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1、第三章病毒和亚病毒病毒和亚病毒生物工程系动物病毒的类型细小病毒乳多孔病毒腺病毒虹彩病毒噬肝DNA病毒痘病毒苞疹病毒动物病毒的类型微小RNA病毒呼肠病毒被膜病毒弹状病毒正粘病毒布尼亚病毒冠状病毒沙砾病毒反转录病毒副粘病毒Aids图片感染过程T细胞表面的Aids病毒Aids病毒电镜照片 第一个记载的植物病毒病当属第一个记载的植物病毒病当属郁金香郁金香碎色花病碎色花病，至今荷兰阿姆斯特丹的博物馆，至今荷兰阿姆斯特丹的博物馆还保存着一张还保存着一张1619年荷兰画家的一幅得病的年荷兰画家的一幅得病的郁金香静物画。郁金香静物画。 一枚得病的郁金香球茎竟能一枚得病的郁金香球茎竟能换来换来一头牛一头牛、一头
2、猪或羊一头猪或羊，甚至，甚至成吨的成吨的谷物谷物或上千磅的或上千磅的奶酪奶酪。四、病毒的形态结构和大小四、病毒的形态结构和大小 （一）（一） 病毒的大小病毒的大小 绝大多数的病毒都是能通过细菌过滤器的微小颗绝大多数的病毒都是能通过细菌过滤器的微小颗粒，直径在粒，直径在20200nm的范围内，必须在电镜下观察。的范围内，必须在电镜下观察。最大病毒最大病毒d=450nm的牛痘苗病毒（的牛痘苗病毒（smallpox）；）；最小病毒之一最小病毒之一d=28nm的脊髓灰质炎病毒（的脊髓灰质炎病毒（polio virus）；）；第三章病毒与亚病毒概述病毒的性质病毒的繁殖方式复制特殊形态的病毒亚病毒病毒与实
3、践第一节概述一、病毒的发现和研究历史1886年，A.Mayer发现具有传染性的烟草花叶病；1892年，D.Ivanovsky烟草花叶病病原体能通过细菌滤器：一种能通过细菌滤器的”细菌毒素”或极小的细菌1898年，M W Beijerinck对烟草花叶病病原体进行系统研究：t能通过细菌滤器；t可被乙醇沉淀而不失去其感染性，t能在琼脂凝胶中扩散；t用培养细菌的方法不能被培养出来，推测只能在植物活细胞中生活；比细菌小的具有传染性的活的流质（contagiumvivumfluidum）重型天花一、病毒的发现和研究历史第一节概述1900年前后，包括口蹄疫（footandmouthdisease）在内的多
4、种动植物疾病病原体的滤过性特性被证明。filterableviruses（滤过性病毒）viruses（病毒）TwortFW（1915年）、HerelleFd（1917年），分别发现细菌（Shigella dysenteriae）病毒bacteriophagesPhago：“toeat”噬菌体（phage）1935年，StanleyWM首次提纯并结晶了烟草花叶病毒；Bawden等证明烟草花叶病毒的本质为核蛋白；1940年，Kausche首先用电镜观察到烟草花叶病毒颗粒；一、病毒的发现和研究历史第一节概述极大地丰富了现代生物学（微生物学、分子生物学、分子遗传学）的理论与技术；病毒学（virulog
5、y）：研究病毒（virus）的本质及其与宿主的相互作用的科学，是微生物学的重要分支学科。有效地控制和消灭人及有益生物的病毒病害；利用病毒对有害生物、特别是害虫进行生物防治；发展以基因工程为中心的生物高新技术产业；例如一些简单的病毒仅由核酸和蛋白质外壳（coat）构成，故可把它们视为核蛋白分子。二、病毒的特点和定义第一节概述1.特点1）不具有细胞结构，具有一般化学大分子的特征。2）一种病毒的毒粒内只含有一种核酸，DNA或者RNA。3）大部分病毒没有酶或酶系极不完全，不含催化能量代谢的酶，不能进行独立的代谢作用。4）严格的活细胞内寄生，没有自身的核糖体，没有个体生长，也不进行二均分裂，必须依赖宿主
6、细胞进行自身的核酸复制，形成子代。5）个体微小，在电子显微镜下才能看见。6）对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。朊病毒甚至仅由蛋白质构成第一节概述1.特点二、病毒的特点和定义病毒是一类既具有化学大分子属性，又具有生物体基本特征；既具有细胞外的感染性颗粒形式，又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。超显微的、没有细胞结构的、专性活细胞内寄生的实体第一节概述1.特点二、病毒的特点和定义表7-1单细胞微生物与病毒性质的比较a DNA病毒和RNA病毒中的一部分;b利福平可抑制痘病毒复制第一节概述2.定义二、病毒的特点和定义迄今仍无一个科学而严谨的定义病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的超显
7、微“非细胞生物”，其本质是一类含DNA或RNA的特殊遗传因子。非细胞生物（真）病毒：至少含核酸和蛋白质二种组分亚病毒类病毒：只含具独立侵染性的RNA组分卫星RNA：只含有与侵染无关的RNA组分朊病毒：只含蛋白质拟病毒：只含不具独立侵染性的RNA组分卫星病毒：与真病毒伴生的缺陷病毒三、病毒的宿主范围及其类群第一节概述病毒几乎可以感染所有的细胞生物，并具有宿主特异性细菌噬菌体（phage）植物植物病毒（plantviruses）动物动物病毒（animalviruses）人类和脊椎动物病毒昆虫病毒四、病毒的培养和纯化第一节概述同微生物学其他学科分支一样，病毒学的进步完全得益于研究方法和技术手段的发展
8、。通过病毒的分离与纯化获得纯化的、有感染性的病毒制备物是病毒学研究和实践的基本技术。1、病毒的培养病毒的培养：二元培养物法四、病毒的培养和纯化1、病毒的培养噬菌体细菌培养物培养液营养琼脂平板细菌培养液变清亮细菌平板成为残迹平板若是噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板， 经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局 部透明区域，即噬菌斑（plague）。 如同对细菌计数一样，形成的噬菌斑也可用于对 噬菌体的数目进行估算。四、病毒的培养和纯化1、病毒的培养动物病毒实验动物鸡胚多种细胞培养四、病毒的培养和纯化1、病毒的培养若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可在培养的细胞单层上形成肉眼可见的
9、局部病损区域，即蚀斑（plaque）或称空斑。大多数动物病毒感染敏感细胞培养能引起其显微表现的改变，即产生致细胞病变效应（cytopathiceffect,CPE），例如细胞聚集成团、肿大、圆缩、脱落，细胞融合形成多核细胞，细胞内出现包涵体（inclusionbody），乃至细胞裂解。四、病毒的培养和纯化1、病毒的培养植物病毒敏感植物叶片产生坏死斑，或称枯斑蛋白质提纯方法（盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等）四、病毒的培养和纯化2、病毒纯化标准纯化的病毒制备物应保持其感染性病毒是有感染性的生物体病毒具有化学大分子的属性纯化的病毒制备物的理化性质应具有均一性方法主要化学组成为蛋
10、白质具有一定的大小、形状和密度差速离心梯度离心（超速离心）第二节病毒的性质病毒是一类既具有化学大分子属性，又具有生物体基本特征；既具有细胞外的感染性颗粒形式颗粒形式，又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。病毒粒（Viron）：一团能够自主复制的遗传物质保护遗传物质免遭环境破坏，并作为将遗传物质从一个宿主细胞传递给另一个宿主细胞的载体。蛋白质外壳包膜又称病毒颗粒、毒粒等。专指成熟的、结构完整的、有感染性的单个病毒。是病毒的细胞外颗粒形式，也是病毒的感染性形式。第二节病毒的性质一、病毒的形态结构1.病毒的大小和形状个体小，必需在电镜下观察(20-200nm)；不同病毒的毒粒大小差别很大(17
11、400)；毒粒的形状大致可分球形颗粒(或称拟球形颗粒)、杆状颗粒和复杂形状颗粒（如蝌蚪状，卵形）等少数几类。采用各种电镜技术观察毒粒的形态结构Orf virus：口疮病毒(接触性脓疱皮炎病毒)（负染技术）Ebolavirus：埃博拉病毒（正染技术）Vaccinia virus痘苗病毒（投影技术）各各种种毒毒粒粒的的大大小小、形形态态差差异异很很大大烟草花叶病毒烟草花叶病毒细菌细菌M13噬菌体噬菌体细菌细菌T4噬菌体噬菌体大肠杆菌大肠杆菌细菌细菌f2、MS2噬菌体噬菌体脊髓灰质炎病毒脊髓灰质炎病毒牛痘病毒牛痘病毒腺病毒腺病毒衣原体衣原体人血红细胞人血红细胞第二节病毒的性质一、病毒的形态结构2.病
12、毒的壳体结构壳体或衣壳（capsid）：包围着病毒核酸的蛋白质外壳，由蛋白质亚基蛋白质亚基按对称的形式、有规律地排列而成，是病毒毒粒的基本结构。壳体结构类型螺旋对称壳体二十面体对称壳体双对称（复合对称）结构衣壳粒(Capsome/Capsomer)病毒长什么样子？病毒的基本结构衣壳（蛋白质外壳）核心（核酸）DNA：DNA病毒(如天花病毒、腺病毒等)RNA：RNA病毒(如HIV、脊髓灰质炎病毒等)只含有其中一种核酸核衣壳1. 典型病毒粒的构造典型病毒粒的构造对对称称体体制制螺旋对称螺旋对称二十面体对称二十面体对称复合对称复合对称无包膜无包膜有包膜有包膜杆状：烟草花叶病毒（杆状：烟草花叶病毒（TM
13、V）等等丝状：大肠杆菌的丝状：大肠杆菌的f1、fd、M13等等卷曲状：正粘病毒（流感病毒）等卷曲状：正粘病毒（流感病毒）等弹状：狂犬病毒，水泡性口膜炎病毒等弹状：狂犬病毒，水泡性口膜炎病毒等无包膜无包膜有包膜：有包膜：疱疹病毒疱疹病毒大型：腺病毒等大型：腺病毒等小型：脊髓灰质炎病毒，小型：脊髓灰质炎病毒， X174噬菌体等噬菌体等无包膜：无包膜：大肠杆菌的大肠杆菌的T偶数噬菌体（蝌蚪状）等偶数噬菌体（蝌蚪状）等有包膜：有包膜：痘病毒（砖块状）痘病毒（砖块状）2. 病毒粒的对称体制病毒粒的对称体制螺旋对称壳体：亚基有规律地沿着中心轴（核酸）呈螺旋排列，进而形成高度有序、对称的稳定结构。二十面体对
14、称壳体：蛋白质亚基围绕具立方对称的正正多面体多面体的角或边排列，进而形成一个封闭的蛋白质的鞘。若以一定数目的亚基排列成具有一定表面积的立方对称实体，以二十面体容积为最大，能包装更多的病毒核酸，所以病毒壳体多取二十面体对称（icosahedralsymmetry）结构。五邻体（12个）刺突六邻体（240个）有有12个角、个角、20个面、个面、30条棱。条棱。衣壳由衣壳由252个个衣壳粒衣壳粒组成，包括组成，包括核心核心是由是由36500bp（碱基对）的碱基对）的线状双链线状双链DNA（dsDNA）构成。构成。六邻体（六邻体（hexon）的衣壳粒的衣壳粒240个（均匀个（均匀分布在分布在20个面上
15、）；个面上）；五邻体（五邻体（penton）的衣壳粒的衣壳粒12个（分布个（分布在在12个顶角上）；每个五邻体上突出一个顶角上）；每个五邻体上突出一根末端带有顶球的蛋白纤维，称为根末端带有顶球的蛋白纤维，称为刺突刺突（spike）。具有双对称结构的典型例子是有尾噬菌体（tailedphage）,其壳体由头部和尾部组成。包装有病毒核酸的头部通常呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。双对称结构：第二节病毒的性质一、病毒的形态结构3.病毒的包膜结构病毒的蛋白质壳体和病毒核酸（核心）构成的复合物。核衣壳（nucleocapsid）：仅由核衣壳构成的病毒颗粒裸露毒粒（nakedvirion）：如烟草花叶病毒、
16、脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）等一些简单的病毒的毒粒。包膜（envelope）：（有些）病毒核衣壳外包裹着的一层脂蛋白膜。它是病毒以出芽（budding）方式成熟时，由细胞膜衍生而来的。有维系毒粒结构，保护病毒核壳的作用。特别是病毒的包膜糖蛋白，具有多种生物学活性，是启动病毒感染所必需的。有包膜的病毒一、病毒的形态结构3、病毒的包膜结构一、毒粒的形态结构3、病毒的包膜结构病毒包膜的基本结构与生物膜相似，是脂双层膜。在包膜形成时，细胞膜蛋白被病毒的包膜糖蛋白取代。刺突（spike）：包膜或核衣壳上的突起。第二节病毒的性质一、病毒的形态结构4.毒粒的结构类型四种主要结构类型裸露的二十面体毒
17、粒裸露的螺旋毒粒有包膜的二十面体毒粒有包膜的螺旋毒粒有些病毒，如有尾噬菌体、痘病毒等结构更为复杂，不能包括在这些结构类型之内。不同病毒的毒粒结构复杂程度有很大的区别裸露的二十面体毒粒有包膜的二十面体毒粒裸露的螺旋毒粒有包膜的螺旋毒粒complexvirusesVaccinia virus 痘苗病毒在病毒中体积最大，在光学显微镜下勉强可见。有尾噬菌体第二节毒粒的性质二、病毒的化学组成毒粒（化学组成）核酸蛋白质脂类碳水化合物其它组成基本化学组成病毒颗粒在化学上表现为核蛋白二、毒粒的化学组成1、病毒的核酸t核酸是病毒的遗传物质t一种病毒的毒粒只含有一种核酸DNA或是RNA病毒核酸单链DNA（ssDN
18、A）双链DNA（dsDNA）单链RNA（ssRNA）双链RNA（dsRNA）二、毒粒的化学组成1、病毒的核酸单链病毒核酸可按照它的极性（polarity）或意义（sense）进行分类。有某些病毒的RNA是双意（ambisense），即部分为正极性、部分为负极性。二、毒粒的化学组成1、病毒的核酸不同病毒的核酸均可能具有各自不同的结构特征动物病毒以线状的dsDNA和ssRNA为多，植物病毒以线状ssRNA为主，噬菌体以线状的dsDNA居多。二、毒粒的化学组成病毒蛋白质结构蛋白非结构蛋白病毒基因组编码的，在病毒复制过程中产生并具有一定功能，但并不结合于毒粒中的蛋白质。构成一个形态成熟的有感染性的病毒
19、颗粒所必需的蛋白质壳体蛋白；包膜蛋白；存在于毒粒中的酶；2、病毒的蛋白质二、毒粒的化学组成2、病毒的蛋白质病毒结构蛋白的主要生理功能：1）构成蛋白质外壳，保护病毒核酸免受核酸酶及其它理化因子的破坏；2）决定病毒感染的特异性，与易感细胞表面存在的受体具特异性亲和力，促使病毒粒子的吸附和入侵；3）决定病毒的抗原性，能刺激机体产生相应的抗体；4）构成病毒酶，或参与病毒对宿主细胞的入侵（如T4噬菌体的溶菌酶等），或参与病毒复制过程中所需要病毒大分子的合成（如逆转录酶等）；一般来说，病毒是不具酶或酶系极不完全的，所以一旦离开宿主就不能独立进行代谢和繁殖。二、毒粒的化学组成3、病毒的脂类有包膜病毒：包膜中
20、脂类化合物来自细胞磷脂5060%胆固醇具有宿主细胞特异性注：少数无包膜病毒的毒粒中也发现有脂类的存在具感染性的毒粒消失第三节病毒的复制病毒的特点：严格细胞内寄生物，只能在活细胞内繁殖。毒粒宿主细胞有繁殖性的病毒基因组病毒基因组复制、表达病毒核酸和蛋白质装配形成具有感染性的毒粒释放至细胞外原料；能量；生物合成场所；繁殖过程：繁殖过程：第三节病毒的复制病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，通过其复制与表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质，然后由这些新合成的病毒组分装配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。病毒的这种特殊繁殖方式称做复制(replication)一、病毒的复制周
21、期复制周期（replicativecircle）或称复制循环：自病毒吸附于细胞开始，到子代病毒从感染细胞释放到细胞外的病毒复制过程。吸附；侵入；脱壳；病毒大分子的合成，包括病毒基因组的表达与复制；装配与释放；第三节病毒的复制第三节病毒的复制二、病毒感染的起始1.吸附毒粒敏感细胞随机碰撞而接触（静电引力或氢键）可逆吸附，无特异性（非细胞颗粒也可吸附）病毒表面蛋白与细胞受体的结合特异性，不可逆吸附，启动病毒感染的第一阶段二、病毒感染的起始1.吸附病毒吸附蛋白与细胞受体间的结合力来源于空间结构的互补性，相互间的电荷、氢键、疏水性相互作用及范德华力。不同种系的细胞具有不同病毒的细胞受体，病毒受体的细胞
22、种系特异性决定了病毒的宿主范围。二、病毒感染的起始分别吸附于大肠杆菌性毛和菌体上的噬菌体1.吸附二、病毒感染的起始动物宿主细胞及细菌表面病毒受体的存在可通过生化、遗传等实验证明，但至今仍未发现植物病毒的细胞受体存在。1.吸附吸附作用受许多内外因素的影响吸附作用受许多内外因素的影响噬菌体的数量噬菌体的数量 由于每一宿主细胞表面的特异受体有限，因此由于每一宿主细胞表面的特异受体有限，因此所能吸附噬菌体的数目也有一个限量。所能吸附噬菌体的数目也有一个限量。 每一敏感细胞所能吸附的相应噬菌体的数量，就每一敏感细胞所能吸附的相应噬菌体的数量，就称称感染复数感染复数（m. .o. .i，multiplic
23、ity of infection）。）。辅助因子辅助因子 色氨酸可促进色氨酸可促进T4的尾丝摆脱颈须的束缚，有促的尾丝摆脱颈须的束缚，有促吸附作用；吸附作用； 生物素可促进产谷氨酸细菌噬菌体的吸附作用。生物素可促进产谷氨酸细菌噬菌体的吸附作用。阳离子阳离子 Ca2+2+、Mg2+2+和和Ba2+2+等阳离子对吸附有促进作用；等阳离子对吸附有促进作用； Al3+3+、Fe3+3+和和Cr3+3+等阳离子则可引起失活。等阳离子则可引起失活。温度温度 在生长最适温度范围内最有利于吸附。在生长最适温度范围内最有利于吸附。 利用某些理化因子对吸附的促进作用和抑制作用，利用某些理化因子对吸附的促进作用和抑
24、制作用，在发酵工业中对防止噬菌体的污染有一定的意义在发酵工业中对防止噬菌体的污染有一定的意义。pH值值 在中性时有利于吸附，在中性时有利于吸附， 在在pH5和和pH10时不易吸附。时不易吸附。二、病毒感染的起始定义：又称病毒内化，是一个病毒吸附后几乎立即发生的、依赖于能量的感染步骤。机制：不同的病毒-宿主系统的病毒侵入机制不同2.侵入二、病毒感染的起始有尾噬菌体：注射方式将噬菌体核酸注入细胞通过尾部刺突固着于细胞；吸附尾钉固着尾鞘收缩尾管穿入DNA注入如果大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生许多小孔，也可引起细胞立即裂解，但并未进行噬菌体的增殖，这种现象称为自外裂解（lysis
25、from without）。尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖，使细胞壁产生小孔；尾鞘收缩，核酸通过中空的尾管压入胞内，蛋白质外壳留在胞外；2.侵入二、病毒感染的起始动物病毒：裸露病毒穿过细胞膜的移位方式；毒粒包膜与细胞质膜的融合；2.侵入细胞的内吞功能；二、病毒感染的起始植物病毒：2.侵入通过因人为或自然的机械损伤所形成的微伤口进入细胞；或者靠携带有病毒的媒介，主要靠是有吮吸式口器的昆虫取食将病毒带入细胞。植物病毒一旦进入细胞后，增殖产生的子代病毒或病毒核酸可通过病毒编码的运动蛋白（movement protein）与胞间连丝的相互作用从受染细胞进入邻近细胞。二、病毒感染的起始定义：病毒侵入后，病毒
26、的包膜和/或壳体除去而释放出病毒核酸的过程。T-偶数噬菌体脱壳与侵入是一起发生的动物病毒存在不同的结构类型和不同的侵入方式，其脱壳过程也较复杂。病毒的毒粒消失，失去原有的感染性。脱壳是病毒基因组进行功能表达所必需的感染事件3.脱壳二、病毒感染的起始3.脱壳病毒基因组的表达与复制存在着强烈的时序性病毒基因组进入胞内宿主细胞的代谢发生改变病毒利用宿主的生物合成机构和场所，使病毒核酸表达和复制，产生大量的病毒蛋白质和核酸。4.增殖第三节病毒的复制三、病毒大分子的合成早期（早期（early, immediate early）次早期（次早期（delayed early）晚期（晚期（late）三、病毒大分
27、子的合成病毒生物合成的第一步是病毒mRNA的合成病毒复制所需要的病毒特异性酶蛋白及蛋白质外壳的合成（5种核酸，6条途径）第三节病毒的复制四、病毒的装配与释放又称成熟(maturation)或形态发生(morphogenesis)新合成的毒粒结构组分组装成完整的病毒颗粒的过程5.装配T4噬菌体的装配是一个极为复杂的自我装配的过程四、病毒的装配与释放烟草花叶病毒的装配：RNA穿过螺旋的中心孔并在生长端形成一个可移动的环。成熟的子代病毒颗粒依一定途径释放到细胞外的过程病毒的释放标志病毒复制周期结束6.裂解（释放）大多数噬菌体都是以裂解细胞方式释放四、病毒的装配与释放四、病毒的装配与释放丝（杆）噬菌体
28、（如M13或fd）不杀死细胞，子代毒粒以分泌方式不断从受染细胞中释放，并同时完成毒粒的组装。注意一点：病毒的装配与释放有时是同步进行的四、病毒的装配与释放有包膜病毒的装配与释放有时也是同时完成的四、病毒的装配与释放有包膜的动物病毒是在从宿主细胞核芽出或细胞质膜芽出的过程中裹上包膜而形成包膜病毒吸附侵入早期：病毒特异性酶的合成病毒核酸复制病毒结构蛋白质合成装配释放病毒大分子合成脱壳第三节病毒的复制五、一步生长曲线（onestepgrowthcurve）1939年，MaxDelbruck&EmoryEllis：E. coli/bacteriopage1.用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞；2.数
29、分钟后，加入抗噬菌体的抗血清（中和未吸附的噬菌体）；3.将上述混合物大量稀释，终止抗血清的作用和防止新释放的噬菌体感染其它细胞；4.保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价（对噬菌体含量进行计数）；5.以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线；该实验标志着分子病毒学、分子生物学和分子遗传学的建立MaxDelbruck因此荣获1969年NobelPrize以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附后，离心除去未吸附的病毒，或以抗病毒抗血清处理病毒细胞培养物以建立同步感染，然后继续培养并定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为
30、纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线。效价：每毫升试样中所含有的具有侵染性的噬菌体粒子数，又称噬菌斑形成单位数。成斑率：同一样品根据噬菌斑计算出来的效价与用电镜计算出来的效价之比。五、一步生长曲线The total number of complete virionsThe total number of free virionsPlateau period噬菌体复制（繁殖）的三个阶段：1.潜伏期：从病毒核酸浸入宿主细胞后至第一个成熟病毒粒子形成前的一段时间2.裂解期：宿主细胞迅速裂解，细胞外（溶液中）病毒粒子急剧增多的一段时间3.平稳期：感染后的宿主细胞已全部裂解，溶液中病毒数
31、量达到最高时的一段时间裂解量：每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目。其值等于潜伏期受染细胞的数目除稳定期受染细胞所释放的全部子代病毒数目，即等于稳定期病毒效价与潜伏期病毒效价之比。五、一步生长曲线一步生长曲线是研究病毒复制的一个经典试验，最初是为研究噬菌体的复制而建立，以后推广到动物病毒和植物病毒的复制研究中。不同病毒的潜伏期长短不同，噬菌体以分钟计，动物病毒和植物病毒以小时或天计。潜伏期噬菌体的裂解量一般为几十到上百个，植物病毒和动物病毒可达数百乃至上万个。裂解量Plateau period五、一步生长曲线在潜伏期的前一段，受染细胞内检测不到感染性病毒，后一阶段，感染性病毒在受染细胞内
32、的数量急剧增加。自病毒在受染细胞内消失到细胞内出现新的感染性病毒的时间为隐蔽期。隐蔽期病毒在细胞内存在的动力学曲线呈线性函数，而非指数关系，从而证明子代病毒颗粒是由新合成的病毒基因组与蛋白质经装配成熟。不同病毒的隐蔽期长短不同，例如，DNA动物病毒的隐蔽期为520小时，RNA动物病毒为210小时。第三节病毒的复制六、溶源性烈性噬菌体(Virulentphage)凡在短时间内能连续完成病毒复制的五个阶段而实现其繁殖的噬菌体温和噬菌体(Temperatephage)裂解性周期(Lyticcycle)溶源性周期(Lysogeniccycle)感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并最终杀死细胞，形成裂解循
33、环（lyticcycle）。感染宿主细胞后不能完成复制循环，噬菌体基因组长期存在于宿主细胞内，没有成熟噬菌体产生。六、溶源性温和噬菌体的溶源性反应：温和噬菌体感染宿主细胞后不能完成复制循环，噬菌体基因组长期存在于宿主细胞内，没有成熟噬菌体产生。这一现象称做溶源性（lysogeny）现象在大多数情况下，温和噬菌体的基因组都整合于宿主染色体中（如噬菌体），亦有少数是以质粒形成存在（如P1噬菌体）。第三节病毒的复制温和噬菌体的溶源性反应：整合于细菌染色体或以质粒形式存在的温和噬菌体基因组称做原噬菌体（prophage）在原噬菌体阶段，噬菌体的复制被抑制，宿主细胞正常地生长繁殖，而噬菌体基因组与宿主细
34、菌染色体同步复制，并随细胞分裂而传递给子代细胞。细胞中含有以原噬菌体状态存在的温和噬菌体基因组的细菌称做溶源性细菌（lysogenicbacteria）溶源性细菌经自发裂解或诱发裂解，进入裂解循环六、溶源性噬菌体的的溶源性反应：进入宿主后线状基因组依靠粘性末端环化六、溶源性溶源性感染对细胞的影响：被温和噬菌体感染后形成的溶源性细菌具有“免疫性”，即其它同类噬菌体虽然可以再次感染该细胞，但不能增殖，也不能导致溶源性细菌裂解。免疫性是由原噬菌体产生的阻遏蛋白的可扩散性质所决定的。溶源性细菌有时还能获得一些新的生理特性，例如白喉杆菌只有在含有特定类型的原噬菌体时才能产生白喉毒素，引起被感染机体发病。
35、原噬菌体引起的溶源性细菌除免疫性外的其他的表形改变，包括溶源菌细胞表面性质的改变和致病性转变被称为溶源转变(lysogenicconversion)。溶源菌中的温和噬菌体基因组通常不影响细胞的繁殖功能，但它们可能引起其他的细胞变化。(1)免疫性(2)溶源转变六、溶源性第四节亚病毒定义：凡在核酸和蛋白质两种成分中只含其中之一的分子病原体。种类：类病毒(Viroid)拟病毒(Virusoid)朊病毒(Prion)(Ruan)一、类病毒（一、类病毒（Viroid） 类病毒类病毒（viroid）是一类只含是一类只含RNARNA一种成分、一种成分、专性寄生在活细胞内的分子病原体。专性寄生在活细胞内的分子
36、病原体。目前只在植物体中发现，所含核酸为目前只在植物体中发现，所含核酸为裸露的环状裸露的环状ssRNAssRNA，其二级结构象一段末端封闭的短其二级结构象一段末端封闭的短dsRNAdsRNA分子。分子。 1971 1971年在美国工作的瑞士学者年在美国工作的瑞士学者T. O. Diener在在马铃薯马铃薯纺锤形块茎病（纺锤形块茎病（potatospindletuberdisease，PSTD）中发中发现一条比一般病毒分子更小的现一条比一般病毒分子更小的1010S S的区带，他称它为的区带，他称它为马铃薯纺锤形块茎病类病毒马铃薯纺锤形块茎病类病毒（potatospindletuberviroid
37、，PSTV），），它可使马铃薯减它可使马铃薯减产产20207070。类病毒的发现，是生命科学中的一个重大事件类病毒的发现，是生命科学中的一个重大事件。对生物学家来说，类病毒的发现为他们探索生命起源提对生物学家来说，类病毒的发现为他们探索生命起源提供了一个新的低层次上的好对象；供了一个新的低层次上的好对象；对分子生物学家来说，类病毒是研究最重要生物大分子对分子生物学家来说，类病毒是研究最重要生物大分子的结构与功能的绝好材料；的结构与功能的绝好材料；对病理学家来说，类病毒的发现，为他们揭开人类对病理学家来说，类病毒的发现，为他们揭开人类和动、植物的各种传染性疑难杂症的病因带来了新和动、植物的各种传
38、染性疑难杂症的病因带来了新的希望；的希望；对哲学家来说，类病毒的发现，为他们长期以来有对哲学家来说，类病毒的发现，为他们长期以来有关生命本质的认识将带来革命性的影响。关生命本质的认识将带来革命性的影响。 拟病毒拟病毒（virusoids）又称又称类类病毒（类类病毒（viroid-like）、壳内类病毒壳内类病毒或或病毒卫星（病毒卫星（satellite），是指一类包裹在真是指一类包裹在真病毒粒中的有缺陷的类病毒。病毒粒中的有缺陷的类病毒。拟病毒极其微小，一般仅由拟病毒极其微小，一般仅由裸露的裸露的RNARNA（300300400400个核苷酸）或个核苷酸）或DNADNA所组成。所组成。二、拟病
39、毒（二、拟病毒（Virusoid） 被拟病毒被拟病毒“寄生寄生”的真病毒又称的真病毒又称辅助病毒辅助病毒（helper virus），拟病毒则成了它的拟病毒则成了它的“卫星卫星”。 拟病毒的复制必须依赖辅助病毒的协助，同时，拟病毒的复制必须依赖辅助病毒的协助，同时，拟病毒也可干扰辅助病毒的复制和减轻其对宿主的病拟病毒也可干扰辅助病毒的复制和减轻其对宿主的病害，这可用于害，这可用于生物防治生物防治中。中。 拟病毒首次于拟病毒首次于19811981年在年在绒毛烟（绒毛烟（Nicotiana velutina）的斑驳病毒（的斑驳病毒（velvet tobacco mottle virus，VTMoV
40、VTMoV）中分离到。中分离到。 VTMoVVTMoV是一种二十面体病毒，其核心中含有是一种二十面体病毒，其核心中含有大分子大分子线状线状ssRNAssRNA（RNA-1RNA-1）、环状环状ssRNAssRNA（RNA-2RNA-2）和和线状线状ssRNAssRNA（RNA-3RNA-3）, ,后两者为拟病毒。实验证明，只有当后两者为拟病毒。实验证明，只有当RNA-1RNA-1（辅助病毒）与辅助病毒）与RNA-2RNA-2或或RNA-3RNA-3（拟病毒）合在一拟病毒）合在一起时才能感染宿主。起时才能感染宿主。植物病毒中的拟病毒植物病毒中的拟病毒EgEg. .苜蓿暂时性条斑病毒（苜蓿暂时性条
41、斑病毒（LTSVLTSV）、）、 莨菪斑驳病毒（莨菪斑驳病毒（SNMVSNMV）、 地下三叶草斑驳病毒（地下三叶草斑驳病毒（SCMoVSCMoV）。）。动物病毒中的拟病毒动物病毒中的拟病毒EgEg. .丁型肝炎病毒（丁型肝炎病毒（hepatitis D virus）, , 它的宿主是乙型肝炎病毒（它的宿主是乙型肝炎病毒（HBVHBV）有助于探索核酸的结构与功能。有助于探索核酸的结构与功能。 拟病毒是一种低分子量的侵染性核酸分子，因而拟病毒是一种低分子量的侵染性核酸分子，因而易于进行细致的化学组分和结构分析；通过拟病毒与易于进行细致的化学组分和结构分析；通过拟病毒与类病毒的结构与功能的比较，对核
42、酸的结构与功能可类病毒的结构与功能的比较，对核酸的结构与功能可能会得到更深入的了解。能会得到更深入的了解。有助于探索拟病毒与辅助病毒（有助于探索拟病毒与辅助病毒（RNA-1RNA-1）间的间的相互关系。相互关系。 拟病毒必须依靠辅助病毒的存在才能复制，而辅拟病毒必须依靠辅助病毒的存在才能复制，而辅助病毒的复制却不需要拟病毒的存在。拟病毒的存在助病毒的复制却不需要拟病毒的存在。拟病毒的存在可以影响辅助病毒的产量和改变辅助病毒在宿主上的可以影响辅助病毒的产量和改变辅助病毒在宿主上的症状及反应的程度。症状及反应的程度。利用拟病毒这类低分子利用拟病毒这类低分子RNARNA来组建新的弱毒疫苗。来组建新的
43、弱毒疫苗。 拟病毒又可称类类病毒，它与普通类病毒的差异拟病毒又可称类类病毒，它与普通类病毒的差异在于它的侵染对象不是高等植物或动物，而是小小的在于它的侵染对象不是高等植物或动物，而是小小的植物病毒。根据拟病毒的存在可影响辅助病毒的产量植物病毒。根据拟病毒的存在可影响辅助病毒的产量和改变辅助病毒在宿主上的症状和反应程度的原理，和改变辅助病毒在宿主上的症状和反应程度的原理，有可能用它来人工组建具有防病功能的弱化疫苗。有可能用它来人工组建具有防病功能的弱化疫苗。对拟病毒的深入研究，也有助于进一步探索病对拟病毒的深入研究，也有助于进一步探索病毒的本质和生命起源等重大生物学理论问题。毒的本质和生命起源等
44、重大生物学理论问题。拟病毒的研究的意义拟病毒的研究的意义三、朊病毒（三、朊病毒（Prion） 朊病毒朊病毒（prion，virino）又称又称“普列昂普列昂”或或蛋白质侵染因子（蛋白质侵染因子（prion，是是protein infection的缩写）的缩写），是一类不含核酸的传染性蛋白质分子，因能引起宿主是一类不含核酸的传染性蛋白质分子，因能引起宿主体内现成同类蛋白质分子发生与其相似构象变化，从体内现成同类蛋白质分子发生与其相似构象变化，从而可使宿主致病。而可使宿主致病。link1人的库鲁病(kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt Jakob disease, CJD)等羊搔痒症(sc
45、rapie)牛海绵状脑病(spongiformencephalopathy)名称名称病原体病原体症状症状羊骚痒症羊骚痒症（scrapie in sheep）羊骚痒病朊病毒羊骚痒病朊病毒蛋白蛋白“PrPSc”牛海绵状脑病牛海绵状脑病（bovine spongiform encephalitis，BSE）；）；俗称俗称“疯牛病疯牛病”（mad cow disease）“PrPBSE”人的克雅氏病人的克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)一种早老性痴一种早老性痴呆症呆症人的库鲁病（人的库鲁病（Kuru）一种震颤病一种震颤病G-S综合症综合症 朊病毒是一类小型蛋白质颗粒
46、，约由朊病毒是一类小型蛋白质颗粒，约由250250个氨基酸个氨基酸组成，大小仅为最小病毒的组成，大小仅为最小病毒的1 1，而且毒性很强。，而且毒性很强。朊病毒与真病毒的主要区别朊病毒与真病毒的主要区别呈淀粉样颗粒状呈淀粉样颗粒状 无免疫原性无免疫原性无核酸成分无核酸成分由宿主细胞内的基因编码由宿主细胞内的基因编码 抗逆性强，能耐杀菌剂（甲醛）抗逆性强，能耐杀菌剂（甲醛）和高温（经和高温（经120120130130处理处理4 4h h后仍具感染性）后仍具感染性） 朊病毒的发病机制朊病毒的发病机制正常的蛋白质：PrP c异常的蛋白质：PrP sc 存在于宿主细胞内的一些正常形式的细胞朊蛋白存在于宿
47、主细胞内的一些正常形式的细胞朊蛋白（PrPc）受到致病朊蛋白（受到致病朊蛋白（PrPsc）的影响而发生相应）的影响而发生相应的构象变化，发生了错误的折叠后变成了的构象变化，发生了错误的折叠后变成了PrPsc，从而从而使宿主致病。使宿主致病。 PrPc和和PrPsc均来源于宿主中均来源于宿主中同一编码基因同一编码基因，并具有相同的氨基酸序列，所并具有相同的氨基酸序列，所不同的不同的是二者是二者空间三维结构空间三维结构。对 PrP c 和PrP sc 两种蛋白质做结构分析。都是由相同的208 个氨基酸残基组成的疏水性很强糖蛋白。PrP sc 的入侵，把脑细胞中原来就有的 PrP c “带坏”正常：
48、PrP c异常： PrP sc PrP c 和 PrP sc 在高级结构上有巨大差别脑组织样品中的淀粉样蛋白斑免疫荧光技术观察到的病原粒子第五节病毒与实践病毒与实践的关系极其密切。病毒与实践的关系极其密切。 由病毒引起的宿主病害既可使人类健康、畜牧业、由病毒引起的宿主病害既可使人类健康、畜牧业、栽培业和发酵工业等带来不利的影响，又可利用它们进栽培业和发酵工业等带来不利的影响，又可利用它们进行生物防治；行生物防治； 利用病毒进行疫苗生产和作遗传工程中的外源基因利用病毒进行疫苗生产和作遗传工程中的外源基因载体，直接或间接地为人类创造出巨大的经济效益、社载体，直接或间接地为人类创造出巨大的经济效益、
49、社会效益和生态效益。会效益和生态效益。一、噬菌体与发酵工业一、噬菌体与发酵工业 噬菌体由于其独特的生物学特性，在人类的生噬菌体由于其独特的生物学特性，在人类的生产实践和理论研究中都很有价值。产实践和理论研究中都很有价值。1.1.用于鉴定未知细菌用于鉴定未知细菌 噬菌体对宿主具有高度专一性，可用于细菌菌噬菌体对宿主具有高度专一性，可用于细菌菌种的分类鉴定，可用于临床诊断和流行病学调查。种的分类鉴定，可用于临床诊断和流行病学调查。2.2.用于临床治疗用于临床治疗噬菌体制剂噬菌体制剂3.3.植物病原菌植物病原菌 噬菌体噬菌体植物病原菌植物病原菌 昆虫病毒昆虫病毒害虫害虫4.4.生物防治生物防治5.5
50、.测定辐射剂量测定辐射剂量 某些噬菌体（某些噬菌体（T2T2）对辐射反应敏感而精确，可通对辐射反应敏感而精确，可通过测定辐射的生物效应而计算出辐射剂量。过测定辐射的生物效应而计算出辐射剂量。6.6.理论研究中的理想材料理论研究中的理想材料 遗传学研究中很多基本理论问题的研究都是用噬遗传学研究中很多基本理论问题的研究都是用噬菌体做工具或材料；基因工程中作载体。菌体做工具或材料；基因工程中作载体。当发酵液受噬菌体严重污染时，会出现：当发酵液受噬菌体严重污染时，会出现：发酵周期明显延长；发酵周期明显延长；碳源消耗缓慢；碳源消耗缓慢；发酵液变清，镜检时，有大量异常菌体出现；发酵液变清，镜检时，有大量异
51、常菌体出现；发酵产物的形成缓慢或根本不形成；发酵产物的形成缓慢或根本不形成；用敏感菌作平板检查时，出现大量噬菌斑；用敏感菌作平板检查时，出现大量噬菌斑；用电子显微镜观察时，可见到有无数噬菌体粒子存在。用电子显微镜观察时，可见到有无数噬菌体粒子存在。7.7.噬菌体对发酵工业的危害很大噬菌体对发酵工业的危害很大轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量，轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量，重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产要防治噬菌体的危害，必须确立要防治噬菌体的危害，必须确立“防重于治防重于治”的观念。的观念。预防噬菌体污染的措施主要有：预防噬菌体污染的措施主要有：（1
52、 1）决不使用可疑菌种）决不使用可疑菌种（2 2）严格保持环境卫生）严格保持环境卫生（3 3）决不丢弃和排放有生产菌种的菌液）决不丢弃和排放有生产菌种的菌液（4 4）注意通气质量）注意通气质量（5 5）加强发酵罐和管道灭菌）加强发酵罐和管道灭菌（6 6）不断筛选抗噬菌体菌种，并经常轮换生产菌种）不断筛选抗噬菌体菌种，并经常轮换生产菌种（7 7）严格执行会客制度）严格执行会客制度发现噬菌体污染时，要及时采取合理措施发现噬菌体污染时，要及时采取合理措施尽快提取产品尽快提取产品使用药物抑制使用药物抑制 某些金属螯合剂（如草酸盐、柠檬酸铵）可抑制噬某些金属螯合剂（如草酸盐、柠檬酸铵）可抑制噬菌体的吸附
53、和侵入；金霉素、四环素或氯霉素等抗生素菌体的吸附和侵入；金霉素、四环素或氯霉素等抗生素或或 “ “吐温吐温60”60”、“吐温吐温20”20”或聚氧乙烯烷基醚等表面活或聚氧乙烯烷基醚等表面活性剂均可抑制噬菌体的增殖或吸附；性剂均可抑制噬菌体的增殖或吸附；及时改用抗噬菌体生产菌株及时改用抗噬菌体生产菌株二、昆虫病毒用于生物防治二、昆虫病毒用于生物防治 长期来，人类在与有害昆虫作斗争的过程中，曾长期来，人类在与有害昆虫作斗争的过程中，曾采用过多种手段，诸如物理治虫、化学治虫、绝育除采用过多种手段，诸如物理治虫、化学治虫、绝育除虫、性激素引诱治虫和生物治虫（包括动物治虫、以虫、性激素引诱治虫和生物治
54、虫（包括动物治虫、以虫治虫、细菌治虫、真菌治虫和病毒治虫）等，其中虫治虫、细菌治虫、真菌治虫和病毒治虫）等，其中病毒治虫由于具有致病力强、专一性强、抗逆性强和病毒治虫由于具有致病力强、专一性强、抗逆性强和生产简便等优点，故发展极快，前景诱人。生产简便等优点，故发展极快，前景诱人。主要优点主要优点（1 1）致病力强，使用量少）致病力强，使用量少 （2 2）专一性强，安全可靠）专一性强，安全可靠 （3 3）抗逆性强，作用久长）抗逆性强，作用久长 （4 4）生产简便，成本低廉）生产简便，成本低廉 缺点缺点杀虫速度慢、不宜大规模生产、在野外易失活杀虫速度慢、不宜大规模生产、在野外易失活和杀虫范围窄等。
55、和杀虫范围窄等。 1986年，年，Powell Abel等报道，通过转等报道，通过转TBSV基基因植物基因工程技术将因植物基因工程技术将烟草花叶病毒（烟草花叶病毒（TMVTMV）外外壳蛋白基因（壳蛋白基因（Coat ProteinCoat Protein，CPCP）转化烟草，转化烟草，获得高表达外壳蛋白的转基因烟草植株。这些转基获得高表达外壳蛋白的转基因烟草植株。这些转基因烟草表现出对因烟草表现出对TMV侵染的抗性。侵染的抗性。转基因烟草对黄瓜花叶病毒转基因烟草对黄瓜花叶病毒（CMV）的抗性的抗性左：对照；右：转基因烟草左：对照；右：转基因烟草 这一工作首次证明，表达病毒外壳蛋白的转基因植这一
56、工作首次证明，表达病毒外壳蛋白的转基因植物可获得基因工程保护作用，由此确立了抗病毒植物基物可获得基因工程保护作用，由此确立了抗病毒植物基因工程这一新领域。自此以后，人们不断分离来源于病因工程这一新领域。自此以后，人们不断分离来源于病毒等的基因，设计并试验了许多不同的策略以研究通过毒等的基因，设计并试验了许多不同的策略以研究通过植物基因工程技术获得抗病毒工程植物，为植物病毒病植物基因工程技术获得抗病毒工程植物，为植物病毒病的防治开辟了一条崭新的途径。的防治开辟了一条崭新的途径。抗病毒抗病毒转转CMV CP基因辣椒基因辣椒田间试验结果田间试验结果上：转基因辣椒上：转基因辣椒下：对照下：对照2.2.
57、肿瘤肿瘤 在人类的在人类的恶性肿瘤恶性肿瘤中，约有中，约有1520% %是是由于病毒的感染而诱发的。由于病毒的感染而诱发的。 1933年理查德年理查德毕肖普（毕肖普（Richard Bishope）发现发现了第一个了第一个DNA肿瘤病毒即肿瘤病毒即兔乳头瘤病毒兔乳头瘤病毒。 研究表明，至少有研究表明，至少有3种病毒与人类肿瘤的密切种病毒与人类肿瘤的密切关系。关系。肝炎病毒肝炎病毒（HBV、HCV）与与肝细胞癌肝细胞癌；爱泼斯坦巴尔病毒爱泼斯坦巴尔病毒（EBV）与与伯基特伯基特（Burkitt）淋巴瘤淋巴瘤、鼻咽癌鼻咽癌；人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒（HPV）与与宫颈癌宫颈癌。 1980年曾发现年曾发现人类嗜人类嗜T细胞病毒细胞病毒（HTLV）与人类某些与人类某些淋巴细胞性白血病淋巴细胞性白血病的关系，的关系，使人类肿瘤病毒病因学获得巨大突破。使人类肿瘤病毒病因学获得巨大突破。白血病患者血液中的癌细胞（三个颜色深的）白血病患者血液中的癌细胞（三个颜色深的）
