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1、 基因的克隆与表达 张静静 2011-09-24业务员 QQ 807475538 公司网址：基因克隆基因克隆(genecloning)RACE技术服务技术服务基因表达基因表达(geneexpression) -原核基因表达原核基因表达 -真核基因表达真核基因表达业务员 QQ 807475538 公司网址：基 因 克 隆 Gene Cloning业务员 QQ 807475538 公司网址：概述概述克隆载体克隆载体受体细胞受体细胞体外重组的策略体外重组的策略基因克隆工作流程基因克隆工作流程业务员 QQ 807475538 公司网址：一、概述确定了遗传信息的携带者确定了遗传信息的携带者揭示了揭示了D
2、NA分子的双螺旋结构模型和半分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理保留复制机理提出了中心法则和操纵子学说，破译了提出了中心法则和操纵子学说，破译了遗传密码遗传密码概述概述业务员 QQ 807475538 公司网址：1973年年Cohen完成第一个基因工程实验完成第一个基因工程实验经经体外重组体外重组获得杂合获得杂合DNA杂合子转化入大肠杆菌杂合子转化入大肠杆菌所需元件：所需元件：限制性内切酶限制性内切酶连接酶连接酶载体载体受体细胞受体细胞业务员 QQ 807475538 公司网址：-通过体外重组技术通过体外重组技术,将一段目的将一段目的DNA经经切割、连接插入适当载体，并导入受体细切割、连接插入
3、适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。胞，扩增形成大量子代分子的过程。基因克隆（分子克隆基因克隆（分子克隆molecularcloning）业务员 QQ 807475538 公司网址：基因克隆的核心基因克隆的核心-体外重组体外重组(Recombination):人工将一段目的人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。插入一个载体的过程。业务员 QQ 807475538 公司网址：基因克隆的技术路线基因克隆的技术路线目的基因目的基因载体载体体外重组体外重组重组子（杂合重组子（杂合DNA）转化转化受体细胞受体细胞筛选阳性克隆筛选阳性克隆大量扩增，获得子代大量扩增，获得子代DNA业务员
4、 QQ 807475538 公司网址：业务员 QQ 807475538 公司网址：二、克隆载体二、克隆载体复制基因复制基因(replicator)选择性记号选择性记号克隆位点克隆位点业务员 QQ 807475538 公司网址：三、受体细胞三、受体细胞1 1、定义：外源、定义：外源DNADNA导入的细胞，是重导入的细胞，是重组体扩增的场所。组体扩增的场所。2 2、要求：易于接纳外源、要求：易于接纳外源DNADNA 无特异的内源性核酸内切酶无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性与载体有互补性业务员 QQ 807475538 公司网址：四、体外重组的策略四
5、、体外重组的策略粘粘-粘粘连连接接：最最有有效效、最最快快捷捷业务员 QQ 807475538 公司网址：4 4、T-AT-A克隆克隆T-vectorT-vector两条链的两条链的55端含有一个游离的端含有一个游离的T TPCRPCR过程中，普通的过程中，普通的TaqTaq酶可在产物的酶可在产物的33端多端多加一个加一个A A业务员 QQ 807475538 公司网址：五、基因克隆的工作流程五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的获得（一）目的基因的获得（二）体外重组（二）体外重组（三）转化（三）转化Cacl2法、电击法法、电击法（四）重组子的筛选及鉴定（四）重组子的筛选及鉴定1、筛选：平板法
6、（抗生素、蓝白斑）、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）2、鉴定：长度鉴定：酶切、鉴定：长度鉴定：酶切、PCR（五五）测序）测序业务员 QQ 807475538 公司网址：样品的要求目标基因序列（最好附原始测序报告）；目标基因序列（最好附原始测序报告）；克隆模板（包括：菌液、质粒、克隆模板（包括：菌液、质粒、PCR扩增产物、扩增产物、RT-PCR扩增产物、从其他质粒上酶切得到的扩增产物、从其他质粒上酶切得到的DNA片段等）及检测片段等）及检测结果和背景资料；结果和背景资料；载体及其图谱（常用载体可由我方免费提供）；载体及其图谱（常用载体可由我方免费提供）；注明克隆要求，克隆使用的酶切位点。注明克隆要
7、求，克隆使用的酶切位点。业务员 QQ 807475538 公司网址：服务流程载体构建流程为：酶切、凝胶回收、连接、转化、鉴定、测序。业务员 QQ 807475538 公司网址：完成时间2周内完成。业务员 QQ 807475538 公司网址：最终产品构建好的重组质粒，不少于1g； 含有重组质粒的菌株； 电泳图谱，测序图谱，酶切图。业务员 QQ 807475538 公司网址： 快速扩增cDNA末端 RACE技术背景技术背景RACE的基本概念的基本概念不同厂家不同厂家RACE试剂盒的介绍试剂盒的介绍RACE技术的关键环节技术的关键环节存存在的问题及解决办法在的问题及解决办法最终产品最终产品的要求的要
8、求业务员 QQ 807475538 公司网址：技技 术术 背背 景景得到某基因的片段、全长或近全长得到某基因的片段、全长或近全长cDNA的方法：的方法：u建立和筛选建立和筛选cDNA和和DNA文库。文库。u利用利用GenBank数据库中的表达序列标签数据库中的表达序列标签(expresssequencetags,ESTs)拼接出全长或近全长拼接出全长或近全长cDNA。u是多聚酶链式反应即是多聚酶链式反应即PCR。ucDNA末端快速扩增末端快速扩增(RACE)技术技术。用用RNase保护、保护、S1核酸酶谱和引物延核酸酶谱和引物延伸等方法来保证伸等方法来保证mRMA5末端的获取，末端的获取，但又
9、需要大量的但又需要大量的mRNA。业务员 QQ 807475538 公司网址：RACE的优点此方法是通过此方法是通过PCR实现的，无需建立实现的，无需建立cDNA文库，文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息；可以在很短的时间内获得有利用价值的信息；节约了实验所花费的经费和时间；节约了实验所花费的经费和时间；只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长；得大量的感兴趣基因的全长；业务员 QQ 807475538 公司网址：RACE的基本概念cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,
10、 RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，为Frohman在1985年首次报道。3RACE 和5RACE 业务员 QQ 807475538 公司网址：基本原理和方法基本原理和方法利用利用Oligo(dT)对对mRNA进行反转录的同进行反转录的同时在两头加上通用接头时在两头加上通用接头(引物引物)，从而可利，从而可利用基因特异的引物用基因特异的引物(genespecificprimer，GSP)通过通过PCR反应快速获得目的序列的反应快速获得目的序列的5端和端和3 端。端。? T重复寡核苷酸 只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链业务员 QQ 80747553
11、8 公司网址：3RACE原理示意图业务员 QQ 807475538 公司网址：RACE产物的鉴定和全长产物的鉴定和全长cDNA的获得的获得3或或5双链双链cDNA限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切克隆克隆3和和5重叠序列的重叠序列的连接连接RACE产物的产物的3和和5末端序列的分析末端序列的分析合成相应引物合成相应引物PCR获得全长获得全长cDNA业务员 QQ 807475538 公司网址：样品种类样品种类样品要求样品要求动物、植物、微生物物、植物、微生物组织提取提取TotalRNA的材料要新鲜，请您采样后的材料要新鲜，请您采样后立即存于液氮或立即存于液氮或-80后保存不超后保存不超过一个星期一
12、个星期，或加入防止，或加入防止RNA降解的样品稳定剂，降解的样品稳定剂，。RNA如要提供如要提供RNA，要求，要求总RNA50g，浓度度0.50.5g/l；mRNA100n100ng，浓度度1010ng/l；OD260/OD280值：1.91.9至至2.0，以我方，以我方电泳胶泳胶图、紫外分析、紫外分析仪定定量量为准。准。如果基因的含量较低或者未知序列较长，样品量需相应增加。如果基因的含量较低或者未知序列较长，样品量需相应增加。注意：注意：a)建建议由我方提取由我方提取RNA；b)对于客于客户提供的提供的RNA，由于，由于样品原因可能品原因可能没有没有结果或果或结果不好，其果不好，其损失和失和
13、责任全部由任全部由样品提供方承担；品提供方承担；c)由由样品品质量量产生的任何生的任何问题，其，其损失和失和责任任应全部由全部由样品提供方承担。品提供方承担。样品要求样品要求业务员 QQ 807475538 公司网址：不同厂家RACE试剂盒的介绍clontech SMART RACE Invitrogen GeneRacerTM KitBD SMARTTM RACE(Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript )业务员 QQ 807475538 公司网址：RACE技术的关键环节RACE 技术的关键环节有2个：1. 3个连续的酶促反应 （
14、逆转录、TdT加尾、PCR扩增）TdT加尾反应是用脱氧核糖核酸末端转移酶（TDT）催化，它可将dT依次加在寡核苷酸的3端 2. RACE的引物 即使3个酶促反应均平稳顺利进行，但结果也通常会出现一些非特异性产物或非全长的产物背景。业务员 QQ 807475538 公司网址：存在的问题及解决办法反转录反转录1.RNA的质量的质量 有高质量的不被核糖核酸酶降解的RNA，RNA的完整性至关重要。一旦RNA降解就要重新提取，免得后期工作没有结果既浪费时间又浪费试剂，给试验带来麻烦。 2.反转录提前终止反转录提前终止模板中有特殊的二级结构，反转录提前终止。通过提高反转录的温度，加大反转录的反应体系以及反
15、转录过程中一直保持已变性的RNA模板处于50以上，避免以解开二级结构的RNA再恢复原来的结构，以达到5末端。 业务员 QQ 807475538 公司网址：RACE引物的设计引物的设计 在实验过程中总结如下经验：1.引物不能设计在保守区简并引物区。2.各引物之间尽量不要重叠，由于引物的重叠，会引起很严重的引物多联体现象，不能准确地扩增。3.尽量多设计引物，以减少PCR扩增的非特异性。也可以考虑在PCR鉴定阳性克隆的时候另设计一对引物，便于鉴定的正确性。业务员 QQ 807475538 公司网址：PCR扩增及产物的克隆扩增及产物的克隆 PCR扩增存在的问题一方面可能未找到最佳扩增条件而导致产生许多
16、不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；另一方面，可能根本就没有扩增到任何产物。 增加PCR扩增效率，提高扩增产物的特异性解决方法：1.热启动PCR(hotstartPCR)，长距离PCR(long distance PCR)和降落PCR(touchdown PCR)以及加大反应体系中Mg2+的浓度提高扩增效率。2.单引物的线性扩增问题：坚持做单引物对照，并减少引物的浓度。业务员 QQ 807475538 公司网址：ABM12M34M56CA：ThefirstPCR；BC：NestPCRM：2000marker；1：5GSP11+NAP；2：NAP；3：5GSP332+AUAP；4,6：
17、AUAP；5：5GSP333+AUAP图图多轮多轮PCR扩增的电泳结果扩增的电泳结果Fig.ResultsofPCRamplified业务员 QQ 807475538 公司网址：图图5RACE、3RACE克隆的片段与克隆的片段与GsAP2序列拼接序列拼接的结果的结果Fig.Thecontigresultof5RACE、3RACEandGsAP2bysoftware 业务员 QQ 807475538 公司网址：完成时间完成时间完成时间完成时间3-6周内完成。对于有些周内完成。对于有些RNA难以难以抽提的材料或样品材料本身质量问题，时抽提的材料或样品材料本身质量问题，时间较长，会在间较长，会在1周
18、内和客户协商约定时间。周内和客户协商约定时间。特殊样品除外。特殊样品除外。业务员 QQ 807475538 公司网址：最终产品最终产品 扩增全片段测序报告一份扩增全片段测序报告一份 扩增片段的电泳图扩增片段的电泳图 含未知末端片段的质粒载体及细菌一份含未知末端片段的质粒载体及细菌一份业务员 QQ 807475538 公司网址：RACE技术应用RACE技术主要是应用于对全长技术主要是应用于对全长cDNA序列的获得，但对该技术进行一定的修改后，也可在其它方序列的获得，但对该技术进行一定的修改后，也可在其它方面显示出极高的应用价值。面显示出极高的应用价值。RACE技术与生物信息学技术与生物信息学,例
19、如例如EST库相结合库相结合,具有快速具有快速,高效克隆新基因的特点高效克隆新基因的特点,为快速钓取基因家为快速钓取基因家族候选新成员提供新思路族候选新成员提供新思路,如果一个基因是多基因家族的一个成员如果一个基因是多基因家族的一个成员,用基因特异引物用基因特异引物(GSP)可能同时可能同时扩增几个高度同源的扩增几个高度同源的Cdna.李红等利用一条李红等利用一条cDNA作为探针作为探针,通过通过BLASTN从从GenBank中整合出了中整合出了7条更长的条更长的EST,通过设计引物通过设计引物,利用利用RACE扩增扩增,得到了得到了7条新基因条新基因.相比单纯寻找新基因的全长相比单纯寻找新基
20、因的全长,此种此种方法的结合充分利用了信息巨大的基因资源库方法的结合充分利用了信息巨大的基因资源库,得到了更多的信息得到了更多的信息,获得新基因速度更快获得新基因速度更快*效果更高效果更高,属一种颇具规模化的方法属一种颇具规模化的方法,很有应用前景。很有应用前景。 随着随着RACE技术的不断改进和完善技术的不断改进和完善,优化优化PCR扩增的条件以提高扩增的效率和忠实性，扩增的条件以提高扩增的效率和忠实性，RACE技术必技术必将在基因克隆以及基因家族和基因表达变化等研究中发挥极大的作用将在基因克隆以及基因家族和基因表达变化等研究中发挥极大的作用。基因的表达基因的表达 Gene Expressi
21、on业务员 QQ 807475538 公司网址：一表达系统：一表达系统： 基基因因工工程程中中用用来来获获得得有有功功能能的的异异源源蛋蛋白白质质的的体体系系，包包括括克克隆隆载载体体，表表达达载载体体及及受体细胞。受体细胞。 业务员 QQ 807475538 公司网址：业务员 QQ 807475538 公司网址：据受体细胞的不同可分为：据受体细胞的不同可分为：1原核表达系统：原核表达系统： 将将外外源源基基因因引引入入原原核核细细胞胞，并并使使其其在在原原核核细细胞胞中中以以发发酵酵形形式式快快速速高高效效地地表表达达、合成基因产物的体系。合成基因产物的体系。2真核表达系统：使外源基因在真核
22、细真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。胞中表达的体系。业务员 QQ 807475538 公司网址：二原核生物基因结构和表达特点二原核生物基因结构和表达特点业务员 QQ 807475538 公司网址：1.原核生物染色体原核生物染色体DNA是裸露的环形是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续，其转录和翻译是偶联的连续进行。进行。 2.原核生物形成多顺反子原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。结合，翻译形成多条肽链。业务员 QQ 807475538 公司网址：3、一般不含内含子（、一般不含内含子（intron），
23、没有），没有转录及翻译后加工系统转录及翻译后加工系统4、原原核核生生物物中中功功能能相相关关的的基基因因串串联联在在一起，形成操纵子。一起，形成操纵子。业务员 QQ 807475538 公司网址：五原核表达载体：五原核表达载体：适用于在原核细胞适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。中表达外源基因的载体。主要元件：强启动子主要元件：强启动子 SD顺序顺序 筛选标志筛选标志 其它调控基因其它调控基因业务员 QQ 807475538 公司网址：技术关键技术关键：克隆基因插入原核序列：克隆基因插入原核序列33端而维持正确阅读框架端而维持正确阅读框架。选择合适酶切位点选择合适酶切位点加人工合成的加人工合
24、成的DNA接头接头构建位相载体构建位相载体业务员 QQ 807475538 公司网址：优点：优点：表达效率高表达效率高产物稳定产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定易纯化：利用融合原核多肽的特性易纯化：利用融合原核多肽的特性业务员 QQ 807475538 公司网址：Ptac：IPTG诱导诱导GST融合蛋白融合蛋白直接纯化直接纯化产物切割方便：产物切割方便：pGEX-1 T凝血酶凝血酶pGEX-2T-凝血酶凝血酶pGEX-3T-X因子因子位相载体位相载体融合型载体融合型载体-pGEX系列系列业务员 QQ 807475538 公司网址：服务概述 目前本
25、实验室主要采用原核表达体系为pET载体系列与pGEX载体系列，表达菌株为BL21(DE3)系列菌株和Rosseta系列菌株，如有特殊需要，我们还单独可以提供特殊菌株与载体。业务员 QQ 807475538 公司网址：样品要求待测基因序列信息；待测基因序列信息；基因片段；基因片段；待测组织材料或待测组织材料或RNA；待表达基因已尝试表达的方法与结果；待表达基因已尝试表达的方法与结果；表达基因的特殊要求（带何种标签及标签的位置）；表达基因的特殊要求（带何种标签及标签的位置）；纯化方式；纯化方式；最终表达量等最终表达量等。业务员 QQ 807475538 公司网址：服务流程1、客户提供的基因片段。、
26、客户提供的基因片段。 2、构建重组载体质粒：把目的基因片段与相同酶切后的表达载体连、构建重组载体质粒：把目的基因片段与相同酶切后的表达载体连接，转化大肠杆菌克隆菌株感受态细胞，筛选转化子，测序鉴定。接，转化大肠杆菌克隆菌株感受态细胞，筛选转化子，测序鉴定。 3、把重组载体质粒转化至、把重组载体质粒转化至BL21(DE3)或或Rosseta系列表达菌株中，系列表达菌株中，筛选转化子。筛选转化子。 4、重组表达质粒在表达菌株中的诱导表达。、重组表达质粒在表达菌株中的诱导表达。 5、表达产物的、表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。）分析。 6、表达产物的
27、纯化（按照柱材说明书操作）。、表达产物的纯化（按照柱材说明书操作）。 7、纯化产物免疫学活性的鉴定（、纯化产物免疫学活性的鉴定（ELISA 或或WESTERN BLOTTING检检测）测）业务员 QQ 807475538 公司网址：完成时间12月。业务员 QQ 807475538 公司网址：最终产品完整实验报告含有目的基因的表达载体质粒以及对应的菌株。纯化的目的蛋白业务员 QQ 807475538 公司网址：八、原核表达系统的缺点八、原核表达系统的缺点1、没有转录后加工系统，不能识别、没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子剪除内含子2、缺乏翻译后加工系统，不能对翻译、缺乏翻译后加工系统，不能
28、对翻译的蛋白质进一步修饰加工的蛋白质进一步修饰加工业务员 QQ 807475538 公司网址：真核表达系统的必要性及优势真核表达系统的必要性及优势1.具转录后加工系统具转录后加工系统2.具翻译后修饰系统具翻译后修饰系统3.可实现真正的分泌表达可实现真正的分泌表达4.基因治疗基因治疗业务员 QQ 807475538 公司网址：真核基因结构及表达调控特点真核基因结构及表达调控特点（一）真核基因组的复杂性（一）真核基因组的复杂性真核基因组庞大，真核基因组庞大，具大量非编码序列具大量非编码序列-mRNA丰丰度不同度不同结构复杂结构复杂：染色质、核膜、线粒体：染色质、核膜、线粒体-表达调控多表达调控多样
29、样不连续性：内含子、外显子不连续性：内含子、外显子没有操纵子结构没有操纵子结构业务员 QQ 807475538 公司网址：(二）真核表达系统二）真核表达系统组成：真核表达载体组成：真核表达载体受体细胞受体细胞基因转移方式基因转移方式业务员 QQ 807475538 公司网址：据受体细胞及表达载体的不同分为据受体细胞及表达载体的不同分为3种：种：酵母表达系统酵母表达系统哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统业务员 QQ 807475538 公司网址：（三）转化（三）转化1、原生质体法：去除厚壁、原生质体法：去除厚壁2、电穿孔法：效率较高、电穿孔法：效率较高业务员
30、 QQ 807475538 公司网址：（四）外源基因的表达（四）外源基因的表达1、胞内表达、胞内表达2、分泌表达：在、分泌表达：在MCS前加入信号肽前加入信号肽序列序列业务员 QQ 807475538 公司网址：（五）缺点（五）缺点不能实现全部的翻译后修饰功能不能实现全部的翻译后修饰功能业务员 QQ 807475538 公司网址：酵母真核表达目前本实验室主要采用酵母表达体系的载体为pPIC9k与pPIC3.5k，表达菌株为毕赤酵母GS115与KM71，如有特殊需要，我们还单独可以提供特殊菌株与载体。样品要求，以及实验报告同原核表达。业务员 QQ 807475538 公司网址：哺乳细胞真核表达
31、1 随着愈来愈多的治疗疾病的药物蛋白质被发现，高纯度活性蛋白的获得具有更大的意义。 2 通过各种真核表达系统生产外源蛋白是目前研究的热点领域，也是今后蛋白质工程技术一个重要的研究方向。 3 它不仅可以表达克隆的cDNA，而且还可以表达真核基因组DNA，表达的蛋白质可以被适当地修饰(糖基化等)。业务员 QQ 807475538 公司网址：样品要求1.目的基因序列信息2.基因片段亚克隆模板（包括：菌液、质粒、PCR扩增产物、RT-PCR扩增产物、从其他质粒上酶切得到的DNA片段等）及检测结果和背景资料；3.待表达基因的特殊要求（带何种标签及标签的位置）4.纯化方式；5.最终表达量等。业务员 QQ
32、807475538 公司网址：服务流程 哺乳动物细胞的瞬时表达：1、获得含合适限制性内切酶位点的目的基因片段：合成基因或者客户提供(cDNA、基因组DNA、质粒等)；2、构建表达载体；3、瞬时转染CHO、HEK293等哺乳动物细胞；4、Western blot检测。 业务员 QQ 807475538 公司网址：完成时间完成时间 24月。业务员 QQ 807475538 公司网址： 哺乳动物细胞的稳定表达1、获得含合适限制性内切酶位点的目的基因片段：合成基因或者客户提供 (cDNA、基因组DNA、质粒等)；2、构建表达载体；3、稳定转化细胞；4、Western blot检测；5、筛选稳定表达细胞
33、株。业务员 QQ 807475538 公司网址：最终产品完整实验报告；含有目的基因的表达载体质粒，稳定表达的细胞株。纯化的目的蛋白。业务员 QQ 807475538 公司网址：蛋白纯化样品要求1g表达质粒。确定有目的蛋白表达的新鲜或保存的表达菌株；业务员 QQ 807475538 公司网址：服务流程1、（若客户提供质粒）把质粒转化至表达菌株BL21(DE3)系列菌株或Rosseta系列菌株中，筛选转化子。2、重组表达质粒在表达菌株中的诱导表达。3、表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析4、表达产物的纯化（根据可溶性蛋白或包涵体，按照柱材说明书分别操作）5、纯化产物免疫学活性的鉴定（ELISA 或WESTERN BLOTTING检测）业务员 QQ 807475538 公司网址：服务内容纯化15mg蛋白质 2-3周 蛋白质（电泳纯85%）纯化5mg的蛋白质 2-3周 蛋白质（电泳纯85%）特色：免费提供纯化蛋白质或降解产物的质谱鉴定；免费进行表达和纯化过程的条件优化。应用：进行蛋白质的体外表达。业务员 QQ 807475538 公司网址：业务员 QQ 807475538 公司网址：
