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1、耳聋基因检测与一级预防耳聋基因检测与一级预防1XIQI亿人年耳聋防治耳聋防治 是重大医学难题是重大医学难题全球听力障碍人数(WHO)N Engl J Med. 2007耳聋基础耳聋基础2XIQI数据来自：第二次（2006年）全国残疾人抽样调查中国耳聋人群庞大中国耳聋人群庞大耳聋基础耳聋基础3XIQI 先天性听力障碍发病率：先天性听力障碍发病率： 1-31-3 全国每年新增耳聋患儿：全国每年新增耳聋患儿： 2-62-6万万 先天性听力障碍发病率高先天性听力障碍发病率高每每1000010000新生儿中先天性新生儿中先天性出生缺陷的发生率出生缺陷的发生率耳聋基础耳聋基础4XIQI导致严重后果：语言障
2、碍（十聋九哑）导致严重后果：语言障碍（十聋九哑）目前无有效治疗方法，主要依赖助听器与人工目前无有效治疗方法，主要依赖助听器与人工耳蜗植入等辅助手段耳蜗植入等辅助手段影响终生：家庭社会负担沉重影响终生：家庭社会负担沉重p每个听障患儿增加社会成本约每个听障患儿增加社会成本约20-5020-50万元万元先天性听力障碍危害性高先天性听力障碍危害性高耳聋基础耳聋基础5XIQI效果依赖早期发现、早期诊治和防控效果依赖早期发现、早期诊治和防控 助听器验配助听器验配 人工耳蜗植入人工耳蜗植入先天性听力障碍高度可干预性先天性听力障碍高度可干预性 言语康复训练言语康复训练耳聋基础耳聋基础6XIQI先天性耳聋防治思
3、路先天性耳聋防治思路东部地区东部地区中部地区中部地区西部地区西部地区UNHSUNHS及干预网络及干预网络的建立与实施的建立与实施聋病基因孕前产前筛查聋病基因孕前产前筛查降低出生率降低出生率高危因素筛查及干预高危因素筛查及干预模式的建立与实施模式的建立与实施关口前移关口前移重心下移重心下移重心下移重心下移偏远地区偏远地区重心下移重心下移儿童保健网络儿童保健网络筛查及干预筛查及干预耳聋基础耳聋基础7XIQI耳聋的病因复杂：遗传性病因占主要部分遗传性病因占主要部分明确的遗传因素为耳聋的预防创造条件明确的遗传因素为耳聋的预防创造条件耳聋基础耳聋基础8XIQI非综合征性耳聋基因60个p显性 30个p隐性
4、 50个p线粒体 2个pX-连锁 4个综合征性耳聋基因40个遗传性耳聋具高度遗传异质性遗传性耳聋具高度遗传异质性HereditaryhearinglossHomepage耳聋基础耳聋基础9XIQI常见耳聋基因少，占遗传因素多常见耳聋基因少，占遗传因素多pJournaloftranslationalmedicine:GJB2mutationspectrumin2063Chinesepatientswithnon-syndromichearingimpairmentpAmerican journal of medical genetics:Molecular etiology of hearing
5、 impairmentassociatedwithnon-syndromicenlargedvestibularaqueductinEastChina.pAmericanjournalofhumangenetics:Maternallyinheritedaminoglycoside-inducedand nonsyndromic deafness is associated with the novel C1494T mutation in themitochondrial12SrRNAgeneinalargeChinesefamily.针对常见耳聋基因的一级预防具有高度可行性针对常见耳聋基因
6、的一级预防具有高度可行性常见耳聋基因占遗传性耳聋常见耳聋基因占遗传性耳聋50%50%以上，药物性耳聋以上，药物性耳聋40%40%以上以上pGJB2 GJB2 （40%-50%40%-50%）pSLC26A4 SLC26A4 （15%-20%15%-20%）p线粒体基因线粒体基因 （40%40%以上药物性耳聋）以上药物性耳聋） 常见耳聋基因检测10XIQI基因检测与婚育指导基因检测与婚育指导产前诊断产前诊断常见耳聋基因筛查常见耳聋基因筛查常见耳聋基因检测11XIQI聋病基因筛查在北京、上海等重点城市已得到聋病基因筛查在北京、上海等重点城市已得到初步开展，筛查技术成熟初步开展，筛查技术成熟pGJB
7、2GJB2pSLC26A4SLC26A4p线粒体线粒体DNADNA突变热点突变热点常见耳聋基因筛查常见耳聋基因筛查常见聋病基因筛查使先天性听力障碍的预防成为可能常见聋病基因筛查使先天性听力障碍的预防成为可能常见耳聋基因检测12XIQI耳聋基因筛查与预防模式耳聋基因筛查与预防模式高危筛查模式高危筛查模式p目标：高危人群（耳聋人群及其亲属等）目标：高危人群（耳聋人群及其亲属等）p筛查手段：全序列测定为主（筛查手段：全序列测定为主（GJB2GJB2、SLC26A4SLC26A4和和MT-RNR1MT-RNR1）p筛查时间：孕前、婚前、恋前筛查时间：孕前、婚前、恋前普遍筛查模式普遍筛查模式p目标：正常
8、听力人群目标：正常听力人群p筛查手段：快速筛查为主，序列测定为辅筛查手段：快速筛查为主，序列测定为辅(GJB2(GJB2、SLC26A4SLC26A4和和MT-RNR1MT-RNR1三大基因的热点突变三大基因的热点突变) )p筛查时间：孕前或孕早期筛查时间：孕前或孕早期常见耳聋基因检测13XIQI耳聋基因高危筛查耳聋基因高危筛查试点及合作单位：上海市长宁区残联会员试点及合作单位：上海市长宁区残联会员常见耳聋基因检测14XIQIGJB2双等位基因突变（29.5%）SLC26A4双等位基因突变（14.1%）线粒体基因突变（6.0%）原因不明：（50.3%)常见耳聋基因突变检出比例：常见耳聋基因突变
9、检出比例：49.7%49.7%耳聋基因高危筛查耳聋基因高危筛查N200N200例例常见耳聋基因检测15XIQI耳聋基因高危筛查耳聋基因高危筛查优缺点分析优缺点分析常见耳聋基因检测16XIQI耳聋基因普遍筛查耳聋基因普遍筛查育龄或孕早期女性育龄或孕早期女性隐性基因突变携带者隐性基因突变携带者配偶基因芯片筛查配偶基因芯片筛查耳聋基因芯片筛查耳聋基因芯片筛查夫妇双方均为同证夫妇双方均为同证基因突变携带者基因突变携带者线粒体线粒体A1555GA1555G突变突变产前基因诊断产前基因诊断遗传咨询遗传咨询药物性耳聋遗传咨询药物性耳聋遗传咨询常见耳聋基因检测17XIQI有效检测样本（怀孕早期孕妇）：有效检测
10、样本（怀孕早期孕妇）：30563056例例孕妇中携带耳聋基因突变孕妇中携带耳聋基因突变160160例，占总样本的例，占总样本的5.235.23% %。携带者自身均听力正常，携带者自身均听力正常，157157例无家族史，例无家族史，3 3例例MTMT突变孕妇家族多人突变孕妇家族多人有药物性聋病史。有药物性聋病史。MTMT突变突变7 7例，对母系成员进行例，对母系成员进行氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素药物预警，以避免药药物预警，以避免药物性耳聋物性耳聋全序列检测非全序列检测非MTMT突变的阳性孕妇配偶突变的阳性孕妇配偶124124例，例，1313家庭具隐性遗传性耳家庭具隐性遗传性耳聋生育风险，聋
11、生育风险， 5 5例进行了产前诊断，例进行了产前诊断，1 1例胎儿为例胎儿为p.V37I/c.235delCp.V37I/c.235delC复复合合杂合杂合，其余为突变携带或野生型，其余为突变携带或野生型。耳聋基因普遍筛查耳聋基因普遍筛查常见耳聋基因检测18XIQI耳聋基因普遍筛查耳聋基因普遍筛查优缺点分析优缺点分析常见耳聋基因检测19XIQI Aa Aa AA父母正常，孩子耳聋 “隐性遗传”耳聋基因诊断与遗传咨询实例耳聋基因诊断与遗传咨询实例？孕早期羊水穿刺产前基因诊断 AA (25%)Aa (50%)aa (25%) 产前基因诊断可有效预防隐性遗传性耳聋的再生育风险产前基因诊断可有效预防隐
12、性遗传性耳聋的再生育风险耳聋遗传咨询20XIQI父母耳聋，孩子个个耳聋 同证婚配：后代100%会耳聋耳聋基因诊断与遗传咨询实例耳聋基因诊断与遗传咨询实例聋人婚前进行耳聋基因检查，可避免同证婚配的出现聋人婚前进行耳聋基因检查，可避免同证婚配的出现 AA AA AA AA AA耳聋遗传咨询21XIQIAA;bb aa;BB 父母耳聋，孩子正常 Aa;Bb“多基因遗传”?携带不同隐性耳聋基因突变的聋人夫妇可生育携带不同隐性耳聋基因突变的聋人夫妇可生育正常听力的孩子正常听力的孩子耳聋基因诊断与遗传咨询实例耳聋基因诊断与遗传咨询实例耳聋遗传咨询22XIQI？Bb正常人群中耳聋基因突变携带率(Bb)为5%
13、耳聋基因诊断可为遗传性耳聋高危人群提供生育耳聋基因诊断可为遗传性耳聋高危人群提供生育风险评估及预防风险评估及预防BBBbBbBb耳聋基因诊断与遗传咨询实例耳聋基因诊断与遗传咨询实例耳聋遗传咨询23XIQI C C“线粒体基因母系遗传”?携带线粒体耳聋基因突变的人群通过指导可避免携带线粒体耳聋基因突变的人群通过指导可避免药物性耳聋的发生药物性耳聋的发生耳聋基因诊断与遗传咨询实例耳聋基因诊断与遗传咨询实例耳聋遗传咨询24XIQI耳聋基因遗传咨询与诊断耳聋基因遗传咨询与诊断 了解病因，帮助确诊了解病因，帮助确诊 预防下一代聋病的发生预防下一代聋病的发生 预防亲属或下一代药物性耳聋的可能预防亲属或下一
14、代药物性耳聋的可能耳聋遗传咨询25XIQI罕见已知耳聋基因检测罕见已知耳聋基因检测 非常见耳聋基因致病患者的分子病因非常见耳聋基因致病患者的分子病因p 罕见已知耳聋基因致病？罕见已知耳聋基因致病？p 罕见已知耳聋基因众多，如何检测？罕见已知耳聋基因众多，如何检测？罕见耳聋基因检测26XIQI本研究所检测的79个耳聋基因常见的耳聋致病基因：Sanger测序罕见耳聋基因检测：定向捕获二代测序p可行性分析：OtoSCOPE芯片（54个已知耳聋基因，2010年，UniversityofIowa）p79个已知耳聋基因的二代测序（本研究）2010年二代测序首次应用于已知耳聋基因检测适宜的检测技术罕见已知耳
15、聋基因检测罕见已知耳聋基因检测罕见耳聋基因检测27XIQI总样本量：183例经济高效的检测方案检测方案（二步法）p第一步：常见耳聋基因Sanger测序（所有样本）p第二步：79个耳聋基因二代测序（排除常见耳聋基因致病样本）二步法优点：节约二代测序样本数量二步法优点：节约二代测序样本数量罕见已知耳聋基因检测罕见已知耳聋基因检测罕见耳聋基因检测28XIQI79个已知耳聋基因病因构成图常见耳聋基因突变：35.5%pGJB2:19.7%pSLC26A4：12.0%pMT-RNR1:3.8%罕罕见耳耳聋基因突基因突变：15.8%罕见已知耳聋基因病因构成：15.8%罕见已知耳聋基因检测罕见已知耳聋基因检测
16、罕见耳聋基因检测29XIQI罕见耳聋基因的异质性强罕见基因突变分布图p致病突变广泛分布于15个基因中Novel mutation 91.8%(45/49)Reportedmutation:8.2%（4/49)p新发突变占绝大多数致病突变是否报道分布图Orphanet Journal of Rare Diseases2013,8:85罕见已知耳聋基因检测罕见已知耳聋基因检测罕见耳聋基因检测30XIQI新耳聋基因克隆与发现新耳聋基因克隆与发现 所有已知耳聋基因检测后都为阴性p 新耳聋基因致病？p已知耳聋基因非编码区致病？p已知耳聋基因大片段缺失？pp新耳聋基因克隆31XIQI遗传性耳聋家系连锁分析
17、遗传性耳聋家系连锁分析遗传标记遗传标记基因型分离基因型分离表型分离表型分离基因型基因型- -表型共分离表型共分离耳聋基因的定位克隆耳聋基因的定位克隆新耳聋基因克隆32XIQIp 外显子捕获外显子捕获/ /二代测序二代测序 二代测序二代测序耳聋基因定向外显子捕获耳聋基因定向外显子捕获/ /测序平台测序平台排除已知耳聋基因排除已知耳聋基因增加克隆新耳聋基因的把握增加克隆新耳聋基因的把握新耳聋基因克隆33XIQIGenome-WideLinkageAnalysisPerformedin9affectedand9unaffected(35yrs)新耳聋基因克隆34XIQI候选区域候选区域新耳聋基因克隆
18、35XIQIGenome-WideLinkageAnalysis9affectedand8unaffectedIlluminaOmniZhongHuaBeadChip(900,015SNPs)Chr16p13kgp1005458-kgp2546988(2.1Mb)MaxiumLOD=3.8OverlappedwithDFNB86interval新耳聋基因克隆36XIQIWholeExomeSequencing3affectedand2unaffected新耳聋基因克隆37XIQIWholeExomeSequencingCandidatevariants:non-synonymousvarian
19、ts(missense,nonsense,splicingsite,indels,etc)withallelefrequencies0.001II-3III-9III-7III-5III-11II-3,III-7,III-9:AffectedIII-5,III-11:Unaffected新耳聋基因克隆38XIQIWholeExomeSequencingConfirmedbySangersequencinginallfamilymembers新耳聋基因克隆39XIQIGenome-WideLinkageAnalysis9affectedand8unaffectedIlluminaOmniZhon
20、gHuaBeadChip(900,015SNPs)Chr16p13kgp1005458-kgp2546988(2.1Mb,124genes)MaxiumLOD=3.8OverlappedwithDFNB86interval新耳聋基因克隆40XIQIThep.Ser178LeuVariantofTBC1D24HighlyconservativeNotseenin1000normalhearingcontrols新耳聋基因克隆41XIQIHum MutatHum Mutat，2014, 35(7):814-818 2014, 35(7):814-818 TBC1D24新耳聋基因克隆42XIQI耳聋
21、基因检测技术：一代测序耳聋基因检测技术：一代测序DNADNADNADNA抽提抽提抽提抽提 PCR PCR PCR PCR扩增扩增扩增扩增 扩增片段测序扩增片段测序扩增片段测序扩增片段测序 突变检测突变检测突变检测突变检测优点：可覆盖目标基因全部编码序列，适合特定目标诊断优点：可覆盖目标基因全部编码序列，适合特定目标诊断优点：可覆盖目标基因全部编码序列，适合特定目标诊断优点：可覆盖目标基因全部编码序列，适合特定目标诊断总结-检测技术43XIQI高通量定点突变检测技术高通量定点突变检测技术p p耳聋基因突变芯片检测法耳聋基因突变芯片检测法耳聋基因突变芯片检测法耳聋基因突变芯片检测法p p飞行时间质
22、谱法飞行时间质谱法飞行时间质谱法飞行时间质谱法p pSNAPshot/HRMSNAPshot/HRMSNAPshot/HRMSNAPshot/HRM等等等等优点：通量高，操作简便，适合大规模人群筛查优点：通量高，操作简便，适合大规模人群筛查优点：通量高，操作简便，适合大规模人群筛查优点：通量高，操作简便，适合大规模人群筛查总结-检测技术44XIQI外显子目标外显子目标 捕获结合二代测序捕获结合二代测序优点：覆盖绝大多数（优点：覆盖绝大多数（优点：覆盖绝大多数（优点：覆盖绝大多数（140140140140个）已知耳聋基因编码序列个）已知耳聋基因编码序列个）已知耳聋基因编码序列个）已知耳聋基因编码序列Orphanet J Rare Dis, Orphanet J Rare Dis, 2013, 8(1):852013, 8(1):85 总结-检测技术45XIQI耳聋基因研究与临床应用耳聋基因研究与临床应用临床应用临床应用基础研究基础研究总结46XIQI谢谢！谢谢！47XIQI
