植物病理学研究方法第45章课件

《植物病理学研究方法第45章课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物病理学研究方法第45章课件（142页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、植物病理学基础研究方法植物病理学基础研究方法 （第第4章章细菌病害研究技术）7/20/20241植物病理学研究方法第45章第第4 4章章 细菌病害研究技术ErwinFrinkSmith(18541927)l美国植物病理学家，植物病原细菌学奠基人。美国植物病理学家，植物病原细菌学奠基人。18541854年年 1 1月月2121日生于美国纽约，日生于美国纽约， 19271927年年4 4月月6 6日卒于华盛顿。日卒于华盛顿。l史密斯从史密斯从18921892年起开始从事细菌病害的研究。年起开始从事细菌病害的研究。18951895年首次发年首次发表了关于瓜类萎蔫病的研究论文。曾对果树根癌病、甘兰黑腐

2、表了关于瓜类萎蔫病的研究论文。曾对果树根癌病、甘兰黑腐病和茄科植物青枯病等进行过系统研究。病和茄科植物青枯病等进行过系统研究。l 在在1919世纪末到世纪末到2020世纪初同德国细菌学家世纪初同德国细菌学家A.A.菲舍尔在细菌是否菲舍尔在细菌是否引起植物病害的问提上，进行了长达引起植物病害的问提上，进行了长达1010年的激烈论战，并以大年的激烈论战，并以大量的事实和研究成果赢得了论战的胜利，量的事实和研究成果赢得了论战的胜利， 从而进一步推动了植从而进一步推动了植物细菌性病害的研究。物细菌性病害的研究。l19031903年出版世界上第一本关于植物细菌病害的专著年出版世界上第一本关于植物细菌病害

3、的专著细菌与细菌与植物病害的关系植物病害的关系第第卷。卷。l国际细菌学分类和命名委员会以他的名字作为植物病原周毛国际细菌学分类和命名委员会以他的名字作为植物病原周毛杆菌属的命名，即欧文氏杆菌属杆菌属的命名，即欧文氏杆菌属( (ErwiniaErwinia) )。ErwinFrinkSmith(18541927)7/20/20242植物病理学研究方法第45章第四章 细菌病害研究技术第一节第一节 病原细菌的分离、纯化、培养和病原细菌的分离、纯化、培养和 菌种保存菌种保存第二节第二节 细菌的接种细菌的接种第三节第三节 病原细菌的鉴定病原细菌的鉴定7/20/20243植物病理学研究方法第45章第一节第

4、一节 病原细菌的分离、纯化、病原细菌的分离、纯化、培养和菌种保存培养和菌种保存一一. .病原细菌的分离病原细菌的分离二二. .病原细菌的纯化病原细菌的纯化三三. .病原细菌的培养病原细菌的培养四四. .病原细菌的菌种保存病原细菌的菌种保存7/20/20244植物病理学研究方法第45章一.病原细菌的分离植物病原细菌的分离方法植物病原细菌的分离方法主要有主要有划线分离法划线分离法和和稀释分离法稀释分离法二种。二种。最常用的方法是最常用的方法是划线分离法划线分离法。7/20/20245植物病理学研究方法第45章( (一一) )划线分离法划线分离法1.1.事先准备事先准备l无菌操作室或清洁安静的房间，

5、超净工作台等。无菌操作室或清洁安静的房间，超净工作台等。l分离材料：要选择新鲜的分离材料。分离材料：要选择新鲜的分离材料。 l培养基：培养基：NANA培养基培养基等。等。l分离器皿及工具：分离器皿及工具： 无菌培养皿、无菌吸管、无菌玻璃涂棒、剪刀、无菌培养皿、无菌吸管、无菌玻璃涂棒、剪刀、解剖刀、镊子、解剖刀、镊子、接种环接种环、70%70%酒精、酒精、0.1%0.1%升汞、酒精灯、升汞、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、橡皮筋套、微波炉等。火柴、玻璃铅笔、橡皮筋套、微波炉等。 l无菌水：盛于三角瓶或试管中。无菌水：盛于三角瓶或试管中。7/20/20246植物病理学研究方法第45章2. 2. 操作步骤操

6、作步骤l倒平板倒平板l切取病组织切取病组织l表面消毒表面消毒l无菌水洗无菌水洗3 3次次l制备菌悬液制备菌悬液l平板上平板上划线划线l2525培养培养l选择选择单菌落单菌落移入斜面移入斜面l 25 25培养培养l检查斜面上分离菌检查斜面上分离菌l保存菌种保存菌种 培养后培养后细菌长出细菌长出选择单菌落选择单菌落移入斜面画蛇行线移入斜面画蛇行线保存菌种保存菌种划线划线2424小时培养后小时培养后, ,可见菌落可见菌落7/20/20247植物病理学研究方法第45章划线分离法划线分离法-要形成单菌落要形成单菌落火焰上烧去接种环上火焰上烧去接种环上的细菌悬液的细菌悬液7/20/20248植物病理学研究

7、方法第45章3.3.注意事项注意事项 要选择新鲜的分离材料，要选择新鲜的分离材料， 如果材料上腐生菌多，应重新接种，如果材料上腐生菌多，应重新接种， 发病后再用于分离。发病后再用于分离。 分离细菌的表面消毒时间应少于分离真菌，分离细菌的表面消毒时间应少于分离真菌， 如用如用0.10.1升汞消毒时间应为升汞消毒时间应为0.5min0.5min或或再少些再少些。也可用更温和的表面消毒剂，如也可用更温和的表面消毒剂，如70%70%酒精酒精等。等。 如果分离材料很新鲜，也如果分离材料很新鲜，也可不进行表面消毒可不进行表面消毒，用无菌水洗用无菌水洗3 3次即可。次即可。7/20/20249植物病理学研究

8、方法第45章注意事项注意事项 分离细菌时选择性培养基经常应用。分离细菌时选择性培养基经常应用。lErwinia属属 可用可用MSMS或或CVPCVP；lXanthomonas 属可用属可用YDCYDC; ;lPseudomonas 属中带荧光者可用属中带荧光者可用KBKB，l 不带荧光者用不带荧光者用NBYNBY 1000mL 1000mL中加入中加入TTC(TTC(三苯基四三苯基四唑化氮唑化氮)1)1溶液溶液5mL;5mL;lAgrobacterium属属 用用D1D1培养基。培养基。q G G+ + 各属可用各属可用1/1/万万重铬酸钾（钠）重铬酸钾（钠）抑制抑制G G- -，q 加一些天

9、门冬酰胺利于加一些天门冬酰胺利于G G+ +生长。生长。7/20/202410植物病理学研究方法第45章注意事项注意事项 使用的使用的NANA培养基等灭菌后易偏酸，而细菌培养基等灭菌后易偏酸，而细菌喜硷性，可适当喜硷性，可适当调节调节pHpH。 对分离菌菌落不了解时，分离时要选择对分离菌菌落不了解时，分离时要选择优优势菌落势菌落移入斜面。移入斜面。 如果无优势菌落，则要重新分离或将如果无优势菌落，则要重新分离或将各种各种菌落菌落都分离出来，再进一步选择。都分离出来，再进一步选择。7/20/202411植物病理学研究方法第45章( (二二) ) 稀释分离法稀释分离法1.1.事先准备事先准备l大体

10、同划线分离法大体同划线分离法7/20/202412植物病理学研究方法第45章( (二二) ) 稀释分离法稀释分离法2.2.操作步骤操作步骤（大体同真菌）（大体同真菌）切取病组织切取病组织表面消毒表面消毒无菌水洗无菌水洗3 3次次制备菌悬液制备菌悬液稀释稀释用约用约5050培养基培养基倒平板倒平板 25 25培养培养选择选择优势单菌落优势单菌落移入斜面移入斜面2525培养检查斜面上分离菌培养检查斜面上分离菌保存菌种保存菌种 7/20/202413植物病理学研究方法第45章稀释分离法示意图稀释分离法示意图7/20/202414植物病理学研究方法第45章两种两种稀释分离法示意图稀释分离法示意图稀释倒

11、平板法稀释倒平板法涂布平板法涂布平板法7/20/202415植物病理学研究方法第45章二二. .病原细菌的纯化病原细菌的纯化l方法方法：利用稀释分离法、划线分离法等利用稀释分离法、划线分离法等重新重新进行分离，进行分离，待待同一平板上的菌落性状达到全部一致同一平板上的菌落性状达到全部一致，再移殖其中单菌落到斜面培养基再移殖其中单菌落到斜面培养基就认为菌种得以纯化。就认为菌种得以纯化。7/20/202416植物病理学研究方法第45章病原细菌的纯化病原细菌的纯化待同一平板上的菌落待同一平板上的菌落性状达到全部一致性状达到全部一致, ,再移殖其中单菌落再移殖其中单菌落到斜面培养基到斜面培养基, ,就

12、认为菌种得以纯化就认为菌种得以纯化. .7/20/202417植物病理学研究方法第45章病原细菌的致病性测定：病原细菌的致病性测定：l一般在细菌获得分离后，紧接着就应对其进一般在细菌获得分离后，紧接着就应对其进行行致病性的测定致病性的测定工作。工作。 如果我们分离的菌株并非致病菌，则使如果我们分离的菌株并非致病菌，则使用这种菌株继续进行研究只会白白浪费时间。用这种菌株继续进行研究只会白白浪费时间。l致病性的测定方法：致病性的测定方法： 将分离菌接种于其健康的寄主植物，如将分离菌接种于其健康的寄主植物，如可致病，则致病性获得确认。可致病，则致病性获得确认。7/20/202418植物病理学研究方法

13、第45章简易的致病性测定方法：过敏反应测定简易的致病性测定方法：过敏反应测定l还有一种还有一种简易的致病性测定方法简易的致病性测定方法， 即进行该细菌的即进行该细菌的过敏反应测定过敏反应测定。l常用方法为：配制此细菌常用方法为：配制此细菌菌悬液菌悬液（浓度：（浓度：10108-98-9 cfucfu/mL/mL ） 简易判断此浓度的方法：在盛有菌悬液的试管后面放一张报纸，可分辨出字块，但无简易判断此浓度的方法：在盛有菌悬液的试管后面放一张报纸，可分辨出字块，但无法辨认出字形时，大体为此浓度。法辨认出字形时，大体为此浓度。l注射注射到普通烟草叶（脉）片中，经过到普通烟草叶（脉）片中，经过24h2

14、4h（气温在（气温在20202525），），如菌悬液扩散所到处变成如菌悬液扩散所到处变成褐色褐色，即为过敏反应阳性，表明其为致，即为过敏反应阳性，表明其为致病菌。病菌。l这种方法并非这种方法并非100100可靠，但可对分离出来的多个菌株进行初筛。可靠，但可对分离出来的多个菌株进行初筛。cfucfu（colony forming unitcolony forming unit） 通常称为通常称为“可形成菌落单元可形成菌落单元”， 用于表示细菌的数目，用于表示细菌的数目， 它和细菌的个数正相关。它和细菌的个数正相关。7/20/202419植物病理学研究方法第45章烟草过敏反应：烟草过敏反应：在确定

15、分离的细菌有无致病性时采用在确定分离的细菌有无致病性时采用 马铃薯环腐病菌、梨火疫病菌在烟草上马铃薯环腐病菌、梨火疫病菌在烟草上引起过敏性坏死反应引起过敏性坏死反应(HR)过敏性反应过敏性反应7/20/202420植物病理学研究方法第45章三三. .细菌的培养细菌的培养l在获得了细菌的分离物后，通常要进行细菌的培养，在获得了细菌的分离物后，通常要进行细菌的培养，l即将病原菌移植于即将病原菌移植于固体固体或或液体液体培养基上，使其生长，并培养基上，使其生长，并观察记载该菌在该培养基及特定培养条件观察记载该菌在该培养基及特定培养条件( (温度、光照、温度、光照、pHpH等等) )下的培养性状。下的

16、培养性状。l包括其包括其形态、颜色、表面特征、生长速度、色素的分泌、形态、颜色、表面特征、生长速度、色素的分泌、气味、某些特定化合物气味、某些特定化合物的生成等。的生成等。l研究培养性状有助于我们对微生物的鉴别，也可以研究研究培养性状有助于我们对微生物的鉴别，也可以研究培养基成分及培养条件对该微生物生长发育的影响。培养基成分及培养条件对该微生物生长发育的影响。 7/20/202421植物病理学研究方法第45章1. 1.固体培养基上的培养性状观察固体培养基上的培养性状观察 让让某某种种细细菌菌在在平平板板培培养养基基上上形形成成单单个个菌菌落落或或在在斜斜面面培培养养基上形成菌苔。观察、记载以下

17、内容：基上形成菌苔。观察、记载以下内容：菌落（苔）菌落（苔）颜色颜色、形状（形状（特别是特别是边缘边缘的形状的形状）、）、表面表面是否是否凸起凸起或或凹陷、凹陷、表面表面是否是否光亮、光亮、是否有色素分泌是否有色素分泌出来而渗透到培养基中、出来而渗透到培养基中、生长速度生长速度快慢等。快慢等。q同时要记载同时要记载培养基种类培养基种类( (成分及成分及pH)pH)和培养和培养温度、光照温度、光照条件。条件。q一般常用一般常用NANA培养基，在培养基，在25253030培养。培养。7/20/202422植物病理学研究方法第45章在固体培养基中的生长情况：在固体培养基中的生长情况：在平板上形成在平

18、板上形成菌落菌落，在斜面上形成，在斜面上形成菌苔菌苔 在斜面上在斜面上画直线画直线7/20/202423植物病理学研究方法第45章在平板培养基上形成菌落在平板培养基上形成菌落罗氏培罗氏培养基养基7/20/202424植物病理学研究方法第45章细菌菌落与真菌菌落的区别l霉菌的菌落较大，有的霉菌菌落可扩霉菌的菌落较大，有的霉菌菌落可扩展到整个培养皿，有的种则有一定的展到整个培养皿，有的种则有一定的局限性。菌落呈现或紧或松的蛛网状、局限性。菌落呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状绒毛状或棉絮状；菌落与培养基的连；菌落与培养基的连接紧密，不易挑取；菌落正反面的颜接紧密，不易挑取；菌落正反面的颜色和边缘

19、与中心的颜色常不一致。色和边缘与中心的颜色常不一致。l细菌菌落常表现为细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀较透明、易挑取、质地均匀以及菌落以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等。正反面或边缘与中央部位颜色一致等。细菌的菌落特征因种而异。细菌的菌落特征因种而异。7/20/202425植物病理学研究方法第45章放线菌菌落放线菌在固体培养基上形放线菌在固体培养基上形成与细菌不同的菌落特征，成与细菌不同的菌落特征，放线菌菌丝相互交错缠绕放线菌菌丝相互交错缠绕形成形成质地致密的小菌落，质地致密的小菌落，干燥、不透明干燥、不透明、难以挑取，、难以挑取，当大量孢子覆

20、盖于菌落表当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为面时，就形成表面为粉末粉末状或颗粒状状或颗粒状的典型放线菌的典型放线菌菌落，由于基内菌丝和孢菌落，由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的子常有颜色，使得菌落的正反面呈现出不同的色泽。正反面呈现出不同的色泽。 7/20/202426植物病理学研究方法第45章2.2.液体培养基上的培养性状观察液体培养基上的培养性状观察 让某种细菌在液体培养基中生长数让某种细菌在液体培养基中生长数d d后观察、后观察、记载以下内容：记载以下内容：l液体培养基液体培养基表面菌膜表面菌膜颜色、表面特征、颜色、表面特征、l是否生成是否生成沉淀沉淀、产酸产气产酸产气、l是否

21、有是否有色素分泌色素分泌、l生长速度快慢等。生长速度快慢等。 同时要记载培养基种类同时要记载培养基种类( (成分及成分及pH)pH)和培养温和培养温度、光照条件。度、光照条件。7/20/202427植物病理学研究方法第45章细菌在液体培养基中的生长情况细菌在液体培养基中的生长情况 多数呈均匀多数呈均匀混浊混浊状态状态少数链状菌少数链状菌呈呈沉淀沉淀生长生长专性需氧菌则在表面专性需氧菌则在表面生长，常形成生长，常形成菌膜菌膜菌膜菌膜7/20/202428植物病理学研究方法第45章液体培养基上的培养性状观察液体培养基上的培养性状观察产气产气生成沉淀生成沉淀表面菌膜表面菌膜7/20/202429植物

22、病理学研究方法第45章在半固体培养基中的生长情况：在半固体培养基中的生长情况： 常用于观察细菌动力常用于观察细菌动力 有鞭毛的细菌可沿有鞭毛的细菌可沿穿刺线穿刺线呈呈羽毛状羽毛状或或云雾状云雾状混浊生长混浊生长无鞭毛细菌则只能沿无鞭毛细菌则只能沿穿刺线穿刺线呈明显的呈明显的线状线状生长生长7/20/202430植物病理学研究方法第45章四四. .细菌菌种的保存细菌菌种的保存（一）菌种保存的目标（一）菌种保存的目标 细菌菌种保存的目标、方法和真菌大同小异。细菌菌种保存的目标、方法和真菌大同小异。 l菌种保存的目标是：菌种保存的目标是：不会因贮藏条件不妥而不会因贮藏条件不妥而死亡死亡，不因保存方法

23、不当而发生不因保存方法不当而发生变异变异，不被其他生物不被其他生物污染污染。 为此目标，为此目标，l通常采用通常采用抑制病原物代谢活动抑制病原物代谢活动的方式以延长其存活并的方式以延长其存活并减少变异，如放置于减少变异，如放置于低温、干燥、缺氧低温、干燥、缺氧条件下。条件下。l或将其培养基或将其培养基养分降低养分降低到原来的到原来的1/21/2。7/20/202431植物病理学研究方法第45章（二）常用保藏方法（二）常用保藏方法 1.1.室温保存室温保存 许多细菌的斜面培养，只要放在温度变化不大的室温许多细菌的斜面培养，只要放在温度变化不大的室温即可。室温保存缺点是培养基易干燥，要及时移植。即

24、可。室温保存缺点是培养基易干燥，要及时移植。2.2.低温保存低温保存 将菌种棉塞部分用油纸包好，置将菌种棉塞部分用油纸包好，置2 288的冰箱中保的冰箱中保藏。是最常用的保存菌种的方法。为防止培养基干燥，每藏。是最常用的保存菌种的方法。为防止培养基干燥，每3-43-4周即要移植一次。而黄单胞菌及周即要移植一次。而黄单胞菌及G+ G+ 各属各属1-21-2周即应移周即应移殖。黄单胞菌产酸多，培养基中可加入殖。黄单胞菌产酸多，培养基中可加入2 2碳酸钙粉以降碳酸钙粉以降低低pHpH或用或用YDCYDC培养基保存。培养基保存。 如放在如放在2020或或8080冰箱中及液氮罐中，则存活期冰箱中及液氮罐

25、中，则存活期可以更长。可以更长。 7/20/202432植物病理学研究方法第45章常用保藏方法常用保藏方法3.3.石蜡油保存石蜡油保存 利用灭菌的矿物油利用灭菌的矿物油( (液体石蜡液体石蜡) )灌在斜面菌种的表面，其高度灌在斜面菌种的表面，其高度超过斜面顶部超过斜面顶部1cm1cm，以隔绝菌种与空气接触。无芽孢的细菌也可保，以隔绝菌种与空气接触。无芽孢的细菌也可保存一年左右。存一年左右。4.4.灭菌蒸馏水悬浮保存灭菌蒸馏水悬浮保存 很多细菌可采用蒸馏水保存法，即把细菌悬液放在灭菌蒸馏很多细菌可采用蒸馏水保存法，即把细菌悬液放在灭菌蒸馏水小管中，加橡皮塞密封后置室温下，是较好的保存方法。水小管

26、中，加橡皮塞密封后置室温下，是较好的保存方法。5.5.冷冻真空干燥保存法冷冻真空干燥保存法( (冻干保存法冻干保存法) ) 绝大多数的细菌均可采用冻干法长期保存。绝大多数的细菌均可采用冻干法长期保存。 冷冻干燥保藏法的步骤包括两部分，即首先在极低温度下冷冻干燥保藏法的步骤包括两部分，即首先在极低温度下( (7070左右左右) )快速冷冻，然后在极低温度下真空干燥。这样可使快速冷冻，然后在极低温度下真空干燥。这样可使细胞的结构与成分保持原来的状态。细胞的结构与成分保持原来的状态。 7/20/202433植物病理学研究方法第45章细菌的计数细菌的计数l血球计数板法血球计数板法l混浊度计数法混浊度计

27、数法分光光度计分光光度计麦法兰云度计麦法兰云度计l稀释平板法稀释平板法l制片显微计数法制片显微计数法7/20/202434植物病理学研究方法第45章细菌的计数细菌的计数血球计数板法血球计数板法使用方法同真菌孢子计数法一样。使用方法同真菌孢子计数法一样。适用范围：适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不太适不太适用于细菌等个体较小的细胞。用于细菌等个体较小的细胞。因为因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。针对这些问题，可以采用针对这些问题，

28、可以采用高倍镜观察，分层高倍镜观察，分层观察观察的方法。的方法。7/20/202435植物病理学研究方法第45章混浊度计数法混浊度计数法分光光度计：分光光度计： 由于细菌悬液浓度越大则消光度越大，由于细菌悬液浓度越大则消光度越大， 因此可制定细菌悬液浓度与消光度关系的标准曲线，用分光因此可制定细菌悬液浓度与消光度关系的标准曲线，用分光光度计测定细菌数目。光度计测定细菌数目。麦法兰云度计：麦法兰云度计： 将将1 1BaclBacl2 2和和1 1H H2 2SOSO4 4按不同比例混合，按不同比例混合， 形成数量不同形成数量不同的的BaSOBaSO4 4细微颗粒悬浮在液体中，细微颗粒悬浮在液体中

29、， 其混浊度和细菌的不同浓度相对应。其混浊度和细菌的不同浓度相对应。q这两种方法都可以测定细菌的数量。这两种方法都可以测定细菌的数量。q但，植物组织中的色素也会影响消光度，所以测定植物组织但，植物组织中的色素也会影响消光度，所以测定植物组织中的细菌数量时要注意数据校正。中的细菌数量时要注意数据校正。 7/20/202436植物病理学研究方法第45章稀释平板法稀释平板法稀释平板法的大体做法为：稀释平板法的大体做法为：l将将菌悬液菌悬液进行适当进行适当稀释稀释（使其在平板培养基上可以生长出（使其在平板培养基上可以生长出10-3010-30个的菌落为适），个的菌落为适），l置灭菌培养皿内和约置灭菌培

30、养皿内和约5050的的培养基均匀混合培养基均匀混合，凝成，凝成平板平板。l在在2525培养数培养数d d，待平板上，待平板上长出菌落长出菌落后，后，l根据根据目标菌菌落特征目标菌菌落特征计算出平均每个平板上的计算出平均每个平板上的菌落数菌落数，再，再乘以总的稀释倍数乘以总的稀释倍数，l即可得出菌悬液中的细菌数。即可得出菌悬液中的细菌数。7/20/202437植物病理学研究方法第45章稀释平板法稀释平板法7/20/202438植物病理学研究方法第45章制片显微计数法制片显微计数法 做法：做法：l将菌悬液在载玻片的将菌悬液在载玻片的画定的小区域画定的小区域内涂抹均匀，不让内涂抹均匀，不让细菌菌体重

31、叠，过酒精灯火焰固定菌体，并进行染色。细菌菌体重叠，过酒精灯火焰固定菌体，并进行染色。l在显微镜下观察在显微镜下观察3030个视野，查得个视野，查得每视野内细菌平均数每视野内细菌平均数。l根据画定的小区域面积和显微镜视野面积的根据画定的小区域面积和显微镜视野面积的比值比值计算，计算，得出小区域内细菌数目，即可得出菌悬液中的细菌数。得出小区域内细菌数目，即可得出菌悬液中的细菌数。7/20/202439植物病理学研究方法第45章第二节第二节 病原细菌的接种病原细菌的接种l接种体的准备接种体的准备l常用接种方法常用接种方法l接种后的观察记载接种后的观察记载7/20/202440植物病理学研究方法第4

32、5章接种体的准备接种体的准备 1.1.利用保存的病组织利用保存的病组织l对于接种仅为了引起寄主植物发病，而不为了精确对于接种仅为了引起寄主植物发病，而不为了精确测定致病性时可以采用此法。测定致病性时可以采用此法。l黄瓜细菌性角斑病干燥病叶保存于室内越冬后，黄瓜细菌性角斑病干燥病叶保存于室内越冬后， 次年春季将病叶捣碎浸泡于次年春季将病叶捣碎浸泡于10-3010-30倍重量的水中倍重量的水中1h1h，滤出病叶残体，即可用于接种。，滤出病叶残体，即可用于接种。l水稻白叶枯病叶切成小段，加入约水稻白叶枯病叶切成小段，加入约1010倍重量的水，倍重量的水，浸泡浸泡1-2h1-2h，纱布过滤后得到菌悬液

33、，即可用于接种。，纱布过滤后得到菌悬液，即可用于接种。7/20/202441植物病理学研究方法第45章接种体的准备接种体的准备2. 2. 利用人工培养基培养利用人工培养基培养l采用斜面或平板培养基采用斜面或平板培养基：NANA等培养基。等培养基。l采用适当的培养时间采用适当的培养时间 通常培养时间在通常培养时间在48h48h较好。较好。 时间过短，细菌菌体数量太少，时间过短，细菌菌体数量太少， 时间过长则细菌致病力减退。时间过长则细菌致病力减退。7/20/202442植物病理学研究方法第45章接种体的准备接种体的准备 菌悬液的浓度：菌悬液的浓度：l通常菌悬液的浓度为通常菌悬液的浓度为11011

34、07-87-8cfu/mLcfu/mL。 简易判断此浓度的方法简易判断此浓度的方法： 在盛有菌悬液的试管后面放一张报纸，可见到明显字块，在盛有菌悬液的试管后面放一张报纸，可见到明显字块，可辨认出模糊字形可辨认出模糊字形时，大体上为此浓度。时，大体上为此浓度。l浓度小，细菌数量太少，细菌接种不易成功。浓度小，细菌数量太少，细菌接种不易成功。l浓度过高，细菌数量太多，易产生浓度过高，细菌数量太多，易产生过敏反应过敏反应，使非寄主植，使非寄主植物也可出现物也可出现“症状症状”；或发病过重而不能代表田间实际情；或发病过重而不能代表田间实际情况。况。7/20/202443植物病理学研究方法第45章接种方

35、法接种方法1. 1. 利用菌悬液：利用菌悬液：针刺针刺法（单针、多针、连续针刺）；法（单针、多针、连续针刺）；喷雾喷雾法（常规喷雾、高压喷雾：压强可为法（常规喷雾、高压喷雾：压强可为0.10.10.2MPa0.2MPa）；）；摩擦摩擦接种（用纱布蘸菌悬液摩擦接种部位）法；接种（用纱布蘸菌悬液摩擦接种部位）法；剪叶剪叶接种法；接种法；注射注射接种（常用于茎部接种）法；接种（常用于茎部接种）法；沾根沾根接种法；接种法；灌注土壤灌注土壤法；法；灌心叶灌心叶法。法。7/20/202444植物病理学研究方法第45章接种方法接种方法2. 2. 直接利用直接利用种子、无性繁殖材料种子、无性繁殖材料或或土壤土

36、壤中中自然带有的自然带有的病原体病原体，散布于田间，或直，散布于田间，或直接散布于接散布于播种床播种床等处。等处。7/20/202445植物病理学研究方法第45章接种的注意事项接种的注意事项掌握适当的接种量，掌握适当的接种量，过少不易发病，过少不易发病，过多不代表田间自然情况。过多不代表田间自然情况。2. 2. 为保证接种成功，需注意以下几点：为保证接种成功，需注意以下几点： 寄主植物要寄主植物要感病感病（品种、生育期、接种部位）。（品种、生育期、接种部位）。 接种后经常需要接种后经常需要保湿保湿151524h24h或更多时间。或更多时间。 创造适宜发病的创造适宜发病的条件条件：温度、湿度、光

37、照、：温度、湿度、光照、pHpH、养分供应。、养分供应。 需要大量反复接种时可采取设置需要大量反复接种时可采取设置“诱病行诱病行”办法。办法。7/20/202446植物病理学研究方法第45章接种后的观察记载接种后的观察记载接种后的观察记载接种后的观察记载项目项目：l植物生长及发病植物生长及发病条件条件；l发病发病过程过程；l病害的病害的潜育期潜育期、显症期、逐日显症率、累积显症率；、显症期、逐日显症率、累积显症率；l病害的典型病害的典型症状症状、非典型症状；、非典型症状；l危害危害程度。程度。7/20/202447植物病理学研究方法第45章第三节第三节 病原细菌的鉴定病原细菌的鉴定( (一）病

38、原细菌属的鉴定一）病原细菌属的鉴定l由于细菌的鉴定工作比较困难，在植保专业本科阶由于细菌的鉴定工作比较困难，在植保专业本科阶段主要学习常见属的鉴定。段主要学习常见属的鉴定。l鉴定主要依据鉴定主要依据革兰氏染色革兰氏染色以及在多种以及在多种选择性培养基选择性培养基上的生长情况来进行。上的生长情况来进行。l之所以不采用细菌的鞭毛染色进行分属，是因为细之所以不采用细菌的鞭毛染色进行分属，是因为细菌的鞭毛染色较困难，不易成功。菌的鞭毛染色较困难，不易成功。 7/20/202448植物病理学研究方法第45章病原细菌属的鉴定检索表病原细菌属的鉴定检索表 待测细菌待测细菌 革兰氏染色革兰氏染色lGG+ +

39、l 菌体短杆状菌体短杆状 CurtrbacteriumCurtrbacterium（短杆菌属）（短杆菌属） 菌体短杆状、棒状，可见到菌体短杆状、棒状，可见到“v”“v”或或“L”“L”形，形，ClavibacterClavibacter lGG- -（E E、X X、P P、A A）u 在在YDCYDC培养基上产生黄色菌落（阳性）（培养基上产生黄色菌落（阳性）（E E、X X） 在在MSMS或或CVPCVP培养基上生长（阳性）培养基上生长（阳性）ErwiniaErwinia 在在MSMS或或CVPCVP培养基上生长（阴性）培养基上生长（阴性）XanthomonasXanthomonasu 在在

40、YDCYDC培养基上产生黄色菌落（阴性培养基上产生黄色菌落（阴性）（）（E E、P P、A A） 在在KBKB培养基上产生荧光色素（阳性）培养基上产生荧光色素（阳性）PseudomonasPseudomonas 在在KBKB培养基上产生荧光色素（阴性）（培养基上产生荧光色素（阴性）（E E、P P、A A）p 在在MSMS或或CVPCVP培养基上生长（阳性）培养基上生长（阳性）ErwiniaErwiniap 在在MSMS或或CVPCVP培养基上生长（阴性）培养基上生长（阴性）（P P、A A） 在在D1D1培养基上生长（阳性）培养基上生长（阳性）AgrobacteriumAgrobacteri

41、um 在在D1D1培养基上生长（阴性培养基上生长（阴性）PseudomonasPseudomonas 7/20/202449植物病理学研究方法第45章伯杰氏系统细菌学手册伯杰氏系统细菌学手册l伯杰氏系统细菌学手册伯杰氏系统细菌学手册Bergeysmanualofsystematicbacteriology(secondedition,2004)l原书名为原书名为伯杰氏鉴定细菌学手册伯杰氏鉴定细菌学手册, , （BergeysManualofDeterminativeBacteriology），）， 1923 1923年第年第1 1版，后版，后相继出版了第相继出版了第2 2至第至第8 8版，每个

42、版本都反映了当时细菌学发展的新成就。版，每个版本都反映了当时细菌学发展的新成就。l第第9 9版由于内容增加，范围扩大，同时指出各类细菌间的关系，所以改名为版由于内容增加，范围扩大，同时指出各类细菌间的关系，所以改名为伯杰氏系统细菌学手册伯杰氏系统细菌学手册l第一版第一版 1984 1984年问世，至年问世，至19891989年出齐，共年出齐，共4 4卷。卷。l第二版第二版 由由George GarrityGeorge Garrity主编分为主编分为5 5卷，从卷，从20002000年起陆续出版。这一版纳入年起陆续出版。这一版纳入了研究核糖体了研究核糖体RNARNA测序所产生的系统发育分类系统。

43、测序所产生的系统发育分类系统。 7/20/202450植物病理学研究方法第45章病原细菌种的鉴定病原细菌种的鉴定（二）病原细菌种的鉴定（二）病原细菌种的鉴定l病原细菌病原细菌“种种”的鉴定工作比属的鉴定的鉴定工作比属的鉴定更为困难。更为困难。l鉴定主要依据细菌的形态、大小、染色鉴定主要依据细菌的形态、大小、染色反应、培养性状、生理生化性状、血清反应、培养性状、生理生化性状、血清学反应等。学反应等。7/20/202453植物病理学研究方法第45章1. 1.形态和染色形态和染色革兰氏染色阳性革兰氏染色阳性革兰氏染色阴性革兰氏染色阴性革兰氏染色阴性革兰氏染色阴性电镜下的细菌照片电镜下的细菌照片电镜下

44、的细菌照片电镜下的细菌照片7/20/202454植物病理学研究方法第45章EMBEMB平板（伊红美蓝琼脂培养基）平板（伊红美蓝琼脂培养基） 组成：无糖培养基乳糖伊红美蓝组成：无糖培养基乳糖伊红美蓝 底物底物 指示剂、抑菌剂指示剂、抑菌剂 原理：原理： 细菌细菌 乳糖乳糖 产酸：伊红美蓝产酸：伊红美蓝 紫黑紫黑/ /紫红紫红 结果：结果： 分解乳糖细菌分解乳糖细菌 菌落变黑，有金属光泽菌落变黑，有金属光泽 不分解乳糖细菌不分解乳糖细菌 菌落无色、半透明（粉色）菌落无色、半透明（粉色）分解EMB agar2.2.培养特性培养特性（特殊培养基）（特殊培养基）7/20/202455植物病理学研究方法第

45、45章色素色素有助于鉴别细菌，有两类：有助于鉴别细菌，有两类：水溶性色素、水溶性色素、 脂溶性色素脂溶性色素红色红色柠檬色柠檬色白色白色7/20/202456植物病理学研究方法第45章3.3.细菌的细菌的生理生化生理生化特性特性由于不同的由于不同的细菌可能具有不同的酶，代可能具有不同的酶，代谢途径和代谢产物可能也有不同，生理生化谢途径和代谢产物可能也有不同，生理生化反应是反应是细菌分类鉴定的分类鉴定的重要指标重要指标。7/20/202457植物病理学研究方法第45章carbohydrate fermentation(糖类发酵) 对照对照产酸产酸产酸产酸,产气产气7/20/202458植物病理学

46、研究方法第45章VPVP test (test (伏普试验伏普试验) ) VPVP试验试验 阳性（红色）阴性（不变）阳性（红色）阴性（不变）7/20/202459植物病理学研究方法第45章吲哚吲哚(indol)(indol)试验试验：吲哚试验吲哚试验阳性（液面红）阴性（阳性（液面红）阴性（液面液面黄）黄）7/20/202460植物病理学研究方法第45章正反应正反应( (黑色黑色) )负反应负反应( (黄色黄色) )Hydrogen sulfide test (Hydrogen sulfide test (硫化氢试验硫化氢试验) )7/20/202461植物病理学研究方法第45章Urease t

47、est (脲酶试验)尿素酶试验尿素酶试验阴性（黄）阳性（红）阴性（黄）阳性（红）7/20/202462植物病理学研究方法第45章Catalast test (触酶试验)正反应产气泡正反应产气泡 负反应不产气泡负反应不产气泡 7/20/202463植物病理学研究方法第45章Oxidast test (氧化酶试验)正反应蓝色正反应蓝色负反应不变色负反应不变色7/20/202464植物病理学研究方法第45章赖氨酸脱羧酶、丙二酸盐赖氨酸脱羧酶、丙二酸盐试验赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试验对照对照 阳性（紫）阳性（紫） 阴性（黄）阴性（黄）丙二酸盐试验丙二酸盐试验阳性（兰）阳性（兰） 阴性（不变）阴性（

48、不变）7/20/202465植物病理学研究方法第45章4.微生物的快速鉴定和自动化分析微量多项试验鉴定系统微量多项试验鉴定系统（1）API20系统：系统：法国法国Bio-梅里埃公司生产，有梅里埃公司生产，有很多很多种不同的生化反应，可鉴定种不同的生化反应，可鉴定700多种细菌，多种细菌，分不同系列，如分不同系列，如20A厌氧菌，厌氧菌，20E肠道菌。肠道菌。（2）Biolog系统：系统：美国安普公司生产，可自动美国安普公司生产，可自动化鉴定，可鉴定化鉴定，可鉴定1140种细菌。种细菌。（3）其他：）其他：众多。众多。（4）国产：国产：众多。众多。7/20/202466植物病理学研究方法第45章

49、1 1、 API API 细菌数值鉴定系统细菌数值鉴定系统菌种菌种基本培养基基本培养基（液体）（液体）菌悬液菌悬液检测、编码、查表、鉴定检测、编码、查表、鉴定Analytica Products INCAnalytica Products INC的简的简称。目前中国各级疾病预防控称。目前中国各级疾病预防控制机构在细菌学检验中比较多制机构在细菌学检验中比较多地应用了此项技术地应用了此项技术 每个管中含有每个管中含有不同的底物，不同的底物，菌悬液加入培菌悬液加入培养养后后将发生生将发生生理生化变化。理生化变化。7/20/202467植物病理学研究方法第45章2 2、BiologBiolog全自动或

50、手动细菌鉴定系统全自动或手动细菌鉴定系统 在在9696孔的细菌培养板上检测微生物对孔的细菌培养板上检测微生物对不同发酵性碳源利用情况进行的分类鉴定。不同发酵性碳源利用情况进行的分类鉴定。自动化、快速自动化、快速每个孔中含有每个孔中含有不同的底物不同的底物菌悬液或菌悬液或无菌水无菌水7/20/202468植物病理学研究方法第45章全自动微生物鉴定仪-Biolog7/20/202469植物病理学研究方法第45章5. 16S r RNA 5. 16S r RNA 在细菌鉴定中的应用在细菌鉴定中的应用16S rRNA16S rRNA被普遍公认为是一把好的谱系分析的分子计时器被普遍公认为是一把好的谱系分

51、析的分子计时器1 1）核糖体是细菌唯一的细胞器）核糖体是细菌唯一的细胞器, , 是蛋白质合成的场所。是蛋白质合成的场所。普遍存在普遍存在于各种细菌细胞内。于各种细菌细胞内。 2 2）在）在16SrRNA16SrRNA分子中，既含有分子中，既含有高度保守高度保守的序列区域，又有的序列区域，又有中度保守中度保守和和高度变化高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究；亲缘关系的研究；3 3）16SrRNA16SrRNA分子量大小适中分子量大小适中，便于序列分析；，便于序列分析；4 4）rRNArRNA在细胞中含量大在细胞中含量大

52、( (约占细胞中约占细胞中RNARNA的的90%)90%)，也，也易于提取易于提取。7/20/202470植物病理学研究方法第45章16Sr16SrDNA 在细菌鉴定中的作用在细菌鉴定中的作用l提取细菌总提取细菌总 DNA DNA PCR PCR 扩增扩增 16S rDNA 16S rDNA lPCR PCR 产物纯化序列分析产物纯化序列分析 物种确认与基因比较物种确认与基因比较 （ GeneBank & gene software GeneBank & gene software ）l一般认为，一般认为，16S rDNA16S rDNA序列同源性小于序列同源性小于98%98%，可以认为属于不

53、，可以认为属于不同的种，同源性小于同的种，同源性小于93%-95%93%-95%，可以认为属于不同的属。，可以认为属于不同的属。7/20/202471植物病理学研究方法第45章（三）病原细菌研究的重要参考书（三）病原细菌研究的重要参考书1.1.袁美丽等著袁美丽等著：吉林省栽培植物细菌病害志，吉林科学：吉林省栽培植物细菌病害志，吉林科学技术出版社，技术出版社，19921992 本书中不仅全面描述了吉林省本书中不仅全面描述了吉林省125125种植物上的细菌种植物上的细菌性病害和细菌性病害的诊断方法，而且详尽介绍了性病害和细菌性病害的诊断方法，而且详尽介绍了YDCYDC、 MSMS、CVPCVP 、

54、KBKB、D1D1等培养基的配方，病原细菌等培养基的配方，病原细菌“种种”的鉴定中应用的各种测定方法。的鉴定中应用的各种测定方法。2.2.方中达著方中达著：植病研究方法（第三版）：植病研究方法（第三版）, ,中国农业出版社，中国农业出版社，19981998 3.3.王金生著王金生著: : 植物病原细菌学，中国农业出版社植物病原细菌学，中国农业出版社,2000 ,2000 7/20/202472植物病理学研究方法第45章l请批评指正！7/20/202473植物病理学研究方法第45章植物病理学植物病理学基础研究方法基础研究方法 第五章第五章 杀菌剂筛选的杀菌剂筛选的 生物测定技术生物测定技术7/2

55、0/202474植物病理学研究方法第45章第五章第五章 杀菌剂筛选的生物测定技术杀菌剂筛选的生物测定技术第一节第一节 杀菌剂的室内毒力测定杀菌剂的室内毒力测定第二节第二节 杀菌剂的田间药效测定杀菌剂的田间药效测定7/20/202475植物病理学研究方法第45章第一节第一节 杀菌剂的杀菌剂的 室内毒力测定室内毒力测定7/20/202476植物病理学研究方法第45章第一节第一节 杀菌剂的室内毒力测定杀菌剂的室内毒力测定一一. .杀菌剂相对毒力的室内测定杀菌剂相对毒力的室内测定 从定性角度比较不同药剂的相对毒力大小；从定性角度比较不同药剂的相对毒力大小；二二. .化学农药毒力回归线的建立及化学农药毒

56、力回归线的建立及ECEC5050的推算的推算 从定量角度研究农药剂量与有害生物死亡率从定量角度研究农药剂量与有害生物死亡率间的关系；间的关系；三三. .杀菌剂混用联合毒力的测定及配方优选杀菌剂混用联合毒力的测定及配方优选 研究不同杀菌剂混用后的联合毒力大小。研究不同杀菌剂混用后的联合毒力大小。四四. .病原菌抗药性测定的原理和方法病原菌抗药性测定的原理和方法7/20/202477植物病理学研究方法第45章一一. .杀菌剂相对毒力的室内测定杀菌剂相对毒力的室内测定一一. .杀菌剂相对毒力的室内测定杀菌剂相对毒力的室内测定杀菌剂室内毒力测定最常用的方法杀菌剂室内毒力测定最常用的方法l孢子萌发法孢子

57、萌发法l抑菌圈法抑菌圈法l生长速率法生长速率法这三种方法比较的是不同药剂的这三种方法比较的是不同药剂的相对毒力相对毒力大小。大小。 含毒介质培养法含毒介质培养法7/20/202478植物病理学研究方法第45章（一）孢子萌发法（一）孢子萌发法孢子萌发法孢子萌发法是杀菌剂毒力测定常用的方法。是杀菌剂毒力测定常用的方法。l这方法是通过不同药剂或同一药剂不同这方法是通过不同药剂或同一药剂不同浓度对真菌孢子萌发或其它病原物个体浓度对真菌孢子萌发或其它病原物个体( (如菌核如菌核) )萌发的萌发的抑制抑制情况来比较药效的。情况来比较药效的。l此法适用于此法适用于能产生孢子真菌能产生孢子真菌的毒力测定。的毒

58、力测定。7/20/202479植物病理学研究方法第45章孢子萌发法孢子萌发法步骤：步骤：l不同药剂不同药剂稀释液的配制（通常稀释稀释液的配制（通常稀释10001000倍左右）倍左右）l用各药剂稀释液进行孢子萌发试验（设置清水对照）用各药剂稀释液进行孢子萌发试验（设置清水对照）l置置25 25 左右，左右， 让真菌孢子萌发让真菌孢子萌发 l测测孢子萌发率孢子萌发率l计算计算校正死亡率校正死亡率l比较不同药剂药效（比较不同药剂药效（校正死亡率高者药效好校正死亡率高者药效好）校正萌发率校正萌发率= = 处理萌发率处理萌发率 / / 对照萌发率对照萌发率例：例：8% / 80% = 10%8% / 8

59、0% = 10%校正死亡率校正死亡率= 1 - = 1 - 校正萌发率校正萌发率例：例：1 - 10% = 90%1 - 10% = 90%7/20/202480植物病理学研究方法第45章（二）含毒介质培养法（二）含毒介质培养法1.1.抑菌圈法（水平扩散法）抑菌圈法（水平扩散法）l抑菌圈法的基本做法是将抑菌圈法的基本做法是将病原菌病原菌（真菌、细菌真菌、细菌均可）均匀均可）均匀混入混入45455050培养基培养基中中制成平板制成平板后，后，再将经灭菌并沾有再将经灭菌并沾有不同药剂的滤纸片不同药剂的滤纸片分别置于分别置于培养基上，经一段时间培养后，比较各滤纸片培养基上，经一段时间培养后，比较各滤

60、纸片上上药剂渗透药剂渗透到培养基中抑制病菌生长而形成到培养基中抑制病菌生长而形成抑抑菌圈菌圈大小，抑菌圈直径大者表示药剂毒力大。大小，抑菌圈直径大者表示药剂毒力大。7/20/202481植物病理学研究方法第45章抑菌圈法抑菌圈法l作法：作法：l制制混菌平板混菌平板l上置上置蘸药滤纸片蘸药滤纸片l置置25 25 培养培养l检测检测抑菌圈抑菌圈大小大小l不同药剂对比不同药剂对比蘸药滤纸片蘸药滤纸片抑菌圈抑菌圈7/20/202482植物病理学研究方法第45章抑菌圈法抑菌圈法( (培养后，从正面观察培养后，从正面观察) )蘸药滤纸片蘸药滤纸片7/20/202483植物病理学研究方法第45章抑菌圈法抑菌

61、圈法( (培养后，用直尺测量抑菌圈直径培养后，用直尺测量抑菌圈直径) )7/20/202484植物病理学研究方法第45章7/20/202485植物病理学研究方法第45章7/20/202486植物病理学研究方法第45章抑菌圈分析仪抑菌圈分析仪最新一代抑菌圈自动测量分析仪最新一代抑菌圈自动测量分析仪-ZY-300-ZY-300型型北京先驱威锋技术开发公司，北京先驱威锋技术开发公司，自从自从19921992年开发出第一代年开发出第一代ZY-300AZY-300A型抑菌圈测量分析仪后，型抑菌圈测量分析仪后，相继开发出相继开发出、 、型产品。型产品。1.Windows98/2000/XP1.Window

62、s98/2000/XP系统均可使用。系统均可使用。2.2.仪器直接和微机的仪器直接和微机的USBUSB接口连接。接口连接。3.3.大平板扫描法，一次可完成大平板扫描法，一次可完成六个碟子六个碟子的扫描测量。的扫描测量。4.4.智能识别图像。智能识别图像。价格价格:48,600 元元7/20/202487植物病理学研究方法第45章（二）含毒介质培养法（二）含毒介质培养法2.2.生长速率法生长速率法l生长速率法适用于不长孢子而菌丝生长较快的真生长速率法适用于不长孢子而菌丝生长较快的真菌。通常是将不同菌。通常是将不同药剂等量加于药剂等量加于不同平板中，再不同平板中，再将病原菌置于各平板中央，适温下培

63、养。通过将病原菌置于各平板中央，适温下培养。通过菌菌落生长速度落生长速度来衡量药剂的毒力大小，菌落生长慢来衡量药剂的毒力大小，菌落生长慢则表示药剂毒力大。则表示药剂毒力大。l作法：作法：制备制备混药平板混药平板上置目标上置目标菌片菌片培养培养检测生长速率检测生长速率和其他药剂对比和其他药剂对比7/20/202488植物病理学研究方法第45章生长速率法生长速率法( (培养前，培养后培养前，培养后) )病原菌片病原菌片病原菌片病原菌片混混A A药平板药平板混混B B药平板药平板病原菌菌落病原菌菌落病原菌菌落病原菌菌落7/20/202489植物病理学研究方法第45章二二. . 毒力回归线的建立及毒力

64、回归线的建立及ECEC5050的推算的推算（一）农药剂量与有害生物死亡率间的关系（一）农药剂量与有害生物死亡率间的关系（二）毒力回归线的建立及（二）毒力回归线的建立及 EC EC5050 的推算的推算7/20/202490植物病理学研究方法第45章（一）农药剂量与有害生物死亡率（一）农药剂量与有害生物死亡率间的关系间的关系1. “1. “剂量剂量- -死亡率死亡率”曲线：先快后慢的曲线：先快后慢的“S”“S”型曲线型曲线l研究表明：农药剂量与有害生物死亡率间的关系研究表明：农药剂量与有害生物死亡率间的关系不是简单的直线关系，而表现为不是简单的直线关系，而表现为先快后慢的先快后慢的“S”“S”型

65、曲线型曲线关系。关系。l原因在于：有害生物个体对药剂的忍受力不完全原因在于：有害生物个体对药剂的忍受力不完全相同，有害生物群体中相同，有害生物群体中忍受力的次数分布呈二项忍受力的次数分布呈二项式展开式展开。曲线表现为偏向一边的，而。曲线表现为偏向一边的，而非对称的非对称的“正态分布正态分布”。l这种先快后慢的这种先快后慢的“S”“S”型曲线关系，用数学方法处型曲线关系，用数学方法处理很不方便。理很不方便。忍受力忍受力忍受力忍受力死亡率死亡率剂量剂量剂量剂量忍受力忍受力忍受力忍受力7/20/202491植物病理学研究方法第45章（一）农药剂量与有害生物死亡（一）农药剂量与有害生物死亡率间的关系率

66、间的关系2. “2. “剂量对数剂量对数- -死亡率死亡率”曲线：曲线：l进一步研究表明：进一步研究表明：l有害生物个体对有害生物个体对药剂剂量对数药剂剂量对数的的忍受力忍受力的次数分布的次数分布符合符合“正态分布正态分布”。l从数学角度看，农药剂量对数与有害生物死亡率间从数学角度看，农药剂量对数与有害生物死亡率间的关系，表现为：的关系，表现为：以中心点对称的以中心点对称的“S”“S”型曲线关型曲线关系。系。l这种曲线关系用数学方法处理仍不如这种曲线关系用数学方法处理仍不如直线直线方便。方便。死亡率死亡率剂量剂量对数对数剂量剂量对数对数忍受力忍受力忍受力忍受力7/20/202492植物病理学研

67、究方法第45章（一）农药剂量与有害生物死亡（一）农药剂量与有害生物死亡率间的关系率间的关系3. “3. “剂量对数剂量对数- -机率值机率值”直线直线（log dosage -probit linelog dosage -probit line）：毒力回归线）：毒力回归线l为从数学角度方便研究为从数学角度方便研究 农药剂量对数与有害生物死亡率间的关系，人们希农药剂量对数与有害生物死亡率间的关系，人们希望将有害望将有害生物死亡率生物死亡率转换成一个转换成一个 “ “中间变量中间变量”，这个中间变量可以和药剂的剂量对数成正比，这种这个中间变量可以和药剂的剂量对数成正比，这种 “剂量对数剂量对数-

68、-中间变量中间变量” ” 关系曲线是直线。关系曲线是直线。7/20/202493植物病理学研究方法第45章（一）农药剂量与有害生物死亡（一）农药剂量与有害生物死亡率间的关系率间的关系19331933年，年，GadunumGadunum提出：以有害生物的提出：以有害生物的个体数为纵坐标，以对药剂的耐受力个体数为纵坐标，以对药剂的耐受力阈值为阈值为横坐标，正态曲线下面积横坐标，正态曲线下面积“累累积概率密度积概率密度” ” 就是有害生物死亡率。就是有害生物死亡率。 则标准正态分布曲线下的则标准正态分布曲线下的“常态等常态等差差”可以作为和药剂的剂量对数成正比的可以作为和药剂的剂量对数成正比的中中间

69、变量。间变量。( (实质是死亡群体和存活群体之间对药实质是死亡群体和存活群体之间对药剂剂量耐受力的阈值剂剂量耐受力的阈值) )。有害生物死亡率有害生物死亡率常态等差常态等差右图：右图：纵坐标：有害生物的个体数；纵坐标：有害生物的个体数；横坐标：对药剂的耐受力横坐标：对药剂的耐受力阈值阈值统计学中的常态等差统计学中的常态等差（normalequivalentdeviation，N.E.D.N.E.D.），），x=x=（x- xx- x）/s/s ( (即正态曲线下阴影部即正态曲线下阴影部分对应的分对应的横坐标横坐标。7/20/202494植物病理学研究方法第45章“常态等差常态等差”值可由值可由

70、 “ “标准正态分布累标准正态分布累积概率密度表积概率密度表”直接查得直接查得l“常态等差常态等差”值与值与药剂的剂量对数药剂的剂量对数值成正比，值成正比，l而且而且 可以利用可以利用“标准正态分布累积概率密度表标准正态分布累积概率密度表”直接查得与直接查得与“有害生物死亡率有害生物死亡率= =累积概率累积概率密度密度” ” 对应的对应的“常态等差常态等差”值。值。7/20/202495植物病理学研究方法第45章“常态等差常态等差”应用时不够方便应用时不够方便lGadunumGadunum提出的方法得到了普遍接受，提出的方法得到了普遍接受，l但发现但发现“常态等差常态等差”之值在有害生物死亡率

71、之值在有害生物死亡率小于小于50%50%时为负数时为负数，l应用时仍有不够方便之处。应用时仍有不够方便之处。7/20/202496植物病理学研究方法第45章（一）农药剂量与有害生物死亡（一）农药剂量与有害生物死亡率间的关系率间的关系l19341934年，年，BlissBliss提出提出“机率值机率值”概念，概念， 即在即在“常态等差常态等差”之值上加上之值上加上5 5，称为，称为 机率值机率值。l机率值与药剂的剂量对数值仍成正比，机率值与药剂的剂量对数值仍成正比，且由于在正态曲线下且由于在正态曲线下44区间面积已区间面积已达达99.9936%99.9936%，机率值永远为正数机率值永远为正数，

72、使用，使用方便，故得到普遍应用。方便，故得到普遍应用。l人们根据人们根据“标准正态分布累积概率密度标准正态分布累积概率密度表表”制作出制作出“机率值与死亡百分率换算机率值与死亡百分率换算表表”，更便于应用。，更便于应用。这种方法为全世界普遍使用的这种方法为全世界普遍使用的“生物测定技术生物测定技术”的标准方法。的标准方法。标准正态曲线标准正态曲线: :=0=0=1=17/20/202497植物病理学研究方法第45章（一）农药剂量与有害生物死亡（一）农药剂量与有害生物死亡率间的关系率间的关系l一般称一般称“剂量对数剂量对数- -机率值机率值”直直线线（log dosage -probit lin

73、elog dosage -probit line）为）为毒力回归线毒力回归线，也称为，也称为“LD-P“LD-P直线直线”。l研究任何药剂剂量和有害生物的研究任何药剂剂量和有害生物的效应间的关系都要通过试验数据效应间的关系都要通过试验数据建立起这种直线：建立起这种直线： y=a+bx y=a+bx （x x：剂量对数；：剂量对数；y y：机率值）。：机率值）。剂量剂量剂量剂量对数值对数值对数值对数值机率值机率值机率值机率值7/20/202498植物病理学研究方法第45章（一）农药剂量与有害生物死亡（一）农药剂量与有害生物死亡率间的关系率间的关系l在在“剂量对数剂量对数- -机率值机率值”直线直

74、线y=a+bx y=a+bx 中，中，a a0 0。若若a a0 0，意味着不用农药时有害生物也会死亡。，意味着不用农药时有害生物也会死亡。b b称为坡度称为坡度，坡度的大小反映有害生物个体间差异大小：，坡度的大小反映有害生物个体间差异大小：坡度大，则有害生物个体间差异也大坡度大，则有害生物个体间差异也大。l由于不同的毒力回归线坡度可能差异较大，由于不同的毒力回归线坡度可能差异较大， 故故LDLD5050高者高者 LD LD9595未必也高。未必也高。l在比较在比较2 2种杀菌剂的相对药效时，如果两者种杀菌剂的相对药效时，如果两者b b相同，可相同，可直接比较直接比较LDLD5050；如果两者

75、；如果两者b b不同，应比较不同，应比较LDLD9595才能更好的才能更好的反映田间的效果。反映田间的效果。7/20/202499植物病理学研究方法第45章（二）毒力回归线的建立及（二）毒力回归线的建立及ECEC5050的推算的推算1.1.试验方法试验方法 孢子萌发法孢子萌发法萌发率萌发率校正死亡率校正死亡率机率值机率值 生长速率法生长速率法抑制率（抑制率（1-1-处理生长速率处理生长速率/ /对照生长速率）对照生长速率）机率值机率值2.2.不同剂量的设置不同剂量的设置l杀菌剂药液浓度经常按杀菌剂药液浓度经常按5 51010倍倍稀释稀释，从，从10001000倍到倍到1010亿亿倍。倍。l实验

76、数据取得后，应剔除明显不合理的数据，保证有实验数据取得后，应剔除明显不合理的数据，保证有5 56 6组可靠数据即可。组可靠数据即可。l若对照组的生存率过低，则实验应重作。若对照组的生存率过低，则实验应重作。 7/20/2024100植物病理学研究方法第45章（二）毒力回归线的建立及（二）毒力回归线的建立及ECEC5050的推算的推算3.3.毒力回归线的建立方法毒力回归线的建立方法l利用利用“最小二乘法最小二乘法”建立建立 “ “稀释倍数对数稀释倍数对数- -机率值机率值”直线。直线。 常使用常使用计算器计算器或使用或使用微机中的微机中的VBAVBA程序程序。l对回归式的对回归式的“显著性测定显

77、著性测定”可查可查“相关系数显相关系数显著性测定表著性测定表”。对回归式的对回归式的“显著性测定显著性测定”不合格的，应重作实不合格的，应重作实验。验。7/20/2024101植物病理学研究方法第45章（二）毒力回归线的建立及（二）毒力回归线的建立及ECEC5050的推算的推算4. EC4. EC5050的推算的推算lECEC5050即即median effective concentrationmedian effective concentrationlEDED5050 即即median effective dosemedian effective dose 此处不采用此处不采用LDLD5

78、050（median lethal dosemedian lethal dose）的原因是，）的原因是，很多情况下我们并不清楚病原菌是否已经死亡，但我很多情况下我们并不清楚病原菌是否已经死亡，但我们知道它们已经受到了抑制。们知道它们已经受到了抑制。7/20/2024102植物病理学研究方法第45章（二）毒力回归线的建立及（二）毒力回归线的建立及ECEC5050的推算的推算l建立的建立的“稀释倍数对数稀释倍数对数- -机率值机率值”直线为直线为y=a+bxy=a+bx，y y为机率值，为机率值，x x为稀释倍数对数。为稀释倍数对数。令令y=5y=5，算得，算得x x，再取反对数，即为抑制率为，再

79、取反对数，即为抑制率为50%50%时的稀释倍数。时的稀释倍数。令令y=6.645y=6.645，算得，算得x x，再取反对数，即为抑制率为，再取反对数，即为抑制率为95%95%时的稀释倍数。时的稀释倍数。如何将稀释倍数转化为如何将稀释倍数转化为ECEC5050 、ECEC9595 ？抑制率为抑制率为50%50%的稀释倍数倒数即为的稀释倍数倒数即为ECEC5050（单位为（单位为g/mL = 10g/mL = 106 6g/mLg/mL 抑制率为抑制率为90%90%的稀释倍数倒数即为的稀释倍数倒数即为ECEC9595（单位为（单位为g/mL = 10g/mL = 106 6g/mLg/mL 7/

80、20/2024103植物病理学研究方法第45章（二）毒力回归线的建立及（二）毒力回归线的建立及ECEC5050的推算的推算l利用计算机进行上述计算，可以大大提高工作效率利用计算机进行上述计算，可以大大提高工作效率 ，减少差，减少差错，具有很强的实用价值。我校采用一种基于错，具有很强的实用价值。我校采用一种基于ExcelExcel的的VBAVBA编编程方法，编写了程方法，编写了“Ec50“Ec50、Ec90Ec90测算测算”软件，可在所有配备软件，可在所有配备Offic2000Offic2000以上版本的计算机上使用。以上版本的计算机上使用。lVBAVBA用用OfficeOffice作为开发平台

81、的主要优点：作为开发平台的主要优点： Office Office本身功能强大，正因为本身功能强大，正因为VBAVBA用用OfficeOffice作为开发平台，作为开发平台，所以编写出的所以编写出的VBAVBA程序的功能强大而占用内存极小。程序的功能强大而占用内存极小。无需考虑运行环境，因为无需考虑运行环境，因为OfficeOffice是普遍配备的应用软件。是普遍配备的应用软件。 Office Office界面为大家熟悉，便于软件推广应用。界面为大家熟悉，便于软件推广应用。 7/20/2024104植物病理学研究方法第45章“Ec50“Ec50、Ec90Ec90测算测算”计算机软件的应用方计算机

82、软件的应用方法法l使用本程序的步骤：打开使用本程序的步骤：打开ExcelExcel工作簿（在此过程中，若计算机屏幕显示对话框，则应选择并点工作簿（在此过程中，若计算机屏幕显示对话框，则应选择并点击击“启用宏启用宏”），单击），单击“计算计算”按钮，则程序开始运行。计算机屏幕依次出现对话框，按钮，则程序开始运行。计算机屏幕依次出现对话框，“请输入请输入不同浓度药剂数据组数不同浓度药剂数据组数n=?” n=?” ； 请输入采用何种方法，孢子萌发法输入请输入采用何种方法，孢子萌发法输入1 1，生长速率法输入，生长速率法输入2 2 ff=?ff=?；l如果你采用的是孢子萌发法，则应输入如果你采用的是孢

83、子萌发法，则应输入1 1，之后，计算机屏幕依次出现对话框，之后，计算机屏幕依次出现对话框， 请输入对照组孢请输入对照组孢子萌发率子萌发率ck=?ck=?； 请输入第请输入第()()处理组孢子萌发率处理组孢子萌发率=?=?。l如果你采用的是生长数率法，则应输入如果你采用的是生长数率法，则应输入2 2，之后，计算机屏幕依次出现对话框，之后，计算机屏幕依次出现对话框， 请输入采用何种方法，生长速率数据中已减去原始菌落直径法请输入采用何种方法，生长速率数据中已减去原始菌落直径法 输入输入3, 3, 生长速率数据中未减原始直生长速率数据中未减原始直径法径法 输入输入4 4， ff=? ff=?；l如果你

84、采用的是生长速率数据中已减去原始菌落直径方法，则应输入如果你采用的是生长速率数据中已减去原始菌落直径方法，则应输入3 3，之后，计算机屏幕依次，之后，计算机屏幕依次出现对话框，出现对话框， 请输入对照生长速率请输入对照生长速率( (已减去原始菌落直径已减去原始菌落直径)ck=?)ck=?； 请输入第请输入第()()处理组生长速率处理组生长速率( (已减去原始菌落直径已减去原始菌落直径)=?)=?；l如果你采用的是生长速率数据中未减去原始菌落直径方法，则应输入如果你采用的是生长速率数据中未减去原始菌落直径方法，则应输入4 4，之后，计算机屏幕依次，之后，计算机屏幕依次出现对话框，出现对话框， 请

85、输入对照生长速率请输入对照生长速率( (未减原始直径未减原始直径)ck=?)ck=?； 请输入请输入()()处理组生长速率处理组生长速率( (未减原始未减原始直径直径)=?)=?l按照计算机的提示，输入相应数据后，则计算机进行计算后，马上就在屏幕上显示出毒力回归线按照计算机的提示，输入相应数据后，则计算机进行计算后，马上就在屏幕上显示出毒力回归线中的常数项中的常数项a a、一次项系数、一次项系数b b、相关系数、相关系数r r，农药的，农药的EC50EC50微克微克/ /毫升毫升 ，EC90EC90微克微克/ /毫升毫升 ，EC95EC95微微克克/ /毫升毫升 。即为我们试验所要求得的结果。

86、即为我们试验所要求得的结果。l对回归式的对回归式的“显著性测定显著性测定”可查可查“相关系数显著性测定表相关系数显著性测定表”，ExcelExcel工作簿上，已经附上工作簿上，已经附上“相关相关系数显著性测定表系数显著性测定表”供查阅。供查阅。7/20/2024105植物病理学研究方法第45章三三. .杀菌剂混用联合毒力的测定及杀菌剂混用联合毒力的测定及配方优选配方优选各种杀菌剂混用后可能带来许多好处：各种杀菌剂混用后可能带来许多好处： 联合毒力增加，从而提高药效、减少用药量，降低防治成本。联合毒力增加，从而提高药效、减少用药量，降低防治成本。 兼治几种有害生物，防治省工省时。兼治几种有害生物

87、，防治省工省时。 减轻药害或残毒，增加安全性。减轻药害或残毒，增加安全性。 延缓抗药性的发生。延缓抗药性的发生。l但若不合理混用但若不合理混用，也可能造成，也可能造成有效成分分解有效成分分解、理化性质变劣而、理化性质变劣而降降低药效低药效；或；或增加毒性或药害增加毒性或药害等问题。等问题。l为研制性能良好的复配药剂，首先要测定杀菌剂混用后的联合毒为研制性能良好的复配药剂，首先要测定杀菌剂混用后的联合毒力大小。力大小。7/20/2024106植物病理学研究方法第45章三三. .杀菌剂混用联合毒力的测定及杀菌剂混用联合毒力的测定及配方优选配方优选（一）杀菌剂联合毒力测定方法（一）杀菌剂联合毒力测定

88、方法1.1.交叉滤纸条法交叉滤纸条法2.Sakai2.Sakai公式法公式法3.3.共毒系数法共毒系数法（二）配方优选方法（二）配方优选方法7/20/2024107植物病理学研究方法第45章1. 1.交叉滤纸条法交叉滤纸条法联合毒力的简易测定常采用交叉滤纸条法联合毒力的简易测定常采用交叉滤纸条法(crossed-(crossed-paper)paper)，也称为，也称为“十字纸条法十字纸条法”，其做法很类似抑菌，其做法很类似抑菌圈法，即将二种药剂分别沾于滤纸条上，垂直交叉圈法，即将二种药剂分别沾于滤纸条上，垂直交叉( (成成9090角角) )置于混有病原菌的平板上。置于混有病原菌的平板上。 经

89、培养后根据二滤纸条周围抑菌区域联接处的形经培养后根据二滤纸条周围抑菌区域联接处的形状，判断二药剂的互作性质：状，判断二药剂的互作性质：l相接处平滑，表示相接处平滑，表示加成加成作用；作用；l相接处凸出，表示相接处凸出，表示增效增效作用；作用；l相接处凹入，表示相接处凹入，表示拮抗拮抗作用。作用。 7/20/2024108植物病理学研究方法第45章根据二滤纸条周围抑菌区域联接根据二滤纸条周围抑菌区域联接处形状，判断二药剂的互作性质处形状，判断二药剂的互作性质相接处平滑，相接处平滑，加成加成相接处凸出，相接处凸出，增效增效相接处凹入，相接处凹入，拮抗拮抗7/20/2024109植物病理学研究方法第

90、45章2.Sakai2.Sakai公式法公式法假设假设A A、B B为为2 2种单剂，单独使用时有害生物的死亡率分别为：种单剂，单独使用时有害生物的死亡率分别为：PAPA和和PBPB，则两者混，则两者混用时有害生物死亡率（假定用时有害生物死亡率（假定2 2种药剂的相互作用为加成）的理论值不是种药剂的相互作用为加成）的理论值不是Pm = Pm = PA+PBPA+PB，而是，而是 Pm = PA + PBPm = PA + PB（1- PA1- PA） = 1- = 1-（1- PA1- PA）（）（1- PB1- PB），），假设为多种药剂混用，则混用后有害生物死亡率（假定各种药剂的相互作用为

91、假设为多种药剂混用，则混用后有害生物死亡率（假定各种药剂的相互作用为加成）的理论值是：加成）的理论值是：lPm= 1-Pm= 1-（1- PA1- PA）（）（1- PB1- PB）（）（1- PC1- PC）l若几种药剂混用后实际有害生物死亡率为若几种药剂混用后实际有害生物死亡率为P PX X ，则比较则比较P PX X 、PmPm，即可判断药剂间的相互作用性质：，即可判断药剂间的相互作用性质： lP PX X = Pm = Pm， 两者为加成作用两者为加成作用lP PX X PmPm， 两者为增效作用两者为增效作用lP PX X PmPm， 两者为颉抗作用两者为颉抗作用7/20/20241

92、10植物病理学研究方法第45章3.3.共毒系数法共毒系数法l联合毒力的精确测定方法，国内经常采用共毒系数法联合毒力的精确测定方法，国内经常采用共毒系数法( (孙云沛，孙云沛，1960)1960)。求出甲、乙、（甲乙）求出甲、乙、（甲乙）3 3种药剂的种药剂的ECEC5050。求出甲、乙、（甲乙）求出甲、乙、（甲乙）3 3种药剂的种药剂的毒力指数毒力指数。 甲、乙甲、乙2 2种药剂种药剂单剂毒力指数单剂毒力指数( (标准药剂标准药剂ECEC5050 / /供试药剂供试药剂ECEC5050)100%)100% （甲乙）（甲乙）混剂实际毒力指数混剂实际毒力指数 标准药剂标准药剂ECEC5050 /(

93、 /(甲乙甲乙) )混剂混剂ECEC5050100%100% （甲乙）（甲乙）混剂理论毒力指数混剂理论毒力指数(单剂毒力指数单剂毒力指数单剂在混剂中的含量单剂在混剂中的含量) ) 求出混剂的求出混剂的共毒系数共毒系数 共毒系数共毒系数混剂混剂实际毒力指数实际毒力指数 / / 混剂混剂理论毒力指数理论毒力指数100%100% 根据共毒系数大小来判断甲、乙二药间的相互作用。根据共毒系数大小来判断甲、乙二药间的相互作用。 7/20/2024111植物病理学研究方法第45章3.3.共毒系数法共毒系数法若若共毒系数共毒系数100% 100% 表示表示增效增效； 100% 100% 表示表示拮抗拮抗； 1

94、00% 100% 表示表示加成加成。值得注意的是：值得注意的是：共毒系数法也应适用于甲、乙当中一种为无毒的增效剂共毒系数法也应适用于甲、乙当中一种为无毒的增效剂的情况，的情况，此时的共毒系数也称为此时的共毒系数也称为增效系数增效系数、活性系数活性系数等。等。 7/20/2024112植物病理学研究方法第45章芬尼法（芬尼法（FinneyFinney）l国外所称的芬尼法（国外所称的芬尼法（FinneyFinney）实质和共毒系数法一致）实质和共毒系数法一致( (但但不设不设标准药剂标准药剂) )，其计算步骤如下：，其计算步骤如下：（甲乙）混剂（甲乙）混剂理论理论ECEC5050-1-1(单剂单剂

95、ECEC5050-1-1单剂在混剂中的含单剂在混剂中的含量量) ) 求出混剂的求出混剂的毒力比值毒力比值 混剂实际混剂实际ECEC5050-1-1 / / 混剂理论混剂理论ECEC5050-1-1 l根据根据毒力比值毒力比值大小来判断甲、乙二药间的相互作用。大小来判断甲、乙二药间的相互作用。l若毒力比值若毒力比值2.0 2.0 表示增效表示增效 l毒力比值毒力比值0.5 0.5 表示拮抗表示拮抗 l毒力比值毒力比值0.50.52.0 2.0 表示加成表示加成 7/20/2024113植物病理学研究方法第45章（二）配方优选方法（二）配方优选方法l具增效作用的杀菌剂混用后可能带来各具增效作用的杀

96、菌剂混用后可能带来各种好处，为使种好处，为使配方配方更加更加科学合理科学合理，应当，应当进行配方的进行配方的优选优选。l配方优选可以采用不同方法。配方优选可以采用不同方法。 7/20/2024114植物病理学研究方法第45章（二）配方优选方法（二）配方优选方法1.1.按比例混合法按比例混合法2.2.等效线法等效线法7/20/2024115植物病理学研究方法第45章1. 1.按比例混合法按比例混合法2 2种具增效作用的种具增效作用的杀菌剂成本、毒性相近杀菌剂成本、毒性相近，单从药效角度，单从药效角度考虑宜用此法。考虑宜用此法。l将两药剂按不同比例混用将两药剂按不同比例混用假定假定A A、B B药

97、剂剂量的药剂剂量的EDED5050分别为分别为a a、b b，初步设计初步设计6 6种配方，则混用时按种配方，则混用时按a/7+6b/7a/7+6b/7；2a/7+5b/72a/7+5b/7；3a/7+4b/73a/7+4b/7；6a/7+b/76a/7+b/7后，后，l分别测定联合毒力，选用其中联合毒力最高的混用比分别测定联合毒力，选用其中联合毒力最高的混用比例配方。例配方。7/20/2024116植物病理学研究方法第45章按比例混合法示意图按比例混合法示意图对病菌的抑制率（对病菌的抑制率（% %）拮抗拮抗增效增效加成加成b b， a/5+4b/5 a/5+4b/5； 2a/5+3b/5 2

98、a/5+3b/5； 3a/5+2b/5 3a/5+2b/5； 4a/5+b/5 4a/5+b/5， a aA A、B B药剂剂量的药剂剂量的EDED5050分别为分别为a a、b b，设计设计4 4种配方，则混用时按种配方，则混用时按a/5+4b/5a/5+4b/5；2a/5+3b/52a/5+3b/5；3a/5+2b/53a/5+2b/5；4a/5+b/54a/5+b/5，较优配方较优配方7/20/2024117植物病理学研究方法第45章2.2.等效线法等效线法l2 2种具增效作用的杀菌剂种具增效作用的杀菌剂成本、毒性相差较大成本、毒性相差较大，从成本、，从成本、安全性角度考虑宜用此法。安全

99、性角度考虑宜用此法。l即将两种药剂按不同比例混用后，分别测定联合毒力，即将两种药剂按不同比例混用后，分别测定联合毒力，在保证联合毒力不降低的条件下，选用其中在保证联合毒力不降低的条件下，选用其中成本、毒性成本、毒性较大的杀菌剂所占比例最少的配方较大的杀菌剂所占比例最少的配方（可以首先选出联合（可以首先选出联合毒力最高的混用比例配方，在此基础上，减少成本、毒毒力最高的混用比例配方，在此基础上，减少成本、毒性较大的杀菌剂所占比例，同时增加成本、毒性较小的性较大的杀菌剂所占比例，同时增加成本、毒性较小的杀菌剂所占比例杀菌剂所占比例.）。）。7/20/2024118植物病理学研究方法第45章A A药剂

100、剂量药剂剂量( (对数值对数值) )B B药剂剂量药剂剂量( (对数值对数值) )等效线法示意图等效线法示意图加成加成等效线等效线等效线等效线拮抗拮抗等效线等效线等效线等效线增效增效等效线等效线等效线等效线独立独立等效线等效线等效线等效线A药剂药剂LD50B药药剂剂LD50加成加成平行线平行线平行线平行线平行线切点平行线切点较优配方较优配方7/20/2024119植物病理学研究方法第45章四四. .病原菌抗药性测定的原理和方法病原菌抗药性测定的原理和方法1.1.测定原理测定原理2.2.测定方法测定方法3.3.抗药性持久与否的测定方法抗药性持久与否的测定方法7/20/2024120植物病理学研究

101、方法第45章1. 1.测定原理测定原理l比较敏感野生菌株和待测菌株的抗药性水平，是否有显著差别。比较敏感野生菌株和待测菌株的抗药性水平，是否有显著差别。 即，以敏感野生菌株为即，以敏感野生菌株为对照对照（在未使用过此类杀菌剂地区分离（在未使用过此类杀菌剂地区分离出来），测定长期使用某种杀菌剂地区的此病原菌其它菌株的抗出来），测定长期使用某种杀菌剂地区的此病原菌其它菌株的抗药水平。药水平。l如果两者抗药性水平相差无几，则说明未有抗药性产生；如果两者抗药性水平相差无几，则说明未有抗药性产生；l如果两者抗药性水平相差相当大（数倍、数十倍甚至更多），如果两者抗药性水平相差相当大（数倍、数十倍甚至更多）

102、， 则说明有抗药性产生。则说明有抗药性产生。如果抗药性菌株已成为如果抗药性菌株已成为优势菌株优势菌株，则此药剂应，则此药剂应停止使用停止使用。7/20/2024121植物病理学研究方法第45章2.2.测定方法测定方法测定方法的实质就是杀菌剂毒力的测定，故方法也是杀菌剂测定方法的实质就是杀菌剂毒力的测定，故方法也是杀菌剂毒力的测定方法。毒力的测定方法。 ECEC5050比较法比较法：比较同一杀菌剂的：比较同一杀菌剂的敏感野生菌株敏感野生菌株和和待测菌株待测菌株的的ECEC5050相差倍数。相差倍数。 其它方法其它方法 孢子萌发法孢子萌发法：比较敏感野生菌株和待测菌株孢子的校正死亡率相同时：比较敏

103、感野生菌株和待测菌株孢子的校正死亡率相同时的杀菌剂浓度相差倍数。的杀菌剂浓度相差倍数。 抑菌圈法抑菌圈法：比较敏感野生菌株和待测菌株达到相同抑菌圈大小时杀菌：比较敏感野生菌株和待测菌株达到相同抑菌圈大小时杀菌剂浓度相差倍数。剂浓度相差倍数。 生长速率法生长速率法：比较药液平板上敏感野生菌株和待测菌株菌落生长速度：比较药液平板上敏感野生菌株和待测菌株菌落生长速度相同时的杀菌剂浓度相差倍数。相同时的杀菌剂浓度相差倍数。7/20/2024122植物病理学研究方法第45章3. 3. 菌株菌株抗药性持久与否抗药性持久与否的测定方法的测定方法l抗药抗药菌株菌株在在无杀菌剂无杀菌剂培养基上连续生长多代（培养

104、基上连续生长多代（7 7代以上）代以上）培养基中加大到培养基中加大到较高杀菌剂浓度较高杀菌剂浓度检验菌株是否还有抗药性？检验菌株是否还有抗药性？l如仍有，则抗药性为持久的，否则，抗药性是可以丧如仍有，则抗药性为持久的，否则，抗药性是可以丧失的。失的。l如果抗药菌的如果抗药菌的抗药性抗药性并并不持久不持久，则原有的，则原有的失效药剂失效药剂在在更换了一段时间其它药剂后，仍可更换了一段时间其它药剂后，仍可重新使用重新使用。7/20/2024123植物病理学研究方法第45章第二节第二节 杀菌剂的田间药效测定杀菌剂的田间药效测定l杀菌剂室内毒力测定的是杀菌剂自身对病原菌的作用。杀菌剂室内毒力测定的是杀

105、菌剂自身对病原菌的作用。（抑制孢子萌发、抑制菌丝生长、抑制附着胞形成等）（抑制孢子萌发、抑制菌丝生长、抑制附着胞形成等） 如春雷霉素在体外抑制稻瘟菌孢子萌发作用很差，但到植物体内可有效抑如春雷霉素在体外抑制稻瘟菌孢子萌发作用很差，但到植物体内可有效抑制菌丝生长，制菌丝生长，杀菌剂室内毒力测定难以反映杀菌剂室内毒力测定难以反映植物体内植物体内效果。效果。l杀菌剂可能还具有杀菌剂可能还具有免疫诱导作用免疫诱导作用（如，乙磷铝等）（如，乙磷铝等）l杀菌剂可能在植物体内的杀菌剂可能在植物体内的转化产物转化产物也有杀菌作用（如，甲基托布津就是也有杀菌作用（如，甲基托布津就是在植物体内转化为多菌灵而起杀菌

106、作用）在植物体内转化为多菌灵而起杀菌作用）l还存在杀菌剂在还存在杀菌剂在田间条件下的稳定性田间条件下的稳定性问题等。问题等。l为真正确定杀菌剂的实际防病效果，为真正确定杀菌剂的实际防病效果，必须必须进行杀菌剂在进行杀菌剂在田间田间的防病试验。的防病试验。7/20/2024124植物病理学研究方法第45章第二节第二节 杀菌剂的杀菌剂的 田间药效测定田间药效测定7/20/2024125植物病理学研究方法第45章第二节第二节 杀菌剂的田间药效测定杀菌剂的田间药效测定一一. . 进行田间药效试验的基本要求进行田间药效试验的基本要求二二. . 杀菌剂的田间药效计算杀菌剂的田间药效计算7/20/20241

107、26植物病理学研究方法第45章药剂施用方法药剂施用方法杀菌剂的田间药效试验中药剂施用方法包括：杀菌剂的田间药效试验中药剂施用方法包括：l种苗处理种苗处理( (药剂拌种、浸种或包衣药剂拌种、浸种或包衣) )、l土壤处理土壤处理( (药剂混拌或浇灌药剂混拌或浇灌) )、l植株地上部植株地上部及及根部处理根部处理( (向植株地上部喷施药液向植株地上部喷施药液或药粉；药液沾根等或药粉；药液沾根等) )。植株的发病可人工接种令其发病，植株的发病可人工接种令其发病，也可让其自然发病。也可让其自然发病。 7/20/2024127植物病理学研究方法第45章一一. .进行田间药效试验的基本要求进行田间药效试验的

108、基本要求l关于进行田间药效试验的基本要求，农业部农药检定所生测室编关于进行田间药效试验的基本要求，农业部农药检定所生测室编写的农药田间药效试验准则当中大体规定为：写的农药田间药效试验准则当中大体规定为： 试验地的选择要有试验地的选择要有代表性代表性和栽培条件的和栽培条件的均匀一致均匀一致性。性。 每种药剂要设每种药剂要设3 3个以上处理剂量个以上处理剂量，每个处理应有，每个处理应有4 4次以上重复，次以上重复，应设不施药剂应设不施药剂( (空白空白) )对照对照，还应设，还应设标准药剂标准药剂( (生产中普遍应用的生产中普遍应用的农药农药) )的的对照对照。 小区面积小区面积为：稻、麦、大豆、

109、蔬菜等矮秆植物为：稻、麦、大豆、蔬菜等矮秆植物151550m50m2 2( (保护地保护地可可8m8m2 2) )，玉米、高梁等高秆植物应适当多些。，玉米、高梁等高秆植物应适当多些。 施药后要施药后要详细记载详细记载施药日期、方法、次数以及影响药效的气象施药日期、方法、次数以及影响药效的气象因素因素( (降雨、刮风、日照、温度、湿度等降雨、刮风、日照、温度、湿度等) )和栽培条件和栽培条件( (施肥、灌施肥、灌水等水等) )。 7/20/2024128植物病理学研究方法第45章二二. . 杀菌剂的田间药效计算杀菌剂的田间药效计算1.1.从增产、保产角度计算药效从增产、保产角度计算药效2.2.从

110、控制疫情角度计算药效从控制疫情角度计算药效7/20/2024129植物病理学研究方法第45章1. 1.从增产、保产角度计算药效从增产、保产角度计算药效从增产、保产角度计算药效的公式：从增产、保产角度计算药效的公式：防病防病增产效果增产效果= =（防病区产值（防病区产值- -不防区产值）不防区产值）/ / 不防区产值不防区产值防病防病保产效果保产效果= =（防病区产值（防病区产值- -不防区产值）不防区产值）/ /（无病区产值（无病区产值- - 不防区产值）不防区产值）以上以上2 2个公式中：个公式中：“不防区产值不防区产值”为病害造成损失后的为病害造成损失后的剩余产值剩余产值；（防病区产值（防

111、病区产值- -不防区产值）为防治措施所不防区产值）为防治措施所挽回的经济损失值挽回的经济损失值，（无病区产值（无病区产值- -不防区产值）为病害造成的不防区产值）为病害造成的经济损失值经济损失值。7/20/2024130植物病理学研究方法第45章从增产、保产角度计算药效从增产、保产角度计算药效l防病防病增产效果公式增产效果公式较为常用较为常用（在病害减产幅度较小时应用较为适宜），（在病害减产幅度较小时应用较为适宜）， 因为计算中所需数据易得，计算结果易懂。因为计算中所需数据易得，计算结果易懂。l防病防病保产效果公式保产效果公式目前应用较少，原因之一是目前应用较少，原因之一是“无病区产值无病区产

112、值”数据数据较难得到。较难得到。7/20/2024131植物病理学研究方法第45章防病增产效果公式的缺点防病增产效果公式的缺点l防病增产效果公式的缺点是，在防病增产效果公式的缺点是，在“不防区产值不防区产值”数量较小数量较小时计算出的时计算出的增增产效果可能过大产效果可能过大，令人难以接受。，令人难以接受。如：如：“不防区产值不防区产值”为为50005000元，元，“防病区产值防病区产值”为为60006000元，元，则防病则防病增产效果增产效果= =（6000-50006000-5000）/5000 = /5000 = 20 %20 %。 此计算结果人们可以接受。此计算结果人们可以接受。若若“

113、不防区产值不防区产值”为为10001000元，元，“防病区产值防病区产值”为为60006000元，元，则防病则防病增产效果增产效果= =（6000-10006000-1000）/1000 = /1000 = 500%500%。 此计算结果令人惊讶。此计算结果令人惊讶。若若“无病区产值无病区产值”1100011000元，元，“防病区产值防病区产值”为为60006000元，元，“不防区产值不防区产值”为为10001000元，元，则防病则防病保产效果保产效果= =（6000-10006000-1000）/ /（11000-100011000-1000）= =50%50%。结果合理。结果合理。7/20

114、/2024132植物病理学研究方法第45章2.2.从控制疫情角度计算药效从控制疫情角度计算药效l从疫情控制发展角度谈防效，可以定义：从疫情控制发展角度谈防效，可以定义：无效无效：施药区和对照区病情发展速率无区别；：施药区和对照区病情发展速率无区别；100100防效防效，即施药区病情不再发展。，即施药区病情不再发展。 通常通常保护剂保护剂达不到达不到100100防效，因为有潜育病斑防效，因为有潜育病斑可以不受药剂的影响而继续显症，可以不受药剂的影响而继续显症，但但内吸治疗剂内吸治疗剂可能治愈潜育病斑而达到可能治愈潜育病斑而达到100100防效。防效。7/20/2024133植物病理学研究方法第4

115、5章单循环病害、多循环病害单循环病害、多循环病害药效计算公式不同药效计算公式不同l由于单循环病害发病规律相对简单，计由于单循环病害发病规律相对简单，计算公式较简单。算公式较简单。l多循环病害发病规律较复杂，计算公式多循环病害发病规律较复杂，计算公式相对较复杂。相对较复杂。7/20/2024134植物病理学研究方法第45章用于单循环病害的计算公式用于单循环病害的计算公式l疫情控制效果疫情控制效果 = 1 - T/CK= 1 - T/CK = =（对照区病情（对照区病情 - - 处理区病情）处理区病情）/ /对照区病情对照区病情 式中，式中， T T为防治区终期病情；为防治区终期病情； CKCK为

116、不防区（对照区）终期病情。为不防区（对照区）终期病情。l由于单循环病害发病规律相对简单，病情稳定，故计算由于单循环病害发病规律相对简单，病情稳定，故计算公式较简单，人们对计算结果一般无疑义。公式较简单，人们对计算结果一般无疑义。l应注意病情的应注意病情的调查调查应在所有该生病的植株全部表现出症应在所有该生病的植株全部表现出症状后才去进行。状后才去进行。7/20/2024135植物病理学研究方法第45章用于多循环病害的计算公式用于多循环病害的计算公式l多循环病害发病规律较复杂，不同疫情控制效多循环病害发病规律较复杂，不同疫情控制效果公式的计算结果常有很大出入。果公式的计算结果常有很大出入。l必须

117、首先明确各个公式的应用条件，才会正确必须首先明确各个公式的应用条件，才会正确加以使用。加以使用。7/20/2024136植物病理学研究方法第45章用于多循环病害的计算公式用于多循环病害的计算公式l目前常用的公式有如下几个：目前常用的公式有如下几个： EF = 1 - EF = 1 - （T-TT-T0 0）/ /（CK- CKCK- CK0 0 ）AbbottAbbott公式，公式，19251925 EF = 1 - EF = 1 - （TTCKCK0 0）/ /（CKCKT T0 0）Henderson-TiltonHenderson-Tilton公式，公式，19551955 EF = 1

118、- EF = 1 - （T-TT-T0 0）CKCK0 0（1-CK1-CK）/ /（CK- CKCK- CK0 0 ）T T0 0（1-T1-T） . .杨信东公式，杨信东公式，19991999 l - - 式中，式中， EFEF为疫情控制效果，为疫情控制效果， T T0 0为防治区初始病情，为防治区初始病情，T T为防治区终期病情；为防治区终期病情；CKCK0 0为不防区为不防区( (对照区对照区) )初始病情，初始病情，CKCK为不防区为不防区( (对照区对照区) )终期病情。终期病情。7/20/2024137植物病理学研究方法第45章三个公式的应用条件对比l式、式、式式在应用上必须符合

119、以下条件：在应用上必须符合以下条件： CKCK0 0和和T T0 0均较小，且数值较接近；均较小，且数值较接近；CKCK、T T不大不大于于0.50.5。否则否则可能出现较大误差可能出现较大误差。l式式可以可以消除掉消除掉有害生物初始种群数量不有害生物初始种群数量不同、终期种群数量较大而造成的同、终期种群数量较大而造成的实验误差实验误差。 不论不论CKCK0 0和和T T0 0， CKCK和和T T为何值均可适用。为何值均可适用。7/20/2024138植物病理学研究方法第45章公式公式、公式、公式计算结果的比较计算结果的比较为更直观的了解公式为更直观的了解公式和公式和公式产生误差的大小程度，

120、举例如下：产生误差的大小程度，举例如下：l若若 T T0 0 0.020.02，T T0.040.04； CK CK0 0 0.20.2，CKCK0.40.4，l按按公式公式计算得计算得EF = 1 - EF = 1 - （ T-T T-T0 0 ）/ /（ CK- CK CK- CK0 0 ）1-1-（0.04-0.020.04-0.02）/ /（0.4-0.20.4-0.2）0.02 / 0.2= 0.02 / 0.2= 9090。l按按公式公式计算得计算得EF = 1 - EF = 1 - （T CKT CK0 0 ）/ /（CK TCK T0 0 ）1-0.040.2/0.40.021

121、-0.040.2/0.40.021-11-10 0。 l可见公式可见公式和公式和公式产生误差的大小程度令人吃惊。产生误差的大小程度令人吃惊。l上述数据，按上述数据，按公式公式计算得计算得EFEF37.537.5。 7/20/2024139植物病理学研究方法第45章计算中还应注意以下问题计算中还应注意以下问题l对于多循环病害疫情控制效果公式，在使用中还应注意以对于多循环病害疫情控制效果公式，在使用中还应注意以下问题：下问题：要正确掌握调查病情时间：要正确掌握调查病情时间：一般应在施药前进行一次各小区病情调查，即为各小区初始一般应在施药前进行一次各小区病情调查，即为各小区初始病情；病情；还应在施药

122、结束还应在施药结束药剂持效期过后药剂持效期过后及时调查各小区发病情况，及时调查各小区发病情况，即为各小区的终期病情。即为各小区的终期病情。如果调查时间如果调查时间过早过早，计算结果将，计算结果将偏低偏低，因为药剂继续发挥作，因为药剂继续发挥作用的效果尚未体现出来。用的效果尚未体现出来。如果病害潜育期很长如果病害潜育期很长，明显长于药剂持效期，则应该在施药结束后再经，明显长于药剂持效期，则应该在施药结束后再经过一个过一个潜育期连同病害的显症期潜育期连同病害的显症期后进行各小区的终期病情调查。后进行各小区的终期病情调查。7/20/2024140植物病理学研究方法第45章要正确选择病害程度的计量方法

123、：要正确选择病害程度的计量方法：l为保证各小区施药前后二次病情调查数据能准确互相对应，为保证各小区施药前后二次病情调查数据能准确互相对应，最好是采取最好是采取定点定株甚至是定叶片定点定株甚至是定叶片等系统调查方法，并且等系统调查方法，并且调查调查病害增长的绝对量病害增长的绝对量（病斑数、病斑面积等）。（病斑数、病斑面积等）。 l通常采用病情指数计量病害程度，但当处理区和对照区寄主生长量明显通常采用病情指数计量病害程度，但当处理区和对照区寄主生长量明显不一致时，采用病情指数将造成误差。不一致时，采用病情指数将造成误差。l因为因为病情指数是比值病情指数是比值（植物体发病部分（植物体发病部分/ /整个植物体可侵染部分），整个植物体可侵染部分），l处理区寄主生长量明显大于对照区时，处理区病情指数将偏小，甚至可处理区寄主生长量明显大于对照区时，处理区病情指数将偏小，甚至可能出现防效能出现防效100100的计算结果；的计算结果；l反之，可能出现防效反之，可能出现防效0 0的计算结果。的计算结果。 计算中还应注意以下问题计算中还应注意以下问题7/20/2024141植物病理学研究方法第45章l请批评指正！请批评指正！7/20/2024142植物病理学研究方法第45章