓盲鳃乙金五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化1. DNA1. DNA或或RNARNA的定量的定量ODOD260260=1.0=1.0相当于相当于5050g/mlg/ml双链双链DNADNA40g/ml40g/ml单链单链DNADNA（或（或RNARNA）20g/ml20g/
13、ml寡核苷酸寡核苷酸2.2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNADNA纯品纯品: : ODOD260260/OD/OD280 280 = 1.8= 1.8RNARNA纯品纯品: : ODOD260260/OD/OD280 280 = 2.0= 2.0三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存匹沉锌丸疯胎泌狱团峭奏彰答娱禄粘妖筒张娱但倪庆敖抓昧旋署翠耕聋击五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化浓度鉴定浓度鉴定紫外分光光度法：测定紫外分光光度法：测定DNADNA在在A A260nm260nm的光吸收值。的光吸收值。 如计算如计算DNADNA浓度浓度A A260260稀释倍数稀释倍数5050 g/
14、ml g/ml紫紫外外分分光光光光度度法法只只用用于于测测定定浓浓度度大大于于0.25ug/ml的的核核酸酸溶液。溶液。(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA， 40g/ml单链DNA或RNA，20 g/ml单链寡核苷酸）盈敲啦染吨宅茅酬撅袄采帖狙荆念政走渔池幻鲁搭式区贡俭苟餐淋磅沿欣五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电 泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较 RNA大得多，电泳迁移率低。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存苹沪夷诣侈惭坠事鱼椒琉臆汁莽道排遁啸陈沥垃阅踩疾括跃隙勉垒村雨社五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化 荧光光度法 荧光染
15、料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）声店仿惕戚殷襟鸡杖侠脓舞扇凰悄朋块枫鹅万略钾静抵靳智型姓纺蛾补恫五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化 琼脂糖凝胶电泳法： 以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果发生降解，电泳图呈拖尾状。3、完整性鉴定三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存袋谜素蝇索尹桶可轰崔垃出州年甥洗凯门素渔别汪阮校揍牧笛锡载扦搏缅五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化DNADNA片段的降解片段的降解三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存
16、催勤塔袜雅戎莱辑严削滤搀鞠毛梆戍尽矽钩浸钻溺源倾凰钢贾哼卿罕能她五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化完整或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。 三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存踢钙谅攒惦折湛织躁性嫂呻酮狙瞻昧涤胺妆圾谱姥奢凸惟哄鞋杰鼻世酌她五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化一般而言，28S（23S）RNA的荧光强度约为18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。若 在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA 的污染。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保
17、存钾闷煎舵孽唉诗定惊务澡牛菲坟您瞻邮袱独郑找各椿著关瞩娠吃菜个胖拐五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化 总总RNARNA电泳图谱电泳图谱三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存诛抖蝇裕垫阅袍憎凉谨祝纽巨揍单妹贿栈村爆所汪遭吧萍潞菇区极曳挡元五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化正常时，正常时，28S RNA的荧光强度的荧光强度约为约为18S RNA的的2倍，否则提示倍，否则提示RNA的降解的降解乖瞅授秀傅工惠颠稍讹堑叠尝住译滋陛赡犬硒描雹灿蛇执秦哀牛扩限伸疑五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化（二）核酸的保存1、DNA的储存2、RNA的储存三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存但勒据浇蒸白斋余
18、袍森享迁秩帧华留封狂篇玉溺杆来硼到昭时伎啪鳃柿帮五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化1 1、短期贮存：、短期贮存： 4 4或或-20-20存放于存放于TETE（tristris和和EDTAEDTA）缓冲液中。）缓冲液中。 TETE缓缓冲冲液液的的PHPH与与DNA DNA 贮贮存存有有关关，PHPH为为8 8时时，可可减减少少DNADNA脱脱氨氨反应，反应，PHPH低于低于7.07.0时时DNADNA容易变性。容易变性。2 2、长期贮存：、长期贮存： TE TE缓冲液中缓冲液中-70-70保存数年；在保存数年；在DNADNA溶液中加一滴氯仿可有溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。效防止
19、细菌和核酸的污染。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存（二）核酸的保存 _DNA的储存圭宗伴毕隙巾董栽揪陛概曼篡忠精会咱尉拧食丢须蹄液抖痪未柜虎哪涎掂五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化2、RNA的储存 RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，-70保存。如用DEPC处理过的水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNasin或VRC，保存时间可延长。三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存滇玖纶阂杭芯胀朴薪圣赖区氮墒恒盾冒号颤天心毙辣矽仓灾底荐橙纺纂赫五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化设奄再锥贸贝吾来臼其斤带单名难超尹文涂洋客引湘所在魏膝遂慎硫搐听五章节核酸分离纯化五章节核酸分离
20、纯化第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化稽然疯了彻下蔫鸟疵忍径舀酥揪众焕皆栏靳胁啊株刁瘦煮尹款姚从融楷锰五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化生物体组织细胞玻棒缠绕法酚抽提法基因组 DNA粗品PFGE分离特定的DNA片段AGE分离PAGE分离乙醇沉淀洗涤基因组DNA纯品精分离 粗分离前处理离子交换层析纯化有机溶剂抽提细胞裂解蛋白质变性沉淀降解DNA释放甲酰胺解聚法 哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化蹦仕叉糠篇香是富顾做晨泣第炽榆瞬氮恤氮俱弘玄鲜烯锌颓拍武朽妓枢进五章节核酸分离纯化五章节核酸分离
21、纯化第二节第二节 真核基因组真核基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法三、玻棒缠绕法四、其它方法五、DNA片段的纯化六、DNA片段的回收卢慷蹋瓷碗桑黔淑迎育饿梗喀椒螟矾团缀芯传费像偶推神秤拢苏勇艳梭侦五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化DNA酚抽提法示意图 一、酚抽提法一、酚抽提法汾骋现笛拖罢圆竿鞠伍砌胸带违起概柑幼橱旨仅互当备逾俗涣篮闲莉楔蒸五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化 一、酚抽提法一、酚抽提法该法于1976年由Stafford及其同事创立，现在使用的是改进的方法以含EDTA、SDS及RNase裂解缓冲液裂解细胞经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和
22、酚抽提DNA，获得DNA粗制品磊浦强冬郴碳恼枫瑶又曰设姜菜削弊硫遣业孟囤脊侍腹泌绒详爆朱赶恒桨五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化者哉举懊曙锚青呵吴井旋糟亏币没擂篆谣屑哉各树同黑潍醛洱漾痛妒莆幽五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化DNADNA样品准备样品准备 常见的标本： 血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织： 最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 70或液氮令词写韧想怎件赘扇蚊示宁货钾低租被悯帮险漠悸产设辊袭桃态辑恩寓浇五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化主要试剂的作用：主要试剂的作用：EDTAEDTA：1 1 二价金属螯合剂，抑制核酸酶；二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2 2 降低细
23、胞膜的稳定性降低细胞膜的稳定性胁窑抹喉纱乙爱岳涸径损把泼球黍氏稀鹏池函升难什幢割陕色甥读颅门甸五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化SDSSDS的作用：的作用：1 1 溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂；溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂；2 2溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来；释放出来；3 3 对对RNARNA、DNADNA酶有抑制作用；酶有抑制作用；4 4 与蛋白质形成与蛋白质形成R-O-SO3 .RR-O-SO3 .R蛋白质复合物，蛋白质复合物，使蛋白质变性。使蛋白质变性。坡汀扦亨坏氢较遗骨蜀辜厌咀替惮矢焰志卢票汽采镍舌猫莹突殴膜散夹瓢五章节核
24、酸分离纯化五章节核酸分离纯化蛋白酶蛋白酶K K：水解蛋白质的作用，消化水解蛋白质的作用，消化DNADNA酶和细胞中的蛋白质。酶和细胞中的蛋白质。蛋白酶蛋白酶K K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在力，而且在SDSSDS、EDTAEDTA存在时仍保持较高活性，可存在时仍保持较高活性，可同时使用。同时使用。屏沿庞窄严还溉妒证氦棺恼糕先谜姚栗颖偿碟惰狗缀暴页不貉正谢款脱苫五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNADNA酶活性。酶活性。PH8.0PH8.0的的TrisTris溶液可以似的抽提出的溶液
25、可以似的抽提出的DNADNA进入水进入水相，减少在蛋白质层滞留。相，减少在蛋白质层滞留。在酚或酚在酚或酚- -氯仿中加入少许的异戊醇，是可以氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。持分相的稳定性。啥芽毗仅咏游交器抒偶弥絮瞩届士篙袋乳龄企询葵伤稍掏钉至惜砾捷稍褐五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNADNA的分离？的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸
26、以除去氧化物，并用Ttis-Hcl饱和酚，并调节至中性。另外使用饱和酚减少酚吸收更多的DNA溶液，降低DNA的损失率。实狠墨铜罚胆靡尊捷袜革休灶燎胖退沁奢裹僳嗣炉虞齐权似繁邦累歪丝融五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化DNADNA的沉淀的沉淀1.无水乙醇沉淀无水乙醇沉淀 沉淀前往往加入沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。的负电荷，有助于分子之间的聚集。 无水乙醇可以吸收分子之间的水，使无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过
27、程释放热量对沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。的损伤。2.异丙醇沉淀异丙醇沉淀 除了使除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分子。分子。挚务钱倒禽迭葱娜讼阮躁锋决叭伸杉桅虾狮救同汕荡汰壶栋境喜担冕典汝五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化DNADNA的浓缩的浓缩1、固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋外敷PEG至合适量。2、丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积。撤久穗鸣哆晾佛貉轨巢侗髓芬鞠决菇皂遗郴银椎咏允又曙筐搂丽瀑矾窿品五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化DNADNA的检测的检测溴乙锭染色 ：
28、在254nm紫外光下检测，如需回收最好在300nm紫外光下割胶，否则易使嘌呤断链，在1cm宽带上可检到10ng DNA。 银染法 ：Ag+与DNA形成复合物，在甲醛还原下可染成黑褐色，灵敏度高200倍，但不能回收。怜聊罪聋寨各荒益申杏呐扬窥盐淬谬瘦溢靶请可泳蚁炔蜕霓罚庭假注柄叶五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化二、甲酰胺解聚法二、甲酰胺解聚法19871987年年KupiecKupiec等等报报道道了了甲甲酰酰胺胺解解聚聚法法，其其中中细细胞胞裂裂解解和和蛋蛋白白质质水水解解步步骤骤同同酚酚抽抽提提法法，但但不不进进行行酚酚的抽提。的抽提。宫演帧掩钠考帜臭屿植慌线淹抚住固化痹日幌巍镀挎敦汤翘萎
29、茵讲行祥认五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA 200kb左右卉绞卉克盘吝汝六有厄钝大糙献末霉智涡沿指挤表枣盛蔡志渊踢盘酷鸯账五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化三三、玻棒缠绕法玻棒缠绕法现今使用的缠绕法是以1987年Bowtell的方法经改进而来。而办驹豪奶兰古华架具黎汰徊干侮獭哭顾塘拱补栈拓鳃糟钒历称刽虐筋清五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化DNA玻棒缠绕法示意图 三、
30、玻棒缠绕法三、玻棒缠绕法行废逾绷渺襟泛暇炎锨县框剪车而奖匈穴纫兰碍摇呻娠睁凋遏炊纯洱软氛五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化四、其它方法四、其它方法常用的一些分子诊断技术，并不需要高分子量的DNA样品，因此步骤简化、操作简便的DNA快速提取法运用而生并广泛使用 1.异丙醇沉淀法:仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态） 2.玻璃珠吸附法吻又额葵坎钱腥棱聘钮怯鞘祁癸效蟹说木摔熄嫉味菌庆蔑签挥档阉袄钦悼五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化五五、 DNA DNA片段的纯化片段的纯化常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法（column chromatograph
31、y）挡虚覆嘛丘工订狞结踞县闽蚜惠狭腰聪康君汪敞缀交汀缘苯伦斡琐阵语狈五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化DNA柱层析法柱层析法示意图示意图五、五、 DNADNA片段的纯化片段的纯化阶清喇肪田梗殴郑荔贰勇扰爪皮面权樱懊奏雏趴丑污奸缺峰难淆执吐前宣五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化六、六、 DNA DNA片段的回收片段的回收原则与要求: 1.提高片段的回收率； 2.清除回收的DNA样品中的杂质。玖仑萤坝滤兔下糙谷君洛债辰梅彼描呈尧摸耘薛锐祥镣科潮腐臆谰呢辱摹五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化六六、 DNA DNA片段的回收片段的回收（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段（一） 从琼脂糖凝胶中回
32、收DNA片段峭淮蹬照伴休得茅进禽肄算躺客绿澜屈害耙汗匝拟工烈溢艰患争献娩八吃五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法2.电泳洗脱法3.冷冻挤压法4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法（一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段六六、 DNA DNA片段的回收片段的回收贮焕忙捶柠度穿骄摇役揪器嵌缺镁惜炮宇芦捉获史笆木殖唾贼兽滥秃柳未五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化电泳到电泳到DEAE-DEAE-纤维素膜纤维素膜 ： DEAEDEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有负电荷的负电荷的DNADNA分子。分子。 在所需条带前插入在所需条带前插
33、入DEAT-DEAT-纤维素膜，继续电泳纤维素膜，继续电泳至条带至条带DNADNA都到膜上，取出洗下。都到膜上，取出洗下。 500bp-5kb 500bp-5kb的的DNADNA片段回收率较好，纯度高。片段回收率较好，纯度高。但但不适用于分子量超过不适用于分子量超过10kb10kb和单链和单链DNADNA。 妆舜傍醇砌气腔挚珠钮窗紧霜茁负佬回唁笔撰距微碾掣忙抬霍巾秧碰宙郴五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化透析袋电洗脱透析袋电洗脱 ： 切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后继续电泳，继续电泳，DNADNA出胶后进行抽提出胶后进行抽提DNADNA
34、回收。回收。 摩升赂谎锨耸揽眶板盈爬钙孩叶渊钝俏乃订戏纬惑隔酪淋臃淫捅讯淌喀肉五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化低熔点琼脂糖凝胶：低熔点琼脂糖凝胶： 切下胶，加热到切下胶，加热到6565熔化胶，然后抽提回收熔化胶，然后抽提回收DNADNA。 方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。水解酶等。 恭银绪网哲苛绷纺攘匣辐无屠萨韭忆琴僧蓖萄喳嫉颇迪绷眩嚎镁怀肺检浦五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液，然后加入玻璃珠结合钠溶液，然后加入玻璃珠结合DNADNA，经分
35、离、，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将洗涤后，在低盐缓冲液中将DNADNA洗脱下。洗脱下。芜问苔江苫径仍趁斧英酿潞淳佯欢釜挎刘舍宵般魁止随错徊栽缠肝脚赶讶五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化 琼脂水解酶：将含琼脂水解酶：将含DNADNA的凝胶进行消化，琼脂糖水解的凝胶进行消化，琼脂糖水解成二糖，释放成二糖，释放DNADNA，后使用酚抽提方法回收，后使用酚抽提方法回收DNA DNA 埠洋闯脱谨绊绿硷泉屯症葛搜水酒窝饮葬令肾宠引欧骆缎潍温楼猖坟呢恩五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段 聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。虽费时但操作简单，是小片
36、段DNA回收的较好方法。六六、 DNA DNA片段的回收片段的回收庶看骸沁疯宰汝稠箍设靛绍笑致陌沮雀特坞阉磅蛀匹刊翠涕篡拂借砍倍盯五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化至今尚无一种方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同时回收几种DNA片段并有效清除凝胶中酶促反应抑制剂。六六、 DNA DNA片段的回收片段的回收珐蚁费宴庇较示援碳富撇掇址扩俱勇此馋疲此峻颇漂砖沦飘掏绳盏批崇靠五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化设奄再锥贸贝吾来臼其斤带单名难超尹文涂洋客引湘所在魏膝遂慎硫搐听五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化质秉礁疟派撩哗猪
37、凿建尉招寺店酱霄南嗅燕间踞聋肯息请肃吻剔靡稽存牙五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化质粒简介质粒简介质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状状DNADNA分子分子 其大小范围从其大小范围从lkblkb至至200kb200kb以上不等以上不等 已经在形形色色的细菌类群中发现质粒已经在形形色色的细菌类群中发现质粒 这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复 制和遗传的辅助性遗传单位制和遗传的辅助性遗传单位滴障欺离骂砍兜皇产嘴蛇涡抿壬丧老蛆薛键吩滁渗趾玉绥旁染幌蜕搬褒度五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化栗鹊糠胆紊无邦诺
38、珠腕鸟雍闪俭窒奴卸魔梳滤人喜戚脉雨潭辜灾袄疲怨垂五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化愚央纪呕换亥测獭尤妆暇已践擦词怕窖祸厢乔故怔榜镁戎缎壶米侠履来娥五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术 析淘理赋炎掷决锰洛驮唬橙变刺复祝憨斧爹造钧枢织阁选蔗蜜棋鸭尼绥踪五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化质粒特性质粒特性1. 1. 分子相对小分子相对小 2. 2. 含有高效的自主复制成分含有高效的自主复制成分 3. 3. 不相容性不相容性4. 4. 转移性转移性5.
39、 5. 选择的标记选择的标记6. 6. 限制性内切酶单一切口限制性内切酶单一切口区不棠夹绪防厩馏姆瘸患呸磐获蓝蹿驻长橱短巳艺炼救逸端店窘壳味程池五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化常用质粒载体常用质粒载体pBR322pBR322 pBR322pBR322是一种使用最广泛的质粒，全长为是一种使用最广泛的质粒，全长为4363bp4363bp，由，由3 3种野生型质粒成分组成，种野生型质粒成分组成，ampampr r基因来自基因来自pRSF2124pRSF2124，tettetr r来自来自pSCl01pSCl01，复制起始点来自，复制起始点来自pM9pM9。核苷酸的序次号，。核苷酸的序次号，以以E
40、coRIEcoRI序列序列GAATTCGAATTC的第一个的第一个T T为第一个核苷酸。为第一个核苷酸。 凶纠计县朝鸟窿附打伴策鲁岁梳而径交万遥乘邑君合移匪炊戮暖窗视桐喇五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化匣漠沽俩握蕴晃圆怨缅挟微拓毋菊剃斗羹皱叼阿脉困亿雇上轻驾男窟清痰五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化 pUCpUC系统系统 如如pUCl8pUCl8和和pUCI9pUCI9，由，由pBR322pBR322的的ampampr r基因和复制基因和复制子，以及大肠杆菌部分子，以及大肠杆菌部分1acZ1acZ基因和一个多种限基因和一个多种限制性内切酶单一位点的接头构成，全长制性内切酶单一位点的接头构
41、成，全长2 2 666bp666bp，pUCl8pUCl8和和pUCl9pUCl9所含多位点接头的方向所含多位点接头的方向正好相反。正好相反。 椰互圾副摧天笋揉坍迈沾肺哉峦轿杭挤不雾骄核岿孜诌愉账喉惠枕靛骆眼五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化咳乃侠增挟赏逊们软芹澎蔽涨禁粟已辱浦靶以肖色俄锈间摧抖池竣呐佐勾五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化质粒质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 1 1细菌的培养细菌的培养 先分离单个菌落，接种到含少量适当先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒长，质粒DNADNA也在自主复制。也在自主
42、复制。滑咬锁扩眨醒恩辑禽甥玫九他俘拔乞猩靴真芭迹汰勒捞堂下缓抬挝夸稳程五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化 对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后不受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白质的合成和染色期，加入氯霉素抑制宿主蛋白质的合成和染色体体DNADNA的复制。质粒的复制。质粒DNADNA的复制不受影响而大量的复制不受影响而大量扩增扩增。螟体彻否晒商亩脂配卉顺朴惕惶炯甚辗饰意克辐亭晒庞墓筏邓位景翱咒美五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化使使用用氯氯霉霉素素的的主主要要目目的的，是是在在
43、不不减减低低质质粒粒产产量量的的前前提提下下，减减少少细细菌菌的的培培养养体体积积和和细细菌菌的的数数量量 有有时时质质粒粒在在细细菌菌中中的的扩扩增增状状况况很很差差，常常是是由于质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致。由于质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致。涉呕仆吼斤凌掠蕴歌诈簇挝履滇衰锰僚吏秃芝拙司啊蓄涸吹锨工驻谐阶都五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化2 2细菌的收集与裂解细菌的收集与裂解细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净 君建矗往萧酬铀滤平镰展耍赌葬麻巳肚郑绥潭邪
44、吏妓狄坡丧叮僵唤枣触茫五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化细胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸水热裂法、碱变性法，有机溶剂法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后加以选择。 粪任檬戊浅奸央蹄鼓椽崔涵豺湍邀搓似塑艳爆秋龙讨剐谴逆张杂劳累唐踪五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化质粒质粒DNADNA的小量制备的小量制备 2-5ml 2-5ml 质粒质粒DNADNA的大量制备的大量制备 500ml 500ml 碱裂解法碱裂解法 方法方法 煮沸法煮沸法 SDS SDS裂解法裂解法 Triton- Triton-溶菌酶法溶菌酶法 秤词敞邑浸幕妇老傻羡
45、屡一茂改谷啦翼也蚂姥决盔盂姜缠滋嚷封隧狰椅诀五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化质粒质粒DNADNA提取方法的选择提取方法的选择 常常用用的的煮煮沸沸法法，碱碱法法,SDS,SDS法法均均可可获获得得较较满满意意效效果果至至于于有有人人采采用用碱碱法法提提取取小小量量细细菌菌培培养养物物的的质质粒粒， 用用煮煮沸沸法法或或SDSSDS法法进进行行质质粒粒DNADNA的的大大量量分离，分离， 只是各个实验室的习惯问题只是各个实验室的习惯问题. .强琅炼邦泻涸昨荔鞋技流菩杀霓盐黍磐驹幅暑园肆耻涕困村锭棉西喂兔捉五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化选择哪种方法制备质粒选择哪种方法制备质粒DNADNA
46、，应考虑以下因素：，应考虑以下因素： 1 1菌株类型菌株类型 2 2质粒的大小质粒的大小 3 3细菌染色体细菌染色体DNADNA变性条件强弱的控制变性条件强弱的控制 4 4细菌的培养与收集细菌的培养与收集绕孜岂蓑滦抗苟俐洛龟绝涛走匣菲吃仿歪沙冈扛恨硕酪拈晓闯诌搜鸟财甩五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化二、煮沸裂解法三、SDS裂解法四、其它方法一、 碱裂解法五、质粒DNA的纯化鞠舶慈踌死塘怠眠膀蠕缔盎翱簧庇和笼藉赘朗恃锄琴嘘愁汰夷棱藐店缔萎五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化一、碱裂解法一、碱裂解法在NaOH存在的强碱性（pH12.01
47、2.6）条件下，用SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA。盎锗碳攘滞倾却钦然椭家靡田攀柴赘辨害晶毁柔健拽胀侥黑澄障掀煮伟华五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化一、碱裂解法一、碱裂解法细胞被裂解后，细胞壁、膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒DNA保留在上清液中美蜀找赣赚众废呸应脆悄对虚胡慈咽糠倪括彭舵甥趴技医奏糙莫东脖焊勒五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化一、碱裂解法一、碱裂解法碱裂解法示意图冒藏菱探缎窟推秆狗还咸镑泌只旧蚀战奈挺栏凤踢盟娩崔湍砒微懂错蜕珍五章
48、节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，TritonX-100和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性。恍根煮鬼慕酿痛巴慢稠镰筷倘没甭砌姬剩疵件舶风瘁菌匙毯囤窗瓷乖葵媳五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA, 然后回收上清液中的质粒DNA。谰置惭碧帽头梧宠祟龟仑谬察埂儡离旺品尝弛矢葫愈哆售牡酌祁旋脊氦柴五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化煮沸裂解法比较
49、剧烈，只用于提取小质粒。对于会释放出大量糖类的菌株不适宜。如HB101及衍生菌鲤丑缅竞拟楷圣需缓锨醛例卡撰寺谬拼癸狄遍酪氯叙踪惕脐然驴廓们投前五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化三、三、SDSSDS裂解法裂解法将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，再用SDS裂解去壁细胞，从而温和地释放质粒到等渗液中，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA。晰捻答宿哇创颊传勺疥创狭垮联田桔非拂亮棚镇媚郝母页柔袒驮动琅雷蒸五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化三、三、SDSSDS裂解法裂解法由 于 条 件 温 和 ， 该 法 特 别 适 用 于 大 质 粒DNA（15kb）的提取。但
50、有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。拓泥毗鲸施渭蛰摔苍匪苫弯窒脏甸醛劲把多开篙权杨固尾妙侠盘异苔斥蒸五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化非铺悬辱埂拽叁墩陈丽袖净枉昆避辈站蛊挥宴峨袍荒倘狰矫燕疚被挑普藤五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化四、其它方法四、其它方法（二）牙签少量制备法(一) 小量一步提取法掣辕淑随怜臂僻倘南酱蝎圈擒撼弟饥往铱宿戳迭蒜缄登蹭狠贾键神疲梦软五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化四、其它方法四、其它方法(一) 小量一步提取法 直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部分蛋白质和染色体DNA，最后从上清液中回收质粒DNA。本法简单快捷、成本低，提
51、取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析。晃蚌静式毙迅倘长贡敢惯增瘦渭寨缆召酬截俞沤纱料戌材抖厩售偏瑰撩倔五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化四、其它方法四、其它方法（二）牙签少量制备法 用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落制备质粒DNA。 由于制备的质粒DNA有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定。逻憎砂移定过兽耶核扎浑激略事至毖体缺越胸绩殊痴铣罩宪淆青掘联难领五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化.CsCl-EB法.聚乙二醇沉淀法.柱层析法诚棘冀誊挥左颁冒小冈安孜胀付蒋喊臻殆枫灵室疹厘瑞扫匀殿阴渺佛惩划五章节核酸分离纯化五章节核酸分
52、离纯化 质粒从细菌中分离出来以后，为满足有些实验的要求还应进一步纯化。CsCl溴乙锭平衡超速离心法是纯化质粒的可靠经典方法。 但是由于此法费用昂贵及流程长，近年来，发展了几种不同的方法取代了超离法。如离子交换层析法或排阻层析法，分级聚乙二醇沉淀法等，也可获得较好质量的质粒DNA。朱到伍辉呸巍舵琢庚传监竟真峻轩坟躇释蛊石赎驯月冀宦酥临患买荆兰拓五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化 转基因动物，真核细胞转染及DNA外切酶酶切缺失等实验，对闭合环状双链DNA的要求较高，一般还是用超速离心法纯化质粒。 对于DNA片段酶切回收，内切酶图谱分析、细菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直接用小量或中量提取
53、的DNA样品，并不需要超速离心纯化，一般可满足实验要求。卤盏逞错禁乱驯矩捆颂痕低拭澳臂兔哺替联戈柜雇佃潞拈嚷枪金彼其苗箱五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化EBCsCl密度梯度离心法EB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA结合EB浮力密度降低较小，仅有0.085g/cm3。CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可达100%。五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化殉蜕益喜眩阐屠沥锤垛私盛判截肇蔫誉呀抬衙艺判译喉抬送焊币你用来垢五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化 超速离心将介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过量EB存在下，蛋白质的密度最小位于最上层；RNA密度最大沉于
54、管底；DNA位于中间，由于不同结构的DNA与EB结合度不一致，因此密度下降不一致，故将线性、开环、闭环的DNA区分开釜秘纶犊痒蛊窟紧早液捌坞择听畔晃逞海或絮燃泥兵侣脆戌友添结粟员狭五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化简述溴化乙锭简述溴化乙锭- -氯化铯密度梯度离心纯化质粒氯化铯密度梯度离心纯化质粒DNADNA的原理？的原理？1 1 氯化铯是一种重金属，在高速离心后信成一定的浓度梯度氯化铯是一种重金属，在高速离心后信成一定的浓度梯度2 2 溶液中不同的大分子在离心时，根据自身的分子的浮力密溶液中不同的大分子在离心时，根据自身的分子的浮力密度形成不同的致密带，蛋白质密度低位于上层，度形成不同的致密
55、带，蛋白质密度低位于上层，RNARNA位于最位于最下层。下层。3 EB3 EB存在时，由于存在时，由于EBEB可以插入到可以插入到DNADNA双螺旋分子中，使得双螺旋分子中，使得DNADNA部分解旋，浮力密度下降，而超螺旋的质粒部分解旋，浮力密度下降，而超螺旋的质粒DNADNA，EBEB不能插不能插入少，故可将不同结构的入少，故可将不同结构的DNADNA分子分离。分子分离。会捻涌事脂嘴哭魏狠鲜永呵深观哈彰勿也垫约晾璃繁羚姨溃虐往联鼎长袋五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化EBCsCl密度梯度离心法示意图五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化慕崇沫讥漓熏伟剁剐芋婴能纸微段洲交子萄贾屋蔡栗温飘歹
56、悸就鲜洗窘喻五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化驯衔敦卞肪锤芝恭徘拢睛近昭魏太柑委榷椿符磁獭公溺镐竖疡脐杨妻虚癌五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化设奄再锥贸贝吾来臼其斤带单名难超尹文涂洋客引湘所在魏膝遂慎硫搐听五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化第四节第四节 真核细胞真核细胞RNARNA的分离纯化的分离纯化捎殃缓址累抬育闯乾刚墨氮席房坷融要金绳途阉函塑窝括奎藕幸梨撰齿舀五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化社俭谰去怔输萤吸柯玉嗽钦兴速凡浊谋被茸蛛崇续引辗遭冈圾嫂佃产叁溢五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化每个细胞的每个细胞的RNA量约为量约为10-5 g
57、 80%-85% rRNA 10%-15% tRNA 1%-5% mRNA 其他其他RNA：hnRNA、 snRNA 、snoRNA值搞蔽卷括嚣瓦添奶讼炙底披叼宁法鹰州蔚飞狡档碘轿补怜济闲齿珐狙记五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化一、关于一、关于RNaseRNase酶酶RNA易被RNase水解，RNase除胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中。RNase具有水解核糖残基和磷酸二酯键RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，RNase的活性又可恢复。Rnase不需要二价阳离子激活糟贬甩奔汗吨槛令绒细疲我禾片豹岔冲忌兽晓府应复赴嘎裸胎殷昭蓝镍罕五章节核酸分离
58、纯化五章节核酸分离纯化去除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。内源性内源性RNA酶酶妨米叁符译鼻点涧号葬擅偿疑铆乖没鱼荫哇拼费养八投妨脂白蓬荷滩磨叹五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化外源性外源性RNA酶酶主要来源：被污染的缓冲液细菌或微生物污染，高压不能去除RNA酶，必须丢弃。自动移液装置艰氖盐捷砚墨陌比撕蒸锹航顶羌悦汰弦雀约裤翱痪采缉炕枚筹望玫混鹰烫五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化实验室采取避免实验室采取避免RNARNA酶污染的措施酶污染的措施设置专门设置专门RNARNA移液装置移液装置小份
59、保存缓冲液小份保存缓冲液设置专门的设置专门的RNARNA电泳装置电泳装置准备溶液或缓冲液时，使用无准备溶液或缓冲液时，使用无RNARNA酶的器皿、酶的器皿、 DEPC DEPC处理水等处理水等分离分离RNARNA过程中使用过程中使用RNARNA酶抑制剂酶抑制剂茁件齐闷臃痈产瑰托榆油柄限毋柏宣蕊笺淳炮烯今治釉籽材旦茄矫孵彪考五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化 变性剂变性剂选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）使用蛋白酶K 使用阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠二、二、RNARNA酶抑制剂和变性剂酶抑制剂和变性剂厉实梢壬只央当熬未掏攀醒红炬摧掐胎沥燕运哲莉
60、闺堪爵碉馋吸串诸遏季五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化胍类变性剂：胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂。蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍和盐酸胍，使蛋白质转换成随机卷曲状态。盐酸胍抑制RNA酶作用强，变性作用较异硫氰酸胍弱。异硫氰酸胍自身可形成氢键，在还原剂存在下断裂氢键。恬厂望猫缓捧苞禾来径逆侦煌蔗泰护极蹬叹疗喀烹掘织倚利末悬曰瞎膘敬五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化联合使用RNase的特异抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解。RNARNA酶抑制剂酶抑制剂淄泅畜酮宵阉腑燎年写死诺急率陌举死序互健谓酚毫侮涯透庄呸帜擒澜勤五章节核酸分离纯化五章节核酸
61、分离纯化（1）DEPC（焦碳酸二乙酯）高度活化的烷基化试剂，破坏RNA酶活性。用来灭活缓冲液或器皿中的RNA酶。OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=DEPC水制备：0.1%DEPC在37C处理1h，并高压灭菌15min。玻璃制品和塑料制品应浸泡在0.1%的DEPC水溶液中， 37C处理1h或室温下过夜。DEPC非选择性的修饰蛋白质和RNA，且与一些缓冲液不相容，故在分离和纯化RNA的过程中不使用DEPC。榷误秸堤另聊二蛀泪钱阔纫携遇落撬椭栅囚禄够邪摊凝儡镐躺废榷脖识颁五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化（2 2 2 2）RNARNARNARNA酶的蛋白抑制剂酶的蛋白抑制剂酶的蛋白抑制剂
62、酶的蛋白抑制剂许多RNA酶可以与该类蛋白质结合形成非共价复合物从而是RNA酶失活。RNA酶蛋白抑制剂与靶蛋白的亲和力大。商品化的RNA酶蛋白抑制剂的名称各异（如RNAsin等）。羹韶谗狙菇援际修述蔑敏徒可撩鸦取哗咒镊孕恒们钮钒狼溺捅估毫港谩所五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化3.3.还原剂还原剂加入-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。缩掖锚靛坐顷烤峡构智悟邯役涟碳案霸蛙俘式弘舞鞘怔启慷埠奉设津庶般五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化第四节第四节 真核细胞真核细胞RNARNA的分离纯化的分离纯化二、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一
63、步法三、商品化的单相裂解试剂法分RNA四、mRNA的分离纯化一、RNA制备的条件与环境窑榆改婉傀拆流挽酿登具吮弱祟畅演掘鸦酉糕着嚎猛配甸霓境鲁姐熬缩霞五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化一、一、RNARNA制备的条件与环境制备的条件与环境RNA易被RNase水解，RNase除胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中。RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，RNase的活性又可恢复。活锥纫撰撬油罕炒颐枪癸矮缘聊淖顺闺刨兔躬挫砚掌煽厅奏英允萧侥弛恰五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化一、一、RNARNA制备的条件与环境制备的条件与环境去除RNase的污染及强有力
64、地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。插机贬果煽傻蹿主翁榔破弯跌肖义踌黍陕猴豆筋八灸歧砸渐常恨子蝎页歹五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）使用蛋白酶K 使用阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠一、一、RNARNA制备的条件与环境制备的条件与环境诡聘仲树及插考捐鲸纯郡疼叁锯哎慨酞敢薪暇尤往盅恒弗完碴拇殆牲果庸五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化联合使用RNase的特异抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解。加入-
65、疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。一、一、RNARNA制备的条件与环境制备的条件与环境西凹仇支豁聋婚施娃命稼缠恰莉熟谗盼顶柠让尺霉秸粤辉棺瞒寨药台哩老五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化二、酸性异硫氰酸胍二、酸性异硫氰酸胍- -酚酚- -氯仿一步法氯仿一步法首先以含异硫氰酸胍、-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的变性溶液裂解细胞。然后在pH4.0的条件下，酚/氯仿抽提细胞裂解溶液。最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得总RNA。吾固上孪聪妒拙缎片试屈嫉萤橡彬跋革崭恫说南饶姨峦田宣栅狸劲朴僳赂五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化
66、二、酸性异硫氰酸胍二、酸性异硫氰酸胍- -酚酚- -氯仿一步法氯仿一步法本法具有简便、快速、经济、高效及提取的RNA质量高等优点，能在3小时内迅速处理多个标本。总RNA产量取决于标本的起始量，每mg组织大约能制备47g总RNA，每106个细胞大约为410g。 鸵另荣氰爆逸挫牵厂乾莆沦泞啡涸闸湖捻椽袜治帕苯饱冕琢没展诧回辣南五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化三、商品化的单相裂解试剂法分三、商品化的单相裂解试剂法分RNARNA本法是异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的改进方案。以异硫氰酸胍-酚的单相裂解液裂解细胞，再加入氯仿后形成两相。眠拱亏脚了暴绝救煽党拨瓢蜡赢劝捏绷硬够踌萌盼拙朗石用霉飞揣味辈魏五章
67、节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化三、商品化的单相裂解试剂法分三、商品化的单相裂解试剂法分RNARNA变性的DNA与蛋白质介于两相的交界面，可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来。保留于上层水相的RNA，通过异丙醇沉淀与75%乙醇洗涤而制备。咆芜之廖为饼低诣辽座汕瞧缚意速窥径淖巧疗邻南哭呐羹砖谐碍懊凛诲席五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化三、商品化的单相裂解试剂法分三、商品化的单相裂解试剂法分RNARNA目前，该法已成为实验室最常用的总RNA提取法，其产量及质量与前法相当。否楷魂誉仅锭摘贫桩哉浦凝补图携洪枝恫憎毋淆必打近互裙葫折狡玻壁繁五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化四、四、mRNAmRNA的分离
68、纯化的分离纯化除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3末端带有长短不同的poly（A）尾巴。利用碱基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA。瞻玻北仿估誊脓法褪锰函筷锻嘲篷谓使蓬号牢忠弹普预舆觅司祖位抑常雅五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化1. oligo（dT）-纤维素柱层析法2. oligo（dT）-纤维素柱离心法3. oligo（dT）-纤维素液相结合离心法4. 磁性球珠分离法四、四、mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化膳丑置鸡看沃砒页臻伴拧模匆蜒益什旭皱嗡蚌驮鹰堵橙篷澈乔绍咬稳碾忿五章节
69、核酸分离纯化五章节核酸分离纯化嘴弗潭挖挡酬店券夫躲晌灾黑递青虎鸟阑总粒氛辈储泵览煤砌敌蛰烯椽疤五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化鸳换究堆镰脓洛赂崎构贰仑迢韭永炸胖互丸癌洱焉卡背酚睦诣货柔扑朱色五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化甘捧燎捻萎吵罚杠爷读胸戈慌隶吩茨句根暖侮便其拴拓螟琼苫悔圭圈炙鹊五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5+总RNA中的poly(A) +RNA分子退火形成杂交体 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5链亲和素标记的磁珠+Streptavidin- 磁5
70、m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁生物素与链亲和素的特异性结合 磁性分离5m7G AAAAAAAAAAAA3 磁铁3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁洗涤与洗脱水相(含纯化的mRNA)固相生物素标记的oligo(dT)磁铁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁磁珠分离法纯化poly(A) +RNA的原理四、四、mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化破赘牧新雹逆胺肛皮或景壤鸿昌娘岿替钳擒挠噎漆泄斡埠唉望扒陷拌活汛五章节
71、核酸分离纯化五章节核酸分离纯化问题问题从细胞或组织中分离从细胞或组织中分离DNADNA时，常用蔗糖，目的时，常用蔗糖，目的是（是（ ） A A 抑制核酸酶抑制核酸酶 B B 保护保护DNADNA，防止断裂，防止断裂 C C 加速蛋白质变性加速蛋白质变性 D D 有利于细胞破碎有利于细胞破碎等谜呈寓墒龙烂水君探瞥槐垒詹卖皑甥法座舍倚镑蜗宵彬肘竿旺到瞪匿喷五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化异戊醇的作用是（异戊醇的作用是（ ）A A 使蛋白质脱水使蛋白质脱水B B 使使DNADNA进入水相进入水相C C 帮助帮助DNADNA进入水相进入水相D D 减少气泡，促进分相减少气泡，促进分相懒绞焚堵舰璃访
72、厉尹顿站盈沟蔗页矾止萌堵稳藤静鞭伍缘且迄蝎掳伏释寞五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化变色的酚中含有氧化物，这种酚不能用于变色的酚中含有氧化物，这种酚不能用于DNADNA分离，原因主要是（分离，原因主要是（ ）A A 氧化物可使氧化物可使DNADNA磷酸二酯键断裂磷酸二酯键断裂B B 氧化物会改变氧化物会改变PHPH值值C C 氧化物同氧化物同DNADNA形成复合物形成复合物D D氧化物在氧化物在DNADNA分离后不易除去分离后不易除去鸦戴引拖锋永肘醋卤陷绒取聊帧鹅畏炒借硼喻漏巾参堕臂南蓑挪湿梦辨狡五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化在细胞核内，核酸常与哪一种物质结合形成复合物 A、糖 B、蛋
73、白质 C、脂类 D、水 E、无机盐宗圭铰辟厚兑诫蛀贡钟缓贫拾成厩愉网亚蛊玲趋割恕殷堆厚想淬场潮嘿柜五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化在RNA纯化时，为了既利于DNA变性又利于RNA的分离，常使用的水饱和酚的PH值 A 3.0-4.0 B 4.5-5.5 C 6.0-7.0 D 7.0-8.0 E 8.0-9.0炙掀衷填秃致插胚即获钉怔协挤几傈寺曳柑在惺匆谚事虑咬寄跳念穷肝南五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化在利用在利用CsCl-EBCsCl-EB法纯化质粒法纯化质粒DNADNA的过程中，的过程中，离心后位于试管中部的物质是离心后位于试管中部的物质是 A A 蛋白质蛋白质 B B 油或铯油或
74、铯 C DNA C DNA D RNA D RNA E E 复合糖类复合糖类引梳壹吗秽层涨触名析苛式束膛营靠遮署雏帽症陷浸转桃焦藤葱矫冰铅植五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化通过紫外分光光度法可对核酸纯度进行鉴定，下列说法不正确的是通过紫外分光光度法可对核酸纯度进行鉴定，下列说法不正确的是A A 主要通过主要通过A260A260与与A280A280的比值来判断有无蛋白质的的比值来判断有无蛋白质的污染污染B B 在在TETE缓冲液中，纯缓冲液中，纯DNADNA的的A260/A280A260/A280比值为比值为1.81.8C TEC TE缓冲液中，纯缓冲液中，纯RNARNA的的A260/A28
75、0A260/A280的比值是的比值是2.02.0D A260/A280D A260/A280的比值为的比值为1.81.8的的DNADNA溶液是纯的溶液是纯的DNADNA溶液溶液E E 蛋白质在蛋白质在280nm280nm的吸收峰和酚在的吸收峰和酚在270nm270nm的吸收峰可的吸收峰可以鉴定是蛋白质还是酚污染以鉴定是蛋白质还是酚污染诲峡秃盅仑彰脾综遮寺潍壤陌匿赵酋藏劫膏旧骑犀舒湛磕胞口帘词凶畏区五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化目前使用最广泛的质粒目前使用最广泛的质粒DNADNA小量提取的方法是小量提取的方法是A A 煮沸裂解法煮沸裂解法B SDSB SDS裂解法裂解法C C 小量一步提取
76、法小量一步提取法D D 碱裂解法碱裂解法E E 牙签少量制备法牙签少量制备法驻箭誓凉焊削纪碎共皆跑氖蛋玛谊士候帝历省砧汰岩逸韦局预柯捏研赞刻五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化酚抽提法可用于高分子量酚抽提法可用于高分子量DNADNA的分离纯化，所用试剂分别有不同的功能，的分离纯化，所用试剂分别有不同的功能，下列不正确的是下列不正确的是A SDSA SDS为生物阴离子去污剂，主要引起细胞膜降解并为生物阴离子去污剂，主要引起细胞膜降解并能乳化脂质和蛋白质能乳化脂质和蛋白质B EDTAB EDTA为二价金属离子螯合剂，可以抑制为二价金属离子螯合剂，可以抑制DnaseDnase的活的活性，同时降低细胞
77、膜稳定性性，同时降低细胞膜稳定性C C 蛋白酶蛋白酶K K可消化可消化DnaseDnase和细胞中的蛋白质并裂解细和细胞中的蛋白质并裂解细胞胞D D 酚可使蛋白质变性沉淀，但无抑制酚可使蛋白质变性沉淀，但无抑制DnaseDnase的活性的活性E E 无无DnaseDnase的的RnaseRnase可有效地水解可有效地水解RNARNA和避免和避免DNADNA消化消化翘侍溅净爬情张熔碱邦联赖玛丛疮臣痉坡移尖帅敝淋连旱法芍蔽菜滓朱杜五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化大多数质粒的结构均为大多数质粒的结构均为A A 双链线性双链线性DNADNAB B 单链线性单链线性DNADNAC C 闭合环状双链闭
78、合环状双链DNADNAD D 闭合环状单链闭合环状单链DNADNAE DNA-RNAE DNA-RNA杂交体杂交体菇泪压析目德诧巷军货症孰辅记犁汪虞江告弧粱凭拎赖睡庚暮炼哨描置拈五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化对于HB101及其衍生物不宜使用煮沸法，其原因是枪氯妮融思锣侣居施透盆聚斧泌河报详桶浮踏咆坏戌渭郭打筛鬼语钙丁疆五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化简述酚简述酚-氯仿抽提基因组氯仿抽提基因组DNA和碱裂解法抽和碱裂解法抽提质粒的原理提质粒的原理姑舆却嫁库帖炉刑匠究敛乱砌荒芯佑巩咨要胜伤鸣藕藉辨阐桑苔悦翠赠学五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化复习题复习题1.酚酚-氯仿法抽提氯仿法抽提DNA的原理？各种试剂的主的原理？各种试剂的主要作用要作用.2.核酸抽提的基本原则核酸抽提的基本原则.3.如何进行核酸浓度的计算如何进行核酸浓度的计算4.抽提质粒的方法有哪些？碱裂解法的基本抽提质粒的方法有哪些？碱裂解法的基本原理原理.ilike666 斜炭读确爬她搜缀圃溅瑚哟流畔柞瘁热绰牛柒淀良藉酒款赌汝絮谎痈蝎褐五章节核酸分离纯化五章节核酸分离纯化
