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1、第十二章第十二章无病毒苗木培育无病毒苗木培育陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育本章内容提要：本章内容提要：植物病毒危害与研究历史概况植物病毒危害与研究历史概况脱毒培养的概念与意义脱毒培养的概念与意义脱除病毒的原理与方法脱除病毒的原理与方法脱病毒植株的检测与保存脱病毒植株的检测与保存陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育一、一、植物病毒的危害与研究概况植物病毒的危害与研究概况 1 1 植物病毒的分布植物病毒的分布 1.1 1.1 植物病毒的地理分布的不均匀性植物病毒的地理分布的不均匀性 1.2 1.2 在植物体内分布的不均匀性在植物体内分布的不均匀性 病毒具有系统侵染
2、的特点，杂除生长点外，病毒具有系统侵染的特点，杂除生长点外，的各个部位均有，有差异性，存在不均有分布。的各个部位均有，有差异性，存在不均有分布。陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育2 2、植物病毒的危害、植物病毒的危害2.1 2.1 植物病毒的种类植物病毒的种类 已报道的植物病毒达已报道的植物病毒达500500多种，且危害越来越严重。多种，且危害越来越严重。 核果类：核果类： 148 148 余种；余种； 马铃薯：马铃薯： 30 30 余种；余种； 苹苹 果：果： 30 30 余种；余种； 柑柑 桔：桔： 20 20 多种；多种； 观赏植物：观赏植物：200 200 多种。多种。
3、 19 19世纪欧洲马铃薯晚疫病；世纪欧洲马铃薯晚疫病；19981998年年6 6月马铃薯病月马铃薯病 毒在欧洲蔓延。毒在欧洲蔓延。 草莓病毒；柑橘衰退病；柑橘黄龙病。草莓病毒；柑橘衰退病；柑橘黄龙病。陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育TMVTYMV陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育2.2 2.2 病毒对植物外观状态的影响病毒对植物外观状态的影响花叶型：花叶型： 也称花叶病。是由于叶绿体结团也称花叶病。是由于叶绿体结团或退化引起。造成叶片上形成暗绿或退化引起。造成叶片上形成暗绿( (正常正常) )、亮绿亮绿( (结团结团) )和黄色和黄色( (退化退化) )区域
4、。区域。环斑型：环斑型：在叶片、果实或茎的表面形成单线圆纹或同心纹的环、全环或半环，以用连续屈曲状的环。常常和花叶同时发生。畸形生长型畸形生长型 ：各种反常的生长。陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育黄瓜花叶病毒（黄瓜花叶病毒（CMVCMV）郁金香郁金香条斑病毒条斑病毒（TuBVTuBV）陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育芋的花叶病芋的花叶病百合丛簇病百合丛簇病（CTLV）陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育变色型变色型：叶片的局部或全部颜色改变。如叶片的局部或全部颜色改变。如褪绿、变黄、变橙、变红、变紫、变蓝绿褪绿、变黄、变橙、变红、变紫、变蓝绿等
5、。郁金香碎裂病毒感染郁金香，使其花等。郁金香碎裂病毒感染郁金香，使其花色由单色发生斑驳或纵向条点。色由单色发生斑驳或纵向条点。坏死与变质：坏死与变质：某些细胞组织死亡或组织质某些细胞组织死亡或组织质地变软或变硬或木栓化。地变软或变硬或木栓化。陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育芋的枯萎病芋的枯萎病陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育2.3 2.3 染病后对生长和经济性状的影响染病后对生长和经济性状的影响影响植物的正常生理代谢，不利于生长发育，影响植物的正常生理代谢，不利于生长发育，出现各种病症，如花叶，黄化。出现各种病症，如花叶，黄化。因植物病毒导致的年均损失约因植
6、物病毒导致的年均损失约600600亿美元，亿美元，仅次于真菌病害位列第二。仅次于真菌病害位列第二。陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育3 3 研究历史概况研究历史概况1889年，印尼有人发现，患枯萎病的甘蔗放在年，印尼有人发现，患枯萎病的甘蔗放在50-520C的热水中保持的热水中保持30分钟，可去除枯萎病。分钟，可去除枯萎病。1936年，年，Kunkel报道患有桃黄萎病报道患有桃黄萎病(yellow virus)的植株，在的植株，在34-360C处理处理14天可失活。天可失活。1952年，法国年，法国morel通过培养茎尖培养获得第一株通过培养茎尖培养获得第一株脱毒苗，脱毒苗，1
7、955年，获得马铃薯脱毒苗。年，获得马铃薯脱毒苗。目前，很多农作物都已经获得了脱毒苗。目前，很多农作物都已经获得了脱毒苗。陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育4 4 离体培养脱毒的概念与意义离体培养脱毒的概念与意义 4.1 4.1 概念：概念： 是指通过植物组织培养技术，在离体的是指通过植物组织培养技术，在离体的条件下，进行脱毒培养，从而获得无病毒再条件下，进行脱毒培养，从而获得无病毒再生植株的技术。生植株的技术。 陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育4.2 4.2 意义意义 现在离体培育无病毒苗现在离体培育无病毒苗(virus-free plant)(virus-
8、free plant)已在生已在生产中发挥重要作用。产中发挥重要作用。可提高植物的生理状态，从而有效防病。可提高植物的生理状态，从而有效防病。可对已退化了的优良品性作物进行复壮，从而提高可对已退化了的优良品性作物进行复壮，从而提高产量和品质。产量和品质。大蒜经组培脱毒后，蒜头可增产大蒜经组培脱毒后，蒜头可增产23.3%23.3%114.3%114.3%，蒜，蒜薹增产薹增产58.3%58.3%175.0%175.0%。用脱毒草莓苗进行生产，可提高果实产量用脱毒草莓苗进行生产，可提高果实产量20% 45%20% 45%，果实可溶性固形物含量增加，果实可溶性固形物含量增加5.3%5.3%15.3%1
9、5.3%。陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育二、植物脱毒原理与方法二、植物脱毒原理与方法1 原理：原理：病毒在植物体内的分布是不均匀的，在茎尖中呈梯度病毒在植物体内的分布是不均匀的，在茎尖中呈梯度分布。在受侵染的植株中，顶端分生组织无病毒或含分布。在受侵染的植株中，顶端分生组织无病毒或含毒量极低。毒量极低。（具体见（具体见P 182 页）页）组织的含毒量随与茎尖的距离加大而增加。组织的含毒量随与茎尖的距离加大而增加。植物病毒自身不具有主动转移的能力。植物病毒自身不具有主动转移的能力。植物细胞的分裂与病毒繁殖之间存在竞争。植物细胞的分裂与病毒繁殖之间存在竞争。适当高温可以钝化病毒
10、活性（不能杀死病毒）适当高温可以钝化病毒活性（不能杀死病毒）陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育1 1、物理的方法、物理的方法热处理（热疗）法：热处理（热疗）法：温汤浸渍法温汤浸渍法( (木本木本) )、热空气热空气处处理法理法( (草本草本) )。原理：原理：适当高温处理可钝化病毒。适当高温处理可钝化病毒。病毒衣壳蛋白分病毒衣壳蛋白分子结构不同，抗热能力不同。利用不同病毒受热力子结构不同，抗热能力不同。利用不同病毒受热力处理后衣壳蛋白变性，病毒活性丧失的原理进行热处理后衣壳蛋白变性，病毒活性丧失的原理进行热处理脱毒。此时病毒不能合成或合成很少，而破坏处理脱毒。此时病毒不能合成或
11、合成很少，而破坏却增加，使寄主体内病毒含量不断降低。却增加，使寄主体内病毒含量不断降低。把握处理把握处理的部位、温度范围、时间。的部位、温度范围、时间。应用：应用：蔓性长春花、苹果、树莓、草莓、菊花、黄蔓性长春花、苹果、树莓、草莓、菊花、黄瓜、梨、康乃馨等已有报道或应用。瓜、梨、康乃馨等已有报道或应用。三、植物脱毒方法三、植物脱毒方法陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育2 2、化学方法、化学方法采用某些化学物质，如生长调节剂、采用某些化学物质，如生长调节剂、2-硫尿硫尿嘧啶，抗病毒制剂嘧啶，抗病毒制剂virazole等。等。陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育3 3
12、、生物学方法、生物学方法3.1 3.1 茎尖组织培养脱毒法茎尖组织培养脱毒法原理：原理：分生组织的细胞生长速度快，病毒在植物分生组织的细胞生长速度快，病毒在植物体内繁殖的速度相对较慢；而且病毒的传播是靠筛体内繁殖的速度相对较慢；而且病毒的传播是靠筛管组织进行转移，或通过细胞间连丝传递给其他细管组织进行转移，或通过细胞间连丝传递给其他细胞，因此病毒的传递扩散也受到一定限制。造成病胞，因此病毒的传递扩散也受到一定限制。造成病毒在植物体内分布不均。毒在植物体内分布不均。方法：方法：茎尖大小与脱毒率成反比，与成活率成正茎尖大小与脱毒率成反比，与成活率成正比。比。陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病
13、毒苗木培育陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育食用百合食用百合的脱毒培的脱毒培养过程养过程陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育3.2 3.2 愈伤组织培养脱毒法愈伤组织培养脱毒法 愈伤组织中某些细胞不带愈伤组织中某些细胞不带病毒，可能是细胞的分裂速病毒，可能是细胞的分裂速度快于病毒的复制速度，而度快于病毒的复制速度，而似的少数细胞无病毒，这样似的少数细胞无病毒，这样通过这些细胞来再生植株，通过这些细胞来再生植株，以获得无病毒苗。以获得无病毒苗。陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育3.3 3.3 珠心胚培养脱毒珠心胚培养脱毒利用多胚性植物利用多胚性植物(
14、 (如柑桔和芒果如柑桔和芒果) )的珠心胚培养脱的珠心胚培养脱除病毒，获得无病毒苗。因为珠心细胞与维管束除病毒，获得无病毒苗。因为珠心细胞与维管束系统无直接联系。系统无直接联系。缺点：缺点：20-30%20-30%的变异率、童期较长。的变异率、童期较长。3.4 3.4 花器官等培养脱毒花器官等培养脱毒 如草莓花药、香蕉花序轴、水仙的子房切片。已在如草莓花药、香蕉花序轴、水仙的子房切片。已在马铃薯、大蒜、草莓、水仙、香蕉等园艺植物中马铃薯、大蒜、草莓、水仙、香蕉等园艺植物中脱毒成功。脱毒成功。陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育3.
15、5 微体嫁接离体培养脱毒法微体嫁接离体培养脱毒法 （见书本（见书本188页）页）方法：方法：技术关键：技术关键：陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育3.6 3.6 综合脱毒法综合脱毒法1 1） 茎尖培养结合热处理茎尖培养结合热处理2 2） 茎尖培养结合病毒钝化剂处理茎尖培养结合病毒钝化剂处理陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育热处理结合茎尖脱毒培养热处理结合茎尖脱毒培养陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育四四 脱毒苗的鉴定脱毒苗的鉴定(1) (1) 指示植物鉴定法：指示植物鉴定法：美国病毒学家Holmes于1929年发现，因为是利用病毒在其它植物上产生
16、枯斑作为鉴别病毒种类的标准，也称为枯斑和空斑测定法。如千日红对X病毒的反应是接种后在叶片上出现红色病斑；洋酸浆对Y病毒-叶片上出现许多小型点状病斑； 方法：方法：摩擦接种法；嫁接接种法。 局限：局限：只能测出病毒的相对感染力；只能鉴定靠汁液及嫁接传染的病毒。陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育(2) (2) 免疫法免疫法A A、酶联免疫吸附法、酶联免疫吸附法 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA) 1997年Clark和Adams用微量血凝板建立了诊断植物病毒的ELISA技术。Casper首先用其测定了PLRV病毒。 原理：原理：抗血清
17、(antiserum)鉴定法： 抗血清即含有抗体的血清；血清反应即抗体与抗原的结合。由于血清反应的特异性，故可用于病毒的鉴定。 特点：特点：特异性高；测定速度快；灵敏度高；可定量。陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育植物组织培养 无病毒苗木培育B B：生物素：生物素亲和素亲和素酶联免疫吸附法；酶联免疫吸附法；C C：免疫吸附电子显微术；：免疫吸附电子显微术；D D：点免疫结合试验。：点免疫结合试验。3、PCR方法：方法：近年来发展起来的广泛用于各近年来发展起来的广泛用于各种病原菌检
18、测的方法。种病原菌检测的方法。4 4、电子显微镜、电子显微镜(Electron microscope):(Electron microscope):检查法检查法 直接观察，但病毒浓度不能太低。可得知病毒颗粒的直接观察，但病毒浓度不能太低。可得知病毒颗粒的大小，形状和结构，对病毒鉴定很重要。大小，形状和结构，对病毒鉴定很重要。陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育作业作业与与探究探究1、什么是植物无病毒培养？、什么是植物无病毒培养？2、植物无病毒培养的方法有哪些，试用列、植物无病毒培养的方法有哪些，试用列表的形式加以比较。表的形式加以比较。？植物毒素与植物脱毒有什么不同？植物毒素与植物脱毒有什么不同？陈传红陈传红 制作制作植物组织培养 无病毒苗木培育
