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1、抗体实验方法一、抗血清的制备一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。（一）用于免疫的动物（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一
2、般制备抗 r- r-免疫免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为龄，健壮，无感染性疾患，最好为/雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以 2 23kg3kg 为宜。为宜。（二）免疫途径（二）免疫途径免疫
3、途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素背部多点皮内注射，每点注射左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。（三）佐剂（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫
4、反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。剂。佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进 T T 细胞与细胞与 B B 细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗
5、体的产生。和抗体的产生。常用的佐剂是福氏佐剂（常用的佐剂是福氏佐剂（FreundFreund adjuvantadjuvant）, ,其成分通常是羊毛脂其成分通常是羊毛脂 1 1 份、石腊油份、石腊油5 5 份，份，羊毛脂与石腊油羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为的比例，视需要可调整为 1 1：2 29 9（V/VV/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入 1 120mg20mg 卡卡介苗就成为完全佐剂。介苗就成为完全佐剂。配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，
6、用超声波使之混匀，高压灭菌，置 4 4下保存备用。下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗 3 34mg/ml4mg/ml 或不加），加完后再继或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上续研磨成乳剂，滴于冰水上 5 510min10min 内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，内完全不扩散为止。为
7、避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。查合格后即以其中一注射器作注射用。（四）免疫方法（四）免疫方法抗原剂量，首次剂量为抗原剂量，首次剂量为 300300500g500g，加强免疫的剂量约为首次剂量为，加强免疫的剂量约为首次剂量为 1/41/4 左右。每左右。每 2 23 3 周加强免疫周加强免疫一次。加强免疫时用不完全佐剂，首次免疫时皮下注射百日咳疫苗，加强免疫时不必注射百日咳
8、疫苗。一次。加强免疫时用不完全佐剂，首次免疫时皮下注射百日咳疫苗，加强免疫时不必注射百日咳疫苗。在第在第 2 2 次加强免疫后次加强免疫后 2 2 周，从耳缘静脉取周，从耳缘静脉取 2 23ml3ml 血，制备血清，检测抗体效价（见后）。如未达到血，制备血清，检测抗体效价（见后）。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止（图预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止（图 2-32-3）。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备）。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。抗血清。图 2-3 抗体反应（五）抗血清的采集与保存（五）抗血清的采集与保存家兔是最常用以产生抗体的动物，家兔是
9、最常用以产生抗体的动物，因此这里主要讨论兔血的收集。因此这里主要讨论兔血的收集。羊等较大动物以颈静脉、羊等较大动物以颈静脉、动脉取血，动脉取血，鼠等小动物取血可参阅有关资料。取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉入血，也鼠等小动物取血可参阅有关资料。取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉入血，也可心脏采血。取动脉或静脉放血时，将兔放入一个特造的木匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人可心脏采血。取动脉或静脉放血时，将兔放入一个特造的木匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，捉住兔身。剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳
10、廓，30s30s 后，耳血管扩张、充血。用手轻拉耳尖，以单面后，耳血管扩张、充血。用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集剃须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集 303040ml40ml 。然后用棉球压迫止。然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反复多次放血。颈动脉放血时，将兔仰卧，血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反复多次放血。颈动脉放血时，将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。固定于兔台，剪去颈部的毛，切开
11、皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。收集的血液置于室温下收集的血液置于室温下 1h1h 左右，凝固后，置左右，凝固后，置 4 4下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,14000rpm,10min0min。在无菌条件，吸出血清，分装（），贮于。在无菌条件，吸出血清，分装（），贮于-40-40以下冰箱，或冻干后贮存于以下冰箱，或冻干后贮存于 4 4。C C 冰箱保存。冰箱保存。（六）抗血清质量的评价（六）抗血清质量的评价在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都在免疫期间，不仅
12、各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价可能发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。后，才可使用所取得的抗血清。1 1效价效价抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是放射免疫抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。法，此法对所有的抗体均适用
13、。某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。前者测定的效价极为精确。而后者则粗糙得多。前者测定的效价极为精确。而后者则粗糙得多。（1 1）放射免疫法：）放射免疫法： 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育 24h24h 后，测定其结合率。通常后，测定其结合率。通常以结合率为以结合率为 50%50%的血清稀度和为效价。如某抗血清的结合率为的血清稀度和为效价。如某抗血清的结合率为 50%50%时的稀释度为时的稀释度为 1 1：1500015000，则该血清的效，则该血清的效价就是价就是 1 1：1500015000。抗血清的效
14、价，除由抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间，所用。抗血清的效价，除由抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间，所用稀释液的成分及其稀释液的成分及其 pHpH 等因素的影响，在工作中必须引起注意。（测定方法见第等因素的影响，在工作中必须引起注意。（测定方法见第 8 8 章章）（2 2）双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和）双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。判断抗血清中是否有抗体及其浓度。球脂板的制备：球脂板的制备：100ml100ml的磷酸盐
15、缓冲液加到的磷酸盐缓冲液加到 15g15g 的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到趁热用纱布过滤，待溶液冷却到 6565左右时，加入叠氮钠（左右时，加入叠氮钠（NaN3NaN3），使其在溶液中的浓度为），使其在溶液中的浓度为% %。用移液管。用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上，约把琼脂放在干净平皿或玻片上，约 3mm3mm 厚，待其冷却，完全凝固后，用打孔器打孔（图厚，待其冷却，完全凝固后，用打孔器打孔（图 2-42-4）。中央孔内）。中央孔内加适量抗原（容量为加适量抗原（容量为 50l50l），周围各孔内分别加
16、入），周围各孔内分别加入 50l50l 1 1：2 2、1 1：4 4、1 1：8 8、1 1：1616、1 1：3232 及不稀释的抗及不稀释的抗血清，血清，3737下孵育下孵育 24h24h，观察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度（图，观察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度（图 2-52-5）。）。图 2-4 双向扩散模型图 2-5 免疫扩散试验2 2特异性测定特异性测定抗血清的特异性或称专一性是指抗血清对相应的抗原及近似的抗原物质的识别能抗血清的特异性或称专一性是指抗血清对相应的抗原及近似的抗原物质的识别能力。特异性好就是抗血清的识别能力强。通常，特异性是以交叉反应率来表示的。交叉反应率
17、低，表示抗力。特异性好就是抗血清的识别能力强。通常，特异性是以交叉反应率来表示的。交叉反应率低，表示抗血清的特异性好，反之则特异性差。交叉反应率一般是用竞争抑制曲线来判断的。以不同浓度的抗原和近血清的特异性好，反之则特异性差。交叉反应率一般是用竞争抑制曲线来判断的。以不同浓度的抗原和近似抗原物质分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率（似抗原物质分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率（B/TB/T 或或 B/B0B/B0），求出各自在），求出各自在IC50IC50 时的浓度，按下列时的浓度，按下列公式计算交叉反应率。公式计算交叉反应率。S=y/Z100%S=y/Z100%S S：交叉反应率，：交叉反
18、应率，y y：IC50IC50 时抗原浓度，时抗原浓度，Z Z：IC50IC50 时近似抗原物质的浓度。时近似抗原物质的浓度。如某抗原的如某抗原的 IC50IC50 浓度为浓度为 90Pg/90Pg/管，管，而一些近似抗原物质而一些近似抗原物质 IC50IC50 浓度几乎是无限大，浓度几乎是无限大，可以说这一抗血清与可以说这一抗血清与其它抗原物质的交叉反应率近似零，即无交叉反应，该抗血清的特异性是好的。其它抗原物质的交叉反应率近似零，即无交叉反应，该抗血清的特异性是好的。3 3亲合力亲合力在免疫学中，在免疫学中， 亲合力是指抗体与结合抗原体的活度或牢固度。抗体与抗原结合疏松，亲合力是指抗体与结
19、合抗原体的活度或牢固度。抗体与抗原结合疏松，结合后会迅速解离，称为亲合力低，反之，亲合力高。亲合力的高低是由抗原分子的大小，抗体分子的结结合后会迅速解离，称为亲合力低，反之，亲合力高。亲合力的高低是由抗原分子的大小，抗体分子的结合位点与抗原的决定基之间的立体结构型的合适程度决定的。合位点与抗原的决定基之间的立体结构型的合适程度决定的。亲合力常以亲合常数亲合力常以亲合常数 K K 表示。表示。K K 的单位是升的单位是升/ /摩尔（摩尔（L/molL/mol）。在）。在 RIARIA 中，中，K K 是该抗血清能达到的最小检出量（灵敏度）的倒数，是该抗血清能达到的最小检出量（灵敏度）的倒数，K=
20、1/HK=1/H，HH是最小检是最小检出量，通常，出量，通常，K K 的范围在的范围在 1081081012L/mol1012L/mol 之间，也有高达之间，也有高达 1014L/mol1014L/mol 的。的。计算亲合常数的方法计算亲合常数的方法 2020 余种，计算出的余种，计算出的 K K 都不能真实反映实验情况，只能作为参考。都不能真实反映实验情况，只能作为参考。（七）免疫失败的可能原因及应采取的措施（七）免疫失败的可能原因及应采取的措施有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。（1 1）免疫动物的种属及品系是
21、否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。）免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。（2 2）抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分）抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。子的部分结构，或改进提取方法。（3 3）制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考）制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。虑，并加以改进。（4 4）所用的
22、佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。）所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。（5 5）免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。）免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。（6 6）动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，）动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。动物的健康情况是否良好等。二、单克隆抗体的制备二、单克隆抗体的制备19751975 年年 KohlerKohler 和和 Milste
23、inMilstein 发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合， 形成的形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。学的研究进入了一个高度精确的新纪元。免疫细胞化学的免疫细胞化学的 技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定
24、簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（隆抗体（McAbMcAb）的特性和常规血清抗体的特性比
25、较见）的特性和常规血清抗体的特性比较见 2-32-3。表 23 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较项目抗体产生细胞抗体的结合力免疫球蛋白类别及亚类特异性与亲合力常规免疫血清抗体多克隆性特异性识别多种抗原决定簇不均一性，质地混杂批与批之间不同McAb单克隆性特异性识别单一抗原决定簇同一类属，质地纯一特异性高，抗体均一ml(小鼠腹水)有效抗体含量ml（小鼠腹水）g/mlg/ml（培养物上清液）（培养物上清液）用于常规免疫学实验可用单抗组合应用抗原抗体形成格子结构 （沉淀容易形成反应）抗体混杂，形成 2 分子反应困难，抗原抗体反应不可逆可形成 2 分子反应，可逆一般难形成单克隆抗体的
26、制备方法如下。（一）动物的选择与免疫（一）动物的选择与免疫1 1动物的选择动物的选择纯种纯种 BALB/CBALB/C 小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种 BALA/CBALA/C 小鼠。小鼠。2 2免疫方案免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的 McAbMcAb 至关重要。一至关重要。一般在融合前两个月左
27、右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。（1 1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。初次免疫初次免疫 抗原抗原 1 150g50g 加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般1ml,1ml,点）点）3 3 周后周后第二次免疫第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐
28、剂皮下或剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或 ip ip（腹腔内注射）（腹腔内注射）（ip ip 剂量不宜超过）剂量不宜超过）3 3 周后周后第三次免疫第三次免疫 剂量同一，不加佐剂，剂量同一，不加佐剂，ip ip（5 57 7 天后采血测其效价）天后采血测其效价）2 23 3 周周加强免疫，剂量加强免疫，剂量 5050500g500g 为宜，为宜，ip ip 或或 iv iv（静脉内注射）（静脉内注射）3 3 天后天后取脾融合取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：将可溶性抗原颗粒目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：将可溶性
29、抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改变抗原注入的途径，基化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原础免疫可直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。的反应性。（2 2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为量为 1 121072107 个
30、细胞。个细胞。初次免疫初次免疫 1107/1107/ ip ip2 23 3 周后周后第二次免疫第二次免疫 1107/1107/ ip ip3 3 周后周后加强免疫（融合前三天）加强免疫（融合前三天）1107/1107/ ip ip 或或 iv iv取脾融合取脾融合（二）细胞融合（二）细胞融合1 1细胞融合前准备细胞融合前准备（1 1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量 McAbMcAb。常用
31、的骨髓瘤细胞系见表。常用的骨髓瘤细胞系见表 2-42-4。表 2-4 用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系Ig 链名 称来 源耐 受 药 物H LP3/X63-Ag8(X63)P3/P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)BALB/C 骨髓瘤 MOPC-218-氮鸟嘌呤P3/X63-Ag8P3/X63-Ag8（X63BALB/C 脾细胞）杂P3/(P3Ul)交瘤8-氮鸟嘌呤 8-氮鸟嘌呤8-氮鸟嘌呤r1K K（不分泌型）（X63BALB/C 脾细胞）杂SP2/0-Ag14(SP2/0)交瘤F0S194/GM15006TG-A12U-266ARBALB/C 骨髓瘤骨髓瘤 MPC-11大鼠骨髓瘤 R21
32、0人骨髓瘤 GM1500人骨髓瘤 U-2668-氮鸟嘌呤溴脱氧尿嘧啶核苷6-巯鸟嘌呤8-氮鸟嘌呤6-巯鸟嘌呤8-氮鸟嘌呤 r2bKKr1K8-氮鸟嘌呤 骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如 RPMI1640RPMI1640，DMEMDMEM 培养基。小牛血清的浓度一般在培养基。小牛血清的浓度一般在 10%10%2 20%0%，细胞浓度以细胞浓度以 1041045105/ml5105/ml 为宜，为宜，最大浓度不得超过最大浓度不得超过 106/ml106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，当细胞处于对数生长的中期时，可按可按 1 1：3 31 1：1010 的
33、比例传代。每的比例传代。每 3 35 5 天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用 8-8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对 HATHAT 呈均一的敏感性。呈均一的敏感性。（2 2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备 McAbMcA
34、b 的过程中，许多环节的过程中，许多环节需要加需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系 3T33T3 经放经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为 21042104 或或 105105 细胞细胞/ /孔。孔。2 2细胞融合的步骤细
35、胞融合的步骤（1 1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用 BALB/CBALB/C 小鼠，小鼠，6 61010 周周拉颈拉颈 处死，浸泡在处死，浸泡在 75%75%酒精内，酒精内，3 35min5min用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜用无菌注射器注入用无菌注射器注入 5 56ml6ml 预冷的培养液（严禁刺破肠管）预冷的培养液（严禁刺破肠管）反复冲洗，吸出冲洗液反复冲洗，吸出冲洗液冲洗液放入冲洗液放入 10ml10ml 离心管，离心管，1200rpm/1200
36、rpm/分离分离 5 56min6min用用 20%20%小牛血清（小牛血清（NCSNCS）或胎牛血清（）或胎牛血清（FCSFCS）的培养液混悬，调整细胞数至）的培养液混悬，调整细胞数至 1105/ml1105/ml加入加入 9696 孔板，孔板，100l/100l/孔孔放入放入 3737。c c CO2CO2 孵箱培养孵箱培养（2 2）制备免疫脾细胞）制备免疫脾细胞最后一次加强免疫最后一次加强免疫 3 3 天后小鼠拉颈处死天后小鼠拉颈处死无菌取脾脏，培养液洗无菌取脾脏，培养液洗 一次一次脾脏研碎，过不锈钢筛网脾脏研碎，过不锈钢筛网离心，细胞用培养液洗离心，细胞用培养液洗 2 2 次次计数计数
37、取取 108108 脾淋巴细胞悬液备用脾淋巴细胞悬液备用（3 3）制备骨髓瘤细胞）制备骨髓瘤细胞取对数生长骨髓瘤细胞离心取对数生长骨髓瘤细胞离心用无血清培养液洗用无血清培养液洗 2 2 次次计数，取得计数，取得107107 细胞备用细胞备用（4 4）融合）融合将骨髓瘤细胞与脾细胞按将骨髓瘤细胞与脾细胞按 1 1：1010 或或 1 1：5 5 的比例混合在一起，在的比例混合在一起，在 50ml50ml 离心管中用无血清不完全培养离心管中用无血清不完全培养液洗液洗 1 1 次，离心，次，离心，1200rpm,8min;1200rpm,8min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（弃上清
38、，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEGPEG）浓度。轻轻弹）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。击离心管底，使细胞沉淀略松动。90s90s 内加入内加入 3737预温的预温的 1ml1ml 45%PEG45%PEG（分子量（分子量 40004000）溶液，边加边轻微摇动。）溶液，边加边轻微摇动。3737水浴作用水浴作用 90s90s。加加 3737。C C 预温的不完全培养液以终止预温的不完全培养液以终止 PEGPEG 作用，每隔作用，每隔 2min2min 分别加入分别加入 1ml1ml、2ml2ml、3ml3ml、4ml4ml、5ml5ml 和和6ml6ml。离心，离心，80
39、0rpm,800rpm, 6min6min。充上清，用含充上清，用含 20%20%小牛血清小牛血清 HATHAT 选择培养液重悬。选择培养液重悬。将上述细胞，加到已有饲养细胞层的将上述细胞，加到已有饲养细胞层的 9696 孔板内，每孔加孔板内，每孔加 100l100l。一般一个免疫脾脏可接种。一般一个免疫脾脏可接种 4 4 块块 9696孔板。孔板。将培养板置将培养板置 3737、5%CO25%CO2 培养箱中培养。培养箱中培养。（三）选择杂交瘤细胞及抗体检测（三）选择杂交瘤细胞及抗体检测1 1HATHAT 选择杂交瘤细胞选择杂交瘤细胞脾细胞和骨髓瘤细胞经脾细胞和骨髓瘤细胞经 PEGPEG 处
40、理后，形成多种细胞的混合体，只有脾处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在在 HATHAT 选择培养液中培养时，选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HATHAT 选择培养液可以选择培养液可以生长繁殖。生长繁殖。在用在用 HATHAT 选择培养选择培养 1 12 2 天内，将有大量瘤细胞死亡，天内，将有大量瘤细胞死亡，3 34 4 天后瘤
41、细胞消失，杂交细胞形成小集落，天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HATHAT 选择培养液维持选择培养液维持 7 71010 天后应换用天后应换用 HTHT 培养液，再维持培养液，再维持 2 2 周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底杂交瘤细胞布满孔底 1/101/10 面积时，面积时，即可开始检测特异性抗体，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养在选择培养期间，一般每期间，一般每 2 23 3 天换一半培养液。天换一半培养液。2 2抗体的检测抗体的检测检测抗体的方法应根据抗原的性质
42、、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有：（常用的方法有：（1 1）放射免疫测定（）放射免疫测定（RIARIA）可用于可溶性抗原、细胞）可用于可溶性抗原、细胞 McAbMcAb 的检测。（的检测。（2 2）酶联免疫吸）酶联免疫吸附试验（附试验（ELISAELISA）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等 McAbMcAb 的检测。（的检测。（3 3）免疫荧光试验适合于细胞表面抗）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的
43、原的 McAbMcAb 的检测。（的检测。（4 4）其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。）其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。（四）杂交瘤的克隆化（四）杂交瘤的克隆化杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过因为经过 HATHAT 筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异
44、性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防
45、止杂交瘤细胞的突变或染使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。1 1有限稀释法克隆有限稀释法克隆（1 1）克隆前）克隆前 1 1 天制备饲养细胞层（同细胞融合）。天制备饲养细胞层（同细胞融合）。2 2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。（3 3）调整细胞为）调整细胞为 3 31010 个细胞个细胞/ml/ml。
46、（4 4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞 100l100l。孵育于。孵育于 3737、5%CO25%CO2 孵箱孵箱中中 。（5 5）在第）在第 7 7 天换液，以后每天换液，以后每 2 23 3 天换液天换液 1 1 次。次。（6 6）8 89 9 天可见天可见 细胞克隆形成，及时检测抗体活性。细胞克隆形成，及时检测抗体活性。（7 7）将阳性孔的细胞移至）将阳性孔的细胞移至 2424 孔板中扩大培养。孔板中扩大培养。（8 8）每个克隆应尽快冻存。）每个克隆应尽快冻存。2 2软琼脂培养法克隆软琼脂培养法克隆（1 1）软
47、琼脂的配制：含有）软琼脂的配制：含有 20%NCS20%NCS（小牛血清）的（小牛血清）的 2 2 倍浓缩的倍浓缩的 RPMI1640RPMI1640。1%1%琼脂水溶液：高压灭菌，琼脂水溶液：高压灭菌，4242预热。预热。% %琼脂：由琼脂：由 1 1 份份 1%1%琼脂加琼脂加 1 1 份含份含 20%20%小牛血清的小牛血清的 2 2 倍浓缩的倍浓缩的 RPMI1640RPMI1640 配制而成。置配制而成。置 4242保温。保温。（2 2）用上述）用上述% %琼脂液（含有饲养细胞）琼脂液（含有饲养细胞）15ml15ml 倾注于直径为倾注于直径为 9cm9cm 的平皿中，在室温中待凝固后
48、作为基的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。底层备用。（3 3）按）按 100/ml100/ml，500/ml500/ml 或或 5000/ml5000/ml 等浓度配制需克隆的细胞悬液。等浓度配制需克隆的细胞悬液。（4 4）1ml1ml % %琼脂液（琼脂液（4242预热）在室温中分别与预热）在室温中分别与 1ml1ml 不同浓度的细胞悬液相混合。不同浓度的细胞悬液相混合。（5 5）混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中）混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中 10min10min，使其凝固，孵育于，使其凝固，孵育于 3737、5%CO25%CO2 孵箱中。孵箱中。（6 6）4 45 5 天
49、天 后即可见针尖大小白色克隆，后即可见针尖大小白色克隆，7 71010 天后，直接移种至含饲养细胞的天后，直接移种至含饲养细胞的 2424 孔中进行培养。孔中进行培养。（7 7）检测抗体，扩大培养，必要是地再克隆化。）检测抗体，扩大培养，必要是地再克隆化。（五）杂交瘤细胞的冻存与复苏（五）杂交瘤细胞的冻存与复苏1 1杂交瘤细胞的冻存杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体
50、的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含 11061106 以上，但对以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在 2424 孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以装孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以装一支安瓿冻存。一支安瓿冻存
51、。细胞冻存液：细胞冻存液：50%50%小牛血清；小牛血清；40%40%不完全培养液；不完全培养液；10%DMSO10%DMSO（二甲基亚砜）。（二甲基亚砜）。冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至 0 0后放入后放入-70-70超低温冰箱，次日超低温冰箱，次日转入液氮中。转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。在液氮中细胞可保存数年或更长时间。2 2
52、细胞复苏方法细胞复苏方法将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放 3737水浴中，在水浴中，在 1min1min 内使冻存的细胞解冻，内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置置 3737、5%CO25%CO2 孵箱中孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。（六）单克隆抗体的大量生产（六）单克隆抗体的大量生产大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：（1 1）体外使用旋转培养管大量
53、培养杂交瘤细胞，从一清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从一清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液内抗体含量为般培养液内抗体含量为 101060g/ml,60g/ml,如果大量生产，费用较高。如果大量生产，费用较高。（2 2）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按 1 13107/ml3107/ml 接种于小鼠背部皮下，每处注射接种于小鼠背部皮下，每处注射, ,共共 2 24 4 点。点。待肿瘤达到一定大小后（一般待肿瘤达到一定大小后（一
54、般 10102020 天）则可采血，从血清中获得单克隆天）则可采血，从血清中获得单克隆 抗体的含量可达到抗体的含量可达到 1 110mg/10mg/mlml。但采血量有限。但采血量有限。腹水的制备：常规是先腹腔注射腹水的制备：常规是先腹腔注射 PristanePristane ( (降植烷降植烷) )或液体石蜡于或液体石蜡于 BALB/CBALB/C 鼠，鼠，1 12 2 周后腹腔注射周后腹腔注射 1 1106106 个杂交瘤细胞，个杂交瘤细胞，接种细胞接种细胞 7 71010 天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可待腹水
55、尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获 5 510ml10ml 腹水。也腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到 5 510mg/ml10mg/ml，这是目前最常用的，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水块、量多。方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水块、量多。（七）单克隆抗体的鉴定（七）单克隆抗体的鉴定对制备的对制备的 Mc
56、AbMcAb 进行系统的鉴定是十分必要的，应做下述几个方面的鉴定：进行系统的鉴定是十分必要的，应做下述几个方面的鉴定：1 1抗体特异性的鉴定抗体特异性的鉴定除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用它抗原进行交叉试验，方法可用 ELISAELISA、IFAIFA 法。例如：法。例如：制备抗黑色素瘤细胞的制备抗黑色素瘤细胞的 McAbMcAb，除用黑色素瘤细，除用黑色素瘤细胞反应外，还应该用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原胞反应外，还应该用其
57、它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。的单克隆抗体。制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。其次是与其它细胞因子间有无交叉。2 2 McAbMcAb 的的 Ig Ig 类与亚类的鉴定类与亚类的鉴定一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时已经基本上确定一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时已经基本上确定了抗体的了抗体的 Ig Ig 类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠类型。如果用的是酶标或荧光
58、素标记的兔抗鼠 IgGIgG 或或 IgMIgM，则检测出来的抗体一般是，则检测出来的抗体一般是 IgGIgG 类或类或IgMIgM 类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心 ELISAELISA 来确定。在作双扩试验时，如加入适来确定。在作双扩试验时，如加入适量的量的 PEGPEG（3%3%），更有利于沉淀线的形成。），更有利于沉淀线的形成。3 3McAbMcAb 中和活性的鉴定中和活性的鉴定用动物或细胞的保护实验来确定用动物或细胞的保护实验来确定 McAbMcAb 的生物学活性。例如，如果的生物学活性。例如，如果确定抗病毒确定抗病
59、毒 McAbMcAb 的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。胞是否得到抗体的保护。4 4 McAbMcAb 识别抗原表位的鉴定识别抗原表位的鉴定用竞争结合试验，用竞争结合试验，测相加指数的方法，测相加指数的方法，测定测定 McAbMcAb 所识别抗原位点，所识别抗原位点，来确定来确定 McAbMcAb 的识别的表位是否相同。的识别的表位是否相同。5 5McAbMcAb 亲合力的鉴定亲合力的鉴定用用 ELISAELISA 或或 RIARIA 竞争结合试验来确定竞争结合试验来确定 McAbMcAb 与相应抗原结合的亲合力。与相应抗原结合的亲合力。
