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1、实验一单菌株发酵产纤维素酶的研究本章利用实验室筛选的三株产纤维素酶菌株,用水稻秸秆稻草做培养基的主要碳源,进行了单菌株发酵产酶试验,并对其中的高产菌株进行了发酵条件优化。实验流程实验准备 (试剂配备，稻草预处理，葡萄糖标准曲线的制作)菌种显微及菌落形态观察发酵种子液制备接种发酵串珠霉、链霉菌、枝抱菌发酵初始产酶活力比较通过测定发酵后的试液的OD 值，通过查葡萄糖标准曲线确定生成复原糖的含量，计算酶活串珠霉发酵条件优化(单因素实验 )筛选影响产酶的重要因素(PB 设计法 )重要因素的响应面分析(BB 设计法 )结果分析 解释实验图与分析表小结名词解释本实验选取了三种菌，链霉菌、枝抱菌(clado
2、sPorium) 、串珠霉 (Monilia) 。链霉菌是放线菌目的一科。枝孢菌是一种能够产生分生孢子的霉菌串珠霉无性世代为半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丝孢科，链孢霉属(Monilia)。CMC-Na( 羧甲基纤维素钠是天然纤维素经化学改性后得到的纤维素衍生物，是纤维素的羧甲基醚化物，是盐。用于 CMC 酶活力的测定。单因素实验： 实验中，只有一个因素在变化，其余的因素保持不变的试验叫做单因素试验。做单因素试验时为正交试验做准备，为正交实验提供一个合理的数据范围。本实验中，对串珠霉的优化过程中，为了得到最正确发酵条件，依次确定一个变量，其他因素保持不变。PB 设计法是SAS 统计软件中的一种二
3、水平设计法。它能通过实验设计、多元二次回归方程及对回归方程的分析,最终寻找出多因素系统中最正确条件瞬一6习。 SAS 中的PB 设计法能用最少试验次数,从众多因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素。BB 设计BB 设计法提出的中心组合设计是常用的SAS 分析方法 ,适用于 2至5个因素的优化实验 67l。由 PB 实验得出稻草、鼓皮添加量及pH 值是影响纤维素酶活的主要因素 ,在此基础上 ,利用 BB 设计法对这三个因素进行了响应面分析。此法每个因素取3个水平 ,以1,O,l) 编码 ,然后对数据进行二次回归拟合,得到带交互项和平方项的二次方程,分析各因素的主效应和交互效应,最后在一定的水平
4、范围内求出最正确值。注意事项1 稻草为什么用碱处理？在热的稀硫酸作用下，样品中的糖、淀粉、果胶质和半纤维素经水解而除去，再碱处理使蛋白质溶解、脂肪皂化而除去，所得的残渣即为粗纤维。如其中含有无机物质，可经灰化后扣除。样品经热的中性洗涤剂浸煮后，残渣用热蒸馏水充分洗涤，样品中的糖、游离淀粉、蛋白质、果胶等物质被溶解除去，然后加入-淀粉酶溶液以分解结合态淀粉，再用蒸馏水、丙酮洗涤，以除去残存的脂肪、色素等，残渣经烘于，即为精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 5 页不溶性膳食纤维中性洗涤纤维。2 葡萄糖标准曲线的绘制a 配置不同葡
5、萄糖含量的溶液，为纤维素酶的活性测定提供依据。纤维二糖酶 (CBH 酶)活力的测定方法从纤维素酶解机制上考虑,应以纤维二糖为底物酶解后测葡萄糖生成量表征酶活力。内切型B 一1一4葡聚糖酶 (CMC 酶)活力的测定方法以磷酸膨胀纤维素、梭甲基纤维素或轻乙基纤维素等无定形纤维素为底物,以复原糖生成量表征酶活力。俗称CMCase 或Cx 酶活力。b 混合液由一定浓度的葡萄糖和DNS 构成，加热 5分钟，葡萄糖与DNS3-5 二硝基水杨酸反应，复原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5- 二硝基水杨酸则被复原为棕红色的3-氨基 -5-硝基水杨酸。在一定范围内，复原糖的量与棕红色物质颜色的深浅
6、成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中复原糖和总糖的含量。实验中加10毫升水，在于稀释反应液，使OD 数值在可测范围内。cOD 是 opticaldensity 光密度 的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度 ，是检测方法里的专有名词，检测单位用OD 值表示， OD=lg 1/trans ，其中 trans 为检测物的透光值。光通过被检测物，前后的能量 差异即是被检测物吸收掉的能量 ，特定 波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量 成定量关系 。实验二双菌株混合发酵产纤维素酶的研究。本章利用实验室筛选的链霉菌、枝抱菌、 串珠霉三株产纤维素酶
7、菌进行了双菌株混合发酵试验 ,并对产酶高的组合菌株进行了混合发酵的工艺优化研究。在实验一的基础上，1，进行混合优化实验，为单因素实验.串珠霉与枝袍菌混合发酵条件优化试验为真菌与真菌混合二菌混合方式对混合发酵产酶的影响，二菌株不同生长期培养液混合，二菌混合发酵时间，二菌接种比例.串珠霉与链霉菌混合发酵条件优化试验，为真菌与放线菌混合二菌混合方式，温度转换时期，起始PH 值，接种比例，发酵时间枝抱菌与链霉菌混合发酵条件优化试验，为真菌与放线菌混合混合方式 为什么只进行了混合方式的实验，实验结果说明两者2筛选影响串珠霉与链霉菌混菌发酵产酶的重要因素利用 SAS 中 PB 设计法 ,从稻草、鼓皮含量、
8、豆饼粉、起始pH、发酵时间、链霉菌:串珠霉接种比例中筛选出影响发酵产纤维素酶活的重要因素。3影响串珠霉与链霉菌混菌发酵重要因素的响应面分析利用 SAS 中 Box 一 Behnken设计法对筛选出的重要因素进行响应面分析,得出各因素的主效应和交互效应,求出对串珠霉发酵产酶影响重要因素的最正确水平值。实验三单菌与混菌发酵液纤维素酶提取纯化及酶系分析精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 5 页纤维素酶是具有多种不同底物特异性的多酶系复合物酶,由于菌种及发酵培养方式不同,其产生的纤维素酶组分也不相同,结果就形成了各自的纤维素降解酶系
9、。从理化性能上看,不同的纤维素酶组分具有不同的分子量、等电点、分子形状和不同的酶学活性,本章通过盐析、层析、电泳的方法来探索菌与菌之间、混菌发酵与单菌发酵之间产纤维素酶酶系的区别。实验步骤盐析层析电泳实验准备 常用试剂配制，发酵液制备 过滤得粗酶液酶活测定蛋白质标准曲线制定硫酸钱盐析法提取纤维素酶离心后加入DNS 终止反应，测定酶活，根据盐析沉淀蛋白中的酶活力及所含的蛋白量比值确定最正确的硫酸钱盐析浓度。丙酮沉淀透析凝胶过滤层析课上讲过9sDs 一 pAGE 聚丙烯酸胺凝胶电泳微生物检测技术讲过结果分析6种类型发酵液硫酸钱不同饱和度盐析结果串珠霉发酵液不同饱和度硫酸按盐析链霉菌发酵液不同饱和度
10、的硫酸钱盐析精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 5 页6种结果，对 6张图的描述，6个分析是关键6种类型盐析酶液S即 had。xG 一75分子筛凝胶过滤层析结果串珠霉发酵酶液层析结果取经盐析、丙酮处理、再经透析、浓缩后的串珠霉酶液1.smL 上层析柱。检测所得各管溶液在280lun 及545nm 处的 OD 值,结果见图 4.8及表 4.2。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 5 页和许仙他们的差不多6类发层析液sDs 一 pAGE 聚丙烯酞胺凝胶电泳结果
11、:蛋白质含量的测定考马斯亮兰G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置max ，由465nm变为 595nm ，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595 ，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：1灵敏度高，据估计比Lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry 法要大的多。2测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测
12、定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20 分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry 法那样费时和严格地控制时间。3干扰物质少。如干扰Lowry 法的 K+、Na+ 、Mg2+ 离子、 Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。此法的缺点是：1由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。2仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100 、十二烷基硫酸钠 SDS 和 0.1N 的 NaOH 。 如同 0.1N 的酸干扰Lowary 法一样。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 5 页
