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1、方盼赵梅（一）两水相的形成（二）相图（三）分配理论（四）影响分配的参数（五）应用目录目录常用的溶液萃取法能用来提取生物大分子如蛋白质吗？QuestionReasonso大部分萃取采用一个是水相，另一个是有机相蛋白质遇到有机溶剂，易变形失活有些蛋白质有极强地亲水性，不能溶于有机溶剂。通常的溶剂萃取法应用于提取生物大分子是有困难的；但双水相萃取法含水量高，接近生理的环境中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性双水相体系简介1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂和可溶性淀粉的水溶液混合时先得到一个混不透明的溶液，随之分为两相，上相富含明胶，下相富含琼脂（或淀粉），这种现象被称之为聚合物
2、的不相溶性，从而产生了双水相体系。双水相系统双水相系统是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相或多水相系统 葡葡聚聚糖糖（DextranDextran）与与聚聚乙乙二二醇醇（PEGPEG）按按一一定定比比例例与与水水混混合合，溶溶液液混混浊浊，静静置置平平衡衡后后，分分成成互互不不相相溶溶的的两两相相，上上相相富富含含PEGPEG、下相富含葡聚糖，见下图下相富含葡聚糖，见下图（一）两水相的形成（一）两水相的形成两种亲水性聚合物混合1 混合熵的增加 自发进行分子的数目2 分子间作用力 分子间各基团相互作用之和分子的大小对大分子而言，由于相对分子质量
3、较大，分子间作用力与熵增加相比分子间作用力与熵增加相比占主导地位。原理作用力为斥力：作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分形成两个水相，两种高聚物分别富集于上、下两相。别富集于上、下两相。作用力为引力：作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚也形成两个水相，但两种高聚物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形形成均相的高聚物水溶液成均相的高聚物水溶液聚合物的不相容性聚合物的不相容性：两种聚合物分子间存在斥力，在达到平衡后，分成两相，两种聚合物分别进入到一相中。高聚物与高聚物形成两相是由于高
4、聚物的不相容性高聚物与无机盐溶液也能形成两相，这是由于盐析作用。生化工程中，多应用聚乙二醇-葡聚糖和聚乙二醇-无机盐系统。双水相系统双水相系统PEG = 聚已二醇 Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖 双水相萃取双水相萃取: :n利用生物大分子在两种水相之间的分配比利用生物大分子在两种水相之间的分配比例不同而达到分离纯化生物大分子的目的例不同而达到分离纯化生物大分子的目的。（二）相图（二）相图u两种高聚物的水溶液，当它们以不同的比例两种高聚物的水溶液，当它们以不同的比例混合时，可形成均相或两相，这种水性两相混合时，可形成均相或两相，这种水性两相的形成条件和定量关系，常用相图来表示，的形成条件和
5、定量关系，常用相图来表示，它是一条它是一条双节线双节线。只有当P和Q达到一定浓度才能形成两相双节线系线（具体的证明过程省略）系线的长度是衡量两相间差别的尺度，系线越长两相间的差别越大，反之越小。当系线向下移动时，长度逐渐减小，这说明两相的差别减小，当达到K点时，系线的长度为0，两相间差别消失，点s成为临界点。 （三）分配理论（三）分配理论和溶剂萃取法一样，蛋白质在两水相间的分配，有分配系数n K=C1/C2nC1代表上相浓度，C2代表下相浓度。当相系统固定时，分配系数为一常数只取决于被分离物质本身的性质和特定的双水相体系，与蛋白质的浓度无关。n当物质进入双水体系后，由于表面性质/电荷作用和各种
6、力（如憎水键/氢键和离子键）的存在和环境的影响，物质在上相和下相间进行选择性分配，（四）影响物质分配平衡的因素（四）影响物质分配平衡的因素n主要有聚合物的分子量和浓度/pH/演的种类和浓度/温度等。适当的选择各参数即在最适条件下，可达到较高的分配系数和选择性n当聚合物相对分子质量降低时，蛋白质易分配于富含该聚合物的相中。n例如：PEG/DXPEG/DX系统中当系统中当PEGPEG的分子量降低时，会的分子量降低时，会使蛋白质易分配于富含该使蛋白质易分配于富含该PEGPEG的相中，使分配系数的相中，使分配系数增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降低，这
7、是一条普遍规律低，这是一条普遍规律u这是因为成相聚合物的疏水性对酶等亲水性物质的分配产生较大的影响。u同一聚合物的疏水性随分子量的增大而增大，当PEG的分子量增加是，在质量浓度不变的情况下，其两端羟基数减少，疏水性增加，亲水性的蛋白质不再向富含PEG相中聚集，而转向另一相。u那么，分子量降低时，蛋白质就易分配于富含PEG的相了n当接近临界点时，上相和下相的组成相同上相和下相的组成相同蛋白质均匀的分配于两相中，分配系数接近于1。n当成相系统的总浓度增大时，系统远离临界点，系线长度增加，两相性质的差别增大，蛋白质分子的分配系数（分配系数为一常数只取决于被分离物质本身的性质和特定的双水相体系，与蛋白
8、质的浓度无关。）就会偏离临界点的值（=1），即大于1或小于1。n在双水相聚合物系统中，加入电解质，首先阴阳离子会有不同的分配。 n盐的正负离子在两相间的分配系数不同，由于各相应保持电中性，因而在两相中形成电位差，这对带电生物大分子的分配，产生很大的影响。K-1 分配在上相分配在上相K+1 分配在下相分配在下相在pH6.9时溶菌酶带正电，卵蛋白带负电。当加入NaCl时，其浓度低于50mmol/L时可见上相电位低于下相电位，使溶菌酶分配在上相，从而分配系数增大。 而卵蛋白的分配系数减小，。结论：加入适当的结论：加入适当的盐类，会大大促进盐类，会大大促进带相反电荷的生物带相反电荷的生物大分子的分离。
9、大分子的分离。pH值对分配的影响源于两个方面的原因：（一）pH值会影响蛋白质中可以解离基团的解离度，因而改变蛋白质所带的电荷和分配系数。（二）pH值会影响磷酸盐的解离程度，改变H2PO4-和HPO42-之间的比例，而影响分配系数。npH的微小变化会使蛋白质的分配系数改变23个数量级。n温度影响相图，特别在临界点附近，因而也影响分配系数，n温度越高发生相分离所需的高聚物浓度越高 工业方面工业方面 小分子分离和纯化小分子分离和纯化 技术的新发展技术的新发展双水相萃取系统的优点双水相萃取系统的优点直直接接从从cell碎碎片片匀匀浆浆中中萃萃取取prot、而而无无需需将将细细胞胞碎片分离碎片分离双水双
10、水相相系统平衡时间短，含水量高，界面张力低，系统平衡时间短，含水量高，界面张力低，成相聚合物对蛋白质有稳定作用，为生物活性物成相聚合物对蛋白质有稳定作用，为生物活性物质提供了温和的分离环境质提供了温和的分离环境操操作作简简便便，经经济济省省时时，易易于于放放大大.由由于于很很容容易易达达到到平平衡衡，用用商商业业上上的的离离心心机机能能使使相相分分离离完完全全，分分配配系数的值重演性很好，故可直接放大系数的值重演性很好，故可直接放大改变体系的改变体系的pH和电解质浓度可进行反萃取和电解质浓度可进行反萃取应用范围应用范围：胞内酶的提取（双水相系统可用于除去细胞破碎后的匀浆液中的碎片以及酶的进一步
11、精制）运用双水相法萃取需满足的条件运用双水相法萃取需满足的条件：1.欲提取的酶与细胞分配在不同的相中；2.酶的分配系数足够大，使在一定的相体积比时，经过一次萃取就能得到较高的收率；3.两相用离心机很易分离。通常将蛋白质分配在上相，而细胞碎片分配在下相（盐）合理调整双水相组成，从实用角度看，碎片分合理调整双水相组成，从实用角度看，碎片分配在下相的好处多配在下相的好处多Y= 100% 目标蛋白质在上相的收率（目标蛋白质在上相的收率（Y Y）为：）为： 实际上实际上最困难的是最困难的是如何在保证碎片分配如何在保证碎片分配在下相的同时，把蛋白质产物尽可能完在下相的同时，把蛋白质产物尽可能完全地分配在上
12、相。全地分配在上相。 实实验验证证明明，在在大大多多数数场场合合下下，收收率率Y Y都都能能达达到到90%90%；分分配配系系数数在在2 22020之之间间，多多数数场场合合大大于于3 3；很很多多杂杂蛋蛋白白也也能同时除去。能同时除去。单位质量相系统中匀浆液的加入量：经济上考虑希望越多越好，但若匀浆液太多会影响原来成相聚合物的相系统，改变相比或者使分配系数降低。根据Kula的经验，一般取一千克萃取系统处理200到400克湿菌体为宜。PEG系统中细胞碎片分配到下相中较容易分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐（有时也可加入适量的PEG），尽兴第二次双水相萃取，以除去多糖和核酸，它们的亲水相较强
13、因而容易分配在盐相中，而蛋白质就留在了PEG相中；在第三步萃取中，应该使蛋白质分配在盐相中（例如：调节pH），以使和主体PEG分离。色素由于其疏水性，通常分配在上相。主体PEG可循环使用，而盐相蛋白质则可用超滤方法去除残余的PEG以提高产品的纯度。三步两水相萃取酶的流程：三步两水相萃取酶的流程： 细胞匀浆液细胞匀浆液第一步双水相萃取第一步双水相萃取+PEG +盐（或是葡聚糖）盐（或是葡聚糖） 分离机分离机下相下相 上上 相（相（PEG相）相）细胞碎片细胞碎片 （目标产物）如（目标产物）如prot、E杂蛋白杂蛋白 +盐盐 （核酸、多糖）（核酸、多糖）第二步双水相萃取第二步双水相萃取 下下 相（盐
14、相）相（盐相） 上上 相（相（PEG相）相）核酸多糖核酸多糖 目标产物目标产物静置分层静置分层杂蛋白杂蛋白 +盐盐（亲水性较强）（亲水性较强）第三步双水相萃取第三步双水相萃取静置分层静置分层下下 相（盐相）相（盐相） 上上 相相（目标产物）（目标产物） （PEG、杂蛋白、色素）、杂蛋白、色素）UF （PEG可循环使用）可循环使用）提纯产品提纯产品 多步萃取的目的是为了获得较高的纯化倍数。多步萃取的目的是为了获得较高的纯化倍数。1990年科研人员发现在PEG/磷酸盐系统中，某些氨基酸和青霉素的分配是不均匀的，例如：赖氨酸的分配系数为0.23，而类黑素的分配系数为7.1，从而可将二者分离。引起人们
15、利用双水相分配分离纯化小分子的兴趣，特别应用于从一些粘度大、难过率、易乳化的发酵液中提取。分离纯化小分子同样的也利用的是PEG/盐系统双水相萃取技术的进展双水相萃取技术的进展廉价双水相体系的开发：两种双水相体系的比较两种双水相体系的比较体体 系系优 点点缺缺 点点高聚物高聚物/高聚物高聚物盐浓度度低低，活活性性损失失小小，可可用用离离子子交交换层析纯化换层析纯化成本高成本高，粘度大，分相困，粘度大，分相困难高聚物高聚物/盐成本低，粘度小成本低，粘度小，比比较较适适合合工工业业规规模模的应用的应用盐浓度度高高，非非盐盐水水的的处处理理比比较较困困难难，活活性性损失失大大,界界面面吸吸附多附多双水
16、相萃取技术同其他分离技术相结合双水相萃取技术同其他分离技术相结合A A、双水相体系同生物转化相结合：双水相体系同生物转化相结合：B B、双水相萃取同膜分离技术相结合：双水相萃取同膜分离技术相结合：C C、双双水水相相萃萃取取同同亲亲和和层层析析相相结结合合亲亲和和萃取（亲和分配）：萃取（亲和分配）：蛋白质在两水相系统中的分配系数一般不是很大，为了提高分配系数和萃取效率，可将亲和层析与两水相萃取结合起来，成为亲和萃取或亲和分配，即把一种配基与一种成相聚合物以共价相结合，使该配基随成相聚合物分配在某一相中。配基可也是酶的底物，抑制剂，抗体，受体或染料等，对目标蛋白质有很强的生物亲和力，因而使后者倾
17、向于分配在配基聚合物的相中。通常选择在PEG上接上配基，当配基PEG的浓度增加时，蛋白质的分配系数也增加。当蛋白质的结合位点都为配基所占据时，即达到饱和，蛋白质的分配系数达到极大值。原理：在双水相系统中进行转化反应，如酶促反应，可以把产物一如另一相中，消除产物抑制，因而可提高效率。实际上是一种反应和分离耦联的过程，亦称为萃取生物转化。如果发生的是一种发酵过程，也可成为萃取发酵。反应应满足的条件：1.催化剂（酶、细胞等）应单侧分配；2.底物应分配于催化物所处的相中；产物应分配在另一相中；4.要有合适的相比，如产物分配在上相中，则相比要大，反之则相比要小。优点：1.与固定床反应器相比，不需载体，不存在多孔载体中的扩散阻力，故反应速度快，生产能力较高；2.生物催化剂在两水相系统中教稳定；3.两相间表面张力低，轻微搅拌即能形成高度分散的系统，分散相液滴在10m一下，有很大的表面积，有利于底物和产物的传递。
