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1、实验四实验四 DNA回收纯化及重组体的构建回收纯化及重组体的构建实验目的和要求实验目的和要求学习和掌握从学习和掌握从PCRPCR产物中回收产物中回收DNADNA片段的方法。片段的方法。并了解从琼脂糖凝胶中纯化并了解从琼脂糖凝胶中纯化DNADNA片段的有关技片段的有关技术。术。本本实实验验采采用用粘粘末末端端连连接接法法将将PCRPCR扩扩增增的的DNADNA片片段段插插入入到到pBluescriptpBluescript KSKS质质粒粒载载体体中中，掌掌握握DNADNA重重组组方方法法。通通过过本本实实验验了了解解DNADNA重重组组技技术术在在分分子生物学研究中的重要意义。子生物学研究中的
2、重要意义。 DNA片段的纯化：片段的纯化： DNA纯化的主要目的是纯化的主要目的是回收得到纯的目的回收得到纯的目的DNA片段，去除影响片段，去除影响DNA连接酶活性的物质以及其它的连接酶活性的物质以及其它的DNA片片段。纯化段。纯化DNA片段的方法有多种，如：电片段的方法有多种，如：电洗脱法、从低熔点或普通琼脂糖凝胶中回洗脱法、从低熔点或普通琼脂糖凝胶中回收、玻璃珠纯化、柱层析以及硅胶吸附等收、玻璃珠纯化、柱层析以及硅胶吸附等方法。目前一些生物公司推出了直接从方法。目前一些生物公司推出了直接从 PCR产物中或琼脂糖凝胶中回收产物中或琼脂糖凝胶中回收DNA片段片段的试剂盒，有效地加快了的试剂盒，
3、有效地加快了DNA的纯化的速的纯化的速度。度。相关基础知识相关基础知识 DNA重组本质上是一个酶促生化过程，是指重组本质上是一个酶促生化过程，是指将外源目的基因片段通过将外源目的基因片段通过DNA连接酶的的作连接酶的的作用插入到质粒载体中的过程。用插入到质粒载体中的过程。DNA片段只有片段只有与载体重组并转入合适的宿主细胞中才能进与载体重组并转入合适的宿主细胞中才能进行复制。通过此方法可以对单个基因的功能行复制。通过此方法可以对单个基因的功能进行研究。结合进行研究。结合PCR技术还可以应用于疾病技术还可以应用于疾病诊断、合成具有商业意义的产品，如胰岛素、诊断、合成具有商业意义的产品，如胰岛素、
4、干扰素等。干扰素等。DNA重组重组因为载体具有能够在特定宿主细胞中独立自我因为载体具有能够在特定宿主细胞中独立自我复制的复制起始点，保证插入的外源片段的复复制的复制起始点，保证插入的外源片段的复制；并且具有多个限制性内切酶的单一位点，制；并且具有多个限制性内切酶的单一位点，即多克隆位点，用于插入外源片段，而又不破即多克隆位点，用于插入外源片段，而又不破坏质粒本身的结构；还具有易于筛选和检测的坏质粒本身的结构；还具有易于筛选和检测的标记性基因，如抗药性基因、酶基因或营养缺标记性基因，如抗药性基因、酶基因或营养缺陷型等。但针对不同的研究目，选择的择载体陷型等。但针对不同的研究目，选择的择载体也是不
5、同的，不仅要考虑上述特性，而且还要也是不同的，不仅要考虑上述特性，而且还要考虑所选载体是表达载体还是非表达载体、是考虑所选载体是表达载体还是非表达载体、是真核生物表达载体还是原核生物表达载体以及真核生物表达载体还是原核生物表达载体以及酶切位点等方面的问题。酶切位点等方面的问题。载体的选择：载体的选择：主要有两种：主要有两种：T4T4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶和大肠杆连接酶和大肠杆菌菌DNADNA连接酶。连接酶。E. coliE. coli DNA DNA 连接酶催化连接酶催化DNADNA分子连接的机理与分子连接的机理与T4T4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接酶基本相同，只是辅助因子不是基
6、本相同，只是辅助因子不是ATPATP而是而是NADNAD+ +。T4T4噬茵体噬茵体DNADNA连接酶催化连接酶催化DNADNA连接反应分为连接反应分为三步。三步。DNA连接酶连接酶 T4噬噬菌菌体体DNA连连接接酶酶还还有有一一种种E. coli DNA连连接接酶酶没没有有的的特特性性即即将将两两个个平平末末端端的的双双链链DNA分分子子连连接接起起来来的的功功能能。对对于于这这种种连连接接反反应应的的机机理理目目前前还还不不清清楚楚，总总的的来来说说这这种种连连接接的的效效率率比比粘粘性性末末端端的的连连接接效效率率要要低低得得多多，可可能能是是因因为为平平末末端端DNA分分子子无无法法形
7、形成成类类似似粘粘性性末末端端分分子子那那样样的的相相对对稳稳定定的的结构。结构。1.1.WeissWeiss单位（单位（WeissWeiss等等,1968,1968），是指在），是指在3737o oC C下下2020分钟内催化分钟内催化1nM 1nM 3232P P从焦磷酸根置换到从焦磷酸根置换到 , , - -3232P ATPP ATP所需酶量；所需酶量；2.2.（NEBNEB公司，粘性末端）将公司，粘性末端）将1 1 g g由由HindHindIIIIII酶酶解解的的 DNADNA的的1212碱基对粘性末端在碱基对粘性末端在16160 0C C条件下、条件下、3030分钟、分钟、202
8、0 l l反应体系中连接反应体系中连接5050时所需酶量。时所需酶量。3.3.(Takara(Takara公司公司) )在在2020 l l的反应体系中，的反应体系中，6 6 g g的的 DNA-DNA-HindHindIIIIII的分解物在的分解物在16160 0C C反应反应3030分钟时，分钟时，有有9090以上的以上的DNADNA片段进行连接的酶的活性为片段进行连接的酶的活性为1U1U。 相当于相当于 ATP-ATP-PpiPpi交换反应中交换反应中0.008 Weiss U0.008 Weiss U。对于对于T4-T4-噬菌体噬菌体DNADNA连接酶的活性测定至少有连接酶的活性测定至
9、少有三种以上的方法：三种以上的方法：连接反应的一项重要参数是温度。理论上连接反应的一项重要参数是温度。理论上讲连接反应的最佳温度是讲连接反应的最佳温度是37，此时连接，此时连接酶的活性最高。但酶的活性最高。但37时粘性末端分子形时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此人们找到了成的配对结构极不稳定，因此人们找到了一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即1216。DNA的连接主要有粘性末端和平端连接法，的连接主要有粘性末端和平端连接法，这些主要根据外源片段的末端性质、质粒这些主要根据外源片段
10、的末端性质、质粒性质以及两者的酶切位点来确定。性质以及两者的酶切位点来确定。 连接连接粘末端连接法粘末端连接法若若DNA插插入入片片段段与与适适当当的的载载体体存存在在同同源源粘粘性性末末端端，这这将将是是最最方方便便的的克克隆隆途途径径。同同源源粘粘性性末末端端包包括括相相同同内内切切酶酶产产生生的的粘粘性性末末端端和和不不同同的的内内切切酶酶产产生生的的互互补补粘粘性性末末端端。相相同同内内切切酶酶产产生生的的粘粘末末端端连连接接得得到到的的重重组组质质粒粒能能够够保保留留接接合合处处的的限限制制酶酶切切位位点点，因因此此可可以以使使用用原原来来酶酶将将插插入入片片段段从从重重组组体体上上
11、完完整整地地重重新新切切割割下下来来。而而不不同同酶酶产产生生的的粘粘性性末末端端连连接接得得到到的的重重组组质质粒粒不不能能够够保保留留接接合合处处的的限限制制酶酶切切位位点点，因因此此不不可可以以使使用用原原来来酶酶将将插插入入片片段段从从重重组组体体上上完完整整地地重重新新切切割割下下来来。以上两类粘性末端的连接方法都很重要。以上两类粘性末端的连接方法都很重要。另外，当用单酶切时，虽然产生了互补的粘性另外，当用单酶切时，虽然产生了互补的粘性末端，但由于载体存在自连现象，也会降低正末端，但由于载体存在自连现象，也会降低正确插入的频率。通过一些处理可以减少自连现确插入的频率。通过一些处理可以
12、减少自连现象的发生。常用的方法是用小肠碱性磷酸酶象的发生。常用的方法是用小肠碱性磷酸酶(CIP)去掉载体去掉载体5 -磷酸来达到抑制磷酸来达到抑制DNA片段的片段的自身环化的目的。自身环化的目的。综上所述，在进行基因重组时，一般采用插入综上所述，在进行基因重组时，一般采用插入片段及载体两端具有两个相应的能够产生粘性片段及载体两端具有两个相应的能够产生粘性末端的酶进行酶切后重组，如插入片段和载体末端的酶进行酶切后重组，如插入片段和载体的一端为的一端为EcoR I ，另一端为另一端为BamH I，它们都能它们都能产生粘性末端，不仅易于连接，而且又不能互产生粘性末端，不仅易于连接，而且又不能互补，所
13、以能够得到较好的重组结果。补，所以能够得到较好的重组结果。平端连接法：平端连接法：待插入片段的平末端主要由两方面来源，即由待插入片段的平末端主要由两方面来源，即由酶切后产生的平端和补平后产生的平端。一般酶切后产生的平端和补平后产生的平端。一般由酶切产生的平端较易连接。但在试验过程中，由酶切产生的平端较易连接。但在试验过程中，往往会遇到插入片段和载体之间没有互补的末往往会遇到插入片段和载体之间没有互补的末端，这时，就需要将末端进行端，这时，就需要将末端进行“补平补平”或去除或去除3 突出端，突出端，然后再用然后再用T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连连接酶连接两个平端。不过，平端连接的效率是比较低接两
14、个平端。不过，平端连接的效率是比较低的，一般通过提高的，一般通过提高DNA的浓度或增加连接酶的的浓度或增加连接酶的用量可提高平端的连接效率，有时也可采取用量可提高平端的连接效率，有时也可采取在在平端加上合成的接头平端加上合成的接头的方法，产生粘性末端，的方法，产生粘性末端，也可以提高连接的效率也可以提高连接的效率 。适当的插入片段与载体分子比率能适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般减少多拷贝插入片段的形成，一般采用载体：插入片段摩尔数为采用载体：插入片段摩尔数为1：2-3的比例。的比例。载体及插入片段的量载体及插入片段的量实验材料与仪器：实验材料与仪器：PCRPCR产物
15、产物(0.8kb(0.8kb，带有带有BamBamHIHI、 HinHindIIIdIII酶切位点酶切位点) )pBluescriptpBluescript KS KS 质粒质粒(3.0kb)(3.0kb)NEB 1kb NEB 1kb 标准分子量片段标准分子量片段BamBamHIHI、 HinHindIIIdIII限制酶及限制酶及 10K buffer10K buffer琼脂糖琼脂糖T4 DNA T4 DNA ligaseligase 及其缓冲液及其缓冲液(Takara)(Takara)TBETBE缓冲液缓冲液(10)(10)溴化乙啶染色液溴化乙啶染色液(10mg/ml)(10mg/ml)上
16、样液上样液(3)(3)电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等成像仪，一次性塑料手套等实验方法和步骤实验方法和步骤 PCRPCR产物的纯化产物的纯化-PCR-PCR产物以及空载体的产物以及空载体的酶切酶切-乙醇沉淀乙醇沉淀-电泳检测电泳检测-连接连接-16-160 0C C过夜过夜A 从从 PCR产产 物物 中中 直直 接接 回回 收收 纯纯 化化 DNA (Promega 公司公司) 1)直直接接加加100l纯纯化化缓缓冲冲液液于于1.5ml离离心心管管，再再加加入入30300l PCR反反应应物物，Vortex混混合；合；2)加加入入1ml树
17、树脂脂轻轻轻轻Vortex 3次次，每每次次间间隔隔1分钟；分钟；3)进入进入C步骤。步骤。DNA回收纯化步骤：回收纯化步骤：回收回收PCR产物常采用两中方法，即直接回收和产物常采用两中方法，即直接回收和从凝胶中回收，目前有许多公司出售相关的试从凝胶中回收，目前有许多公司出售相关的试剂盒剂盒。B 从琼脂糖凝胶回收纯化从琼脂糖凝胶回收纯化DNA1)用用琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶分分离离PCR片片段段，用用UV观察观察EB染色条带；染色条带；2)用用干干净净的的刀刀片片切切出出所所需需DNA条条带带，注注意意要要在在长长波波长长（300nm）UV灯灯下下操操作作，并并快快速速操操作作，以以免免损损伤伤D
18、NA。应应尽尽可可能能多多地地去去除除琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶，一一次次操操作可切取多至作可切取多至300mg的条带；的条带；3)将将300l (300mg) 琼琼脂脂糖糖条条片片转转移移至至1.5ml离离心心管管。直直接接在在70温温育育直直至至凝凝胶胶全全部部溶溶化化（一一般般可可按按公公司司提提供供的说明书进行）；的说明书进行）；4)加加1ml树树脂脂，彻彻底底混混合合20秒秒，但但不不用用Vortex；5)下接下接C步骤。步骤。C 纯化步骤纯化步骤 1)将将取取出出拉拉杆杆的的注注射射器器筒筒（3ml）装装在在纯纯化化柱柱上上，加加入入上上述述DNA与与树树脂脂混混合合液液，然然后后装装上
19、上拉拉杆杆，慢慢慢慢将将混混合合液液推推进纯化柱内；进纯化柱内；2)卸卸下下注注射射器器筒筒，拔拔出出拉拉杆杆，再再将将注注射射器器 筒筒 装装 上上 纯纯 化化 柱柱 ， 加加 2ml 80%的的Isopropanol, 然然后后装装上上拉拉杆杆，慢慢慢慢推推出液体以清洗柱子；出液体以清洗柱子；3)再再次次卸卸下下注注射射器器筒筒，将将纯纯化化柱柱装装在在1.5ml离离心心管管上上，10000g离离心心2 min，以以干干燥燥树树脂；脂；4)再再将将纯纯化化柱柱装装在在一一个个新新的的1.5ml离离心心管管上上，加加 50l水水 或或 TE缓缓 冲冲 液液 ， 1分分 钟钟 后后 ，1000
20、0g离心离心20秒，溶出秒，溶出DNA片段；片段；5)移移去去纯纯化化柱柱，将将纯纯化化出出的的DNA溶溶液液在在-20下保存备用。下保存备用。D 说明说明若若向向1ml树树脂脂中中加加入入500bp PCR产产物物50ng至至16g，其其回回收收率率可可在在95以以上上。同同样样500bp，若若从从低低溶溶点点琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中回回收收其其回回收收率率在在7090之间。之间。学生学生PCR实验结果实验结果(4 l)PCR 产物纯化后产物纯化后(相当于相当于0.8 l原原PCR产物）产物）pBluescript 酶切后酶切后PCR 纯化并酶切后纯化并酶切后(2 l)DNA重组重组本本实验
21、是将具有实验是将具有BamBamHIHI和和HindHindIIIIII粘性末端的基粘性末端的基因片段以及载体通过因片段以及载体通过DNADNA连接酶连接起来。连接酶连接起来。 方方法法1（酶酶切切后后乙乙醇醇沉沉淀淀，适适于于PCR产产物物的的重重组）：组）：1)在在 灭灭 菌菌 的的 Eppendorf 管管 中中 加加 入入 制制 备备pBluescript KS空空载载体体0.2-1g(针针对对本本实实验验，取取4 l约约800ng)，2 l 10酶酶切切缓缓冲冲液液， BamHI & HindIII酶酶各各1l（各各5单单位位），用用无无菌菌双双蒸蒸水水加加至至20l 反反应应体体系
22、系，于于37保保温温1-3h；2)在在另另一一管管中中加加入入待待插插入入的的DNA片片段段（纯纯化化的的PCR产产物物）0.2-1g(本本实实验验约约为为4-10l)，2l 10酶酶切切缓缓冲冲液液，HindIII 和和 BamHI酶酶各各1l（各各5单单位位），用用无无菌菌双双蒸蒸水水加加至至20l 反应体系，于反应体系，于3 7保温保温 1-3 h ；操作步骤操作步骤3)(根根据据实实验验情情况况而而定定，完完毕毕后后各各取取3l酶酶解解液液做做电电泳泳分分析析，观观察察酶酶解解是是否否完完全全）将将酶酶解解液液加加入入2倍倍体体积积的的100乙乙醇醇以以及及1/10体体积积 的的 3M
23、 NaAC(pH=5.2)， 置置 -20冰冰 箱箱 30min。4oC，12,000rmin离离心心 10 min，弃弃上上清清，加加入入100 l 70乙乙醇醇(洗洗涤涤沉沉淀淀物物)，离离心心去去上上清清，室室温温干干燥燥DNA 沉沉淀淀15分分钟钟左左右右，加加入入 10 l 水水或或TE缓缓冲冲液液溶溶解解DNA；4)完完毕毕后后各各取取2l DNA做做电电泳泳分分析析，0.8%琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶，进进行行初初步步定定量量（同同时时还还可可以以观观察载体的酶切结果）。察载体的酶切结果）。5)将酶切后的将酶切后的 2个个DNA片段（有时需要在片段（有时需要在70oC加热加热15分钟使
24、酶失活及酚氯仿抽提分钟使酶失活及酚氯仿抽提），然后按载体：待插入然后按载体：待插入DNA片段片段1：2（摩尔）混合于一管中（载体可用（摩尔）混合于一管中（载体可用50-100ng，对于本实验约对于本实验约1 l载体，载体，2 l DNA片段，根据电泳结果来判断片段，根据电泳结果来判断 ） ，加，加入入T4 DNA连接酶缓冲液连接酶缓冲液1l，最后加最后加T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶1l(5单位单位)，一般掌，一般掌握在总体积握在总体积10 l，于于16保温保温 1416h（过夜），过夜）， 应迅速作转化实验，如应迅速作转化实验，如遇到特殊情况，可先置于遇到特殊情况，可先置于-20oC保存。保存。 然后，通过转化细菌来鉴定反应连接产然后，通过转化细菌来鉴定反应连接产物。物。将质粒按照方法将质粒按照方法1所述过程进行酶切、电所述过程进行酶切、电泳鉴定，然后将酶切后的载体以及目的片泳鉴定，然后将酶切后的载体以及目的片段从凝胶中回收纯化，将纯化后的产物按段从凝胶中回收纯化，将纯化后的产物按载体：待插入载体：待插入DNA片段片段1：2（摩尔）（摩尔）混合于一管中，之后按方法混合于一管中，之后按方法1中的过程进中的过程进行连接、转化等。行连接、转化等。方法方法2 （需要酶切后纯化，可以用于从一个质粒亚克隆需要酶切后纯化，可以用于从一个质粒亚克隆到另一个质粒到另一个质粒） ：
