雾化吸入疗法PPT演示课件

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1、1 蛋白质的化学蛋白质的化学.2第一节第一节 Pr-生命的物质基础生命的物质基础一、一、Pr-生物体基本成分生物体基本成分 蛋白质（蛋白质（protein, Pr）普遍存在）普遍存在 构成细胞组织构成细胞组织 占人固体量占人固体量45%（表（表4-1） 二、二、Pr具有多样性的生物学功能具有多样性的生物学功能 生命现象和生理活动往往是通过生命现象和生理活动往往是通过Pr来实现。来实现。 1.生物催化作用；生物催化作用； 2.代谢调节作用；代谢调节作用； 3.免疫保护作用；免疫保护作用； 4.转运和储存作用；转运和储存作用； 5.运动支持作用；运动支持作用； 6.控制生长和分化；控制生长和分化；

2、 7.接受和传递信息作用；接受和传递信息作用； 8.生物膜的功能。生物膜的功能。.3第二节第二节 蛋白质的化学组成蛋白质的化学组成一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的元素组成 含有含有C、H、O、N、S、P、Fe、Mo、I、Zn。 氮含量恒定氮含量恒定1319%，平均为，平均为16%。 据此据此, 可定氮测定可定氮测定样品中样品中Pr的含量的含量。 Pr含量含量含氮量含氮量100/16(6.25).4二、二、Pr 结构的基本单位氨基酸结构的基本单位氨基酸 氨基酸（氨基酸（amino acid, AA） 天然的天然的AA约约180种；种； 组成蛋白质有组成蛋白质有20余种称之为基本余种称之为基本AA

3、(编码编码AA）（一）（一）AA的结构的结构 化学结构通式：化学结构通式： COOH H2N C H R(不同不同AA各异）各异） 侧链基团侧链基团.5AA结构特点结构特点： 1.基本基本AA为为AA，脯，脯AA为为亚氨基酸亚氨基酸 2.不同不同AA，R侧链不同侧链不同 3.除甘氨酸（除甘氨酸（R=H)外，其余外，其余AA的的C为不对称为不对称碳原子，具旋光性，有构型。碳原子，具旋光性，有构型。 除甘氨酸外，基本除甘氨酸外，基本AA均为均为L- AA。 AA名称可用英文三字符或一字符表示名称可用英文三字符或一字符表示.6DAA存在于抗生素或植物生物碱中，脑中有些存在于抗生素或植物生物碱中，脑中

4、有些游离的游离的DAA存在，但不参与存在，但不参与Pr合成。合成。.7（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类 以以R侧链基团侧链基团的结构性质为的结构性质为分类基础分类基础1.非极性非极性R基基AA：R基为疏水性的基为疏水性的 丙、缬丙、缬 、亮、异亮、甲硫（蛋）、苯丙、脯、色、亮、异亮、甲硫（蛋）、苯丙、脯、色2.极性不带电荷极性不带电荷R基基AA： 丝、苏、酪、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸丝、苏、酪、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸3.带负电荷带负电荷R基基AA：酸性：酸性AA：天冬、谷：天冬、谷4.带正电荷带正电荷R基基AA：碱性：碱性AA：赖、精、组：赖、精、组蛋白质中其他蛋

5、白质中其他AA：无翻译密码，：无翻译密码，Pr合成后加工而成的：羟脯合成后加工而成的：羟脯（Hyp)、羟赖、羟赖(Hyl)、胱氨酸、胱氨酸、T4（四碘甲腺原氨酸）（四碘甲腺原氨酸）非蛋白质非蛋白质AA：不存在于：不存在于Pr中，游离形式存在。中，游离形式存在。 丙氨酸、丙氨酸、D-苯丙氨酸、同型半胱氨酸、苯丙氨酸、同型半胱氨酸、氨基丁酸等等氨基丁酸等等 .8丙氨酸丙氨酸 alanine Ala A 6.00缬氨酸缬氨酸 valine Val V 5.96亮氨酸亮氨酸 leucine Leu L 5.98 异亮氨酸异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02 苯丙氨酸苯丙氨酸 pheny

6、lalanine Phe F 5.48脯氨酸脯氨酸 proline Pro P 6.301.非极性非极性R基基AA： 蛋氨酸蛋氨酸 methionine Met M 5.74色氨酸色氨酸 tryptophan Try W 5.89.9甘氨酸甘氨酸 glycine Gly G 5.97丝氨酸丝氨酸 serine Ser S 5.68 苏氨酸苏氨酸 threonine Thr T 5.60酪氨酸酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66 半胱氨酸半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07天冬酰胺天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41 谷氨酰胺谷氨酰胺 glutamine G

7、ln Q 5.652.极性不带电荷极性不带电荷R基基AA.10天冬氨酸天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97谷氨酸谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22赖氨酸赖氨酸 lysine Lys K 9.74精氨酸精氨酸 arginine Arg R 10.76组氨酸组氨酸 histidine His H 7.593. 酸性氨基酸酸性氨基酸4. 碱性氨基酸碱性氨基酸.11（三）氨基酸的分离与分析（三）氨基酸的分离与分析 测定蛋白质分子组成和结构的基础测定蛋白质分子组成和结构的基础分离方法分离方法：溶解度法、等电点法、特殊试剂沉淀法、溶解度法、等电点法、特殊试剂沉淀

8、法、离子交换法离子交换法1.1.离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析： 利用离子交换剂对不同利用离子交换剂对不同AA吸附能力的差异吸附能力的差异进行分离。进行分离。 在一定条件下，各种在一定条件下，各种AA所带的电荷性质和数量不同，所带的电荷性质和数量不同，而与离子交换剂的亲和力各异，控制条件将它们逐个而与离子交换剂的亲和力各异，控制条件将它们逐个分离，然后进行定性和定量的分析。分离，然后进行定性和定量的分析。阴离子交换树脂：本身带正电荷可与负电荷物质结合；阴离子交换树脂：本身带正电荷可与负电荷物质结合；阳离子交换树脂：本身带负电荷可与正电荷物质结合阳离子交换树脂：本身带负电荷可与

9、正电荷物质结合.122.2.自动氨基酸分析仪：自动氨基酸分析仪：自动氨基酸分析仪：自动氨基酸分析仪：准确测定蛋白质样品中各种准确测定蛋白质样品中各种AA量量 先酸水解获得水解液（游离先酸水解获得水解液（游离AA），再进行柱层析），再进行柱层析（离子交换），用不同（离子交换），用不同pH和离子强度的缓冲液进行梯度和离子强度的缓冲液进行梯度洗脱，分离。全过程由计算机控制完成。洗脱，分离。全过程由计算机控制完成。.133. 高效液相色谱高效液相色谱 固定相表面积大（颗粒细）；溶剂系统高固定相表面积大（颗粒细）；溶剂系统高压，洗脱速度快。替代多种柱层析系统。压，洗脱速度快。替代多种柱层析系统。 用于蛋

10、白质分析、制备等用于蛋白质分析、制备等.144.生物质谱生物质谱 质谱质谱mass spectrometry，MS：带电原子、分子或分：带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小排列的子碎片按质荷比（或质量）的大小排列的图谱图谱 基本原理：基本原理：AA（或肽）分子在质谱的离子化室中轰出后（或肽）分子在质谱的离子化室中轰出后被电离，所生成的各种正离子碎片在高压电场中加速，被电离，所生成的各种正离子碎片在高压电场中加速，经过磁场时被偏转经过磁场时被偏转. 通过改变加速电压或磁场强度，通过改变加速电压或磁场强度，可只允许某一质可只允许某一质荷比的离子通过出口狭缝，被离子捕获器收集荷比的离子通

11、过出口狭缝，被离子捕获器收集，经过信，经过信息的放大处理，记录成条状的质谱图，与标准样品质谱息的放大处理，记录成条状的质谱图，与标准样品质谱图对照，得到未知样品的结构信息。图对照，得到未知样品的结构信息。.15第三节第三节 蛋白质分子结构蛋白质分子结构 一、蛋白质的一级结构一、蛋白质的一级结构primary structure 共价结构或基本结构共价结构或基本结构蛋白质的一级结构是指由不同种类、数量的氨基酸，通过肽键而构成的排列顺序。为蛋白质结为蛋白质结构与功能的基础。构与功能的基础。.16（一）肽键和肽链（一）肽键和肽链 1.肽键肽键（peptide bond）：又称酰胺键）：又称酰胺键“-

12、CO-NH” 由一分子由一分子AA的的 羧基羧基与另一与另一AA的的氨基氨基缩合脱水而成。缩合脱水而成。.172.肽链肽链：polypeptide chain AA通过通过肽键肽键相连的相连的化合物化合物 两个两个AA组成为二肽；三个组成为二肽；三个AA组成为三肽；依组成为三肽；依此类推。此类推。 10各以上各以上AA组成的肽组成的肽多肽多肽 肽链中的氨基酸部分已肽链中的氨基酸部分已不完整不完整，所以称之为，所以称之为 氨基酸残基氨基酸残基.18肽链特点：肽链特点：（1)共价主链共价主链：多肽链骨干为：多肽链骨干为AA羧基羧基与（另一）与（另一）AA的的氨基氨基形成的形成的肽键肽键规则规则重复

13、排列而成。重复排列而成。 侧链侧链：R基部分基部分.19肽链特点：肽链特点：（2)结构方向性：结构方向性： 一条多肽链有两个末端一条多肽链有两个末端 氨基末端（氨基末端（N端）端）：含自由：含自由氨基的一端；氨基的一端； 羧基末端（羧基末端（C端端）：含自由）：含自由羧基的一端。羧基的一端。 （3)书写命名习惯：书写命名习惯： N端在左；端在左；C端在右端在右。命名亦是从左到右。命名亦是从左到右。 （4)一种排列即为一种蛋白质，所以自然界虽只一种排列即为一种蛋白质，所以自然界虽只有二十种有二十种AA却构成了繁多的蛋白质种类却构成了繁多的蛋白质种类.20.21Pr或多肽或多肽 AA残基数残基数

14、Pr或多肽或多肽 AA残基数残基数加压素加压素 9 干扰素干扰素 166胰高血糖素胰高血糖素 29 血红蛋白血红蛋白 574 胰岛素胰岛素 51 球蛋白球蛋白 1250 核糖核酸酶核糖核酸酶 124 FA合成酶合成酶 20000 烟草花叶病毒烟草花叶病毒 33650 蛋白质一级结构的稳定力量蛋白质一级结构的稳定力量肽键肽键 （有人认为二硫键亦属）（有人认为二硫键亦属） 自然界存在自然界存在无分支的开链多肽，环状多肽等无分支的开链多肽，环状多肽等。.22（二）蛋白质一级结构测定原理（二）蛋白质一级结构测定原理1.AA组成的分析：组成的分析： 包括样品纯化、多肽链数目测定、包括样品纯化、多肽链数目

15、测定、AA组成的分析组成的分析（水解后，自动分析仪测定）。（水解后，自动分析仪测定）。2.N末端末端AA分析：确定多肽链数目，分析：确定多肽链数目，AA排列顺序的测定。排列顺序的测定。 （1)二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（DNFB)： N末端与末端与DNFB反应，生成反应，生成DNP多肽衍生物（其对多肽衍生物（其对酸稳定性高）。肽链再经酸水解后，酸稳定性高）。肽链再经酸水解后，DNPAA（N末末端）用有机溶剂提取分离，用层析进行定量或定性。端）用有机溶剂提取分离，用层析进行定量或定性。 （2)二甲氨基萘磺酰氯法（二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl）：）：基本同前。基本同前。 DNS法生成的法生成的

16、N端端AA具强烈荧光，灵敏度高，可直接测定。具强烈荧光，灵敏度高，可直接测定。 经酸水解，不能重复应用。经酸水解，不能重复应用。.23二甲氨基萘磺酰氯；丹（磺）酰氯二甲氨基萘磺酰氯；丹（磺）酰氯.24(3) Edman降解法降解法：仅释放：仅释放N末端残基末端残基 特点：特点： 苯异硫氰（苯异硫氰（PITC）与肽的）与肽的N末端氨基反应，碱末端氨基反应，碱性条件下（性条件下（pH9.09.5)生成苯氨基硫甲酰基衍生物生成苯氨基硫甲酰基衍生物（PTC肽），酸性中经裂解，环化为肽），酸性中经裂解，环化为PTHAA和和剩剩余多肽余多肽，抽提后鉴定。，抽提后鉴定。.253.C末端末端AA的分析（较前法

17、误差大的分析（较前法误差大）（1）肼解法）肼解法 多肽与无水肼加热发生肼解，经处理，多肽与无水肼加热发生肼解，经处理，C末端末端AA以游离形式释出后在上清液，而其他氨基酸则形以游离形式释出后在上清液，而其他氨基酸则形成沉淀，用成沉淀，用DNFB法或法或DNS法及层析鉴定法及层析鉴定（2)羧肽酶法：羧肽酶法： 肽链外切酶，特异水解肽链外切酶，特异水解C-末端末端AA，常用，常用 羧肽酶羧肽酶A：水解脂肪族或芳香族：水解脂肪族或芳香族AA构成之构成之C末端；末端； 羧肽酶羧肽酶B：水解碱性：水解碱性AA构成之构成之C端。端。（4）氨肽酶法）氨肽酶法：肽键外切酶。：肽键外切酶。 从肽链的从肽链的N端

18、开始逐个切掉端开始逐个切掉AA。由于酶水解速。由于酶水解速度不同而使用受限。度不同而使用受限。.264.大分子多肽大分子多肽AA顺序的确定顺序的确定 大分子需更复杂的步骤。大分子需更复杂的步骤。 先将大分子多肽裂解为小片段，分离纯化测序。先将大分子多肽裂解为小片段，分离纯化测序。 裂解法：化学裂解法，酶解法。裂解法：化学裂解法，酶解法。 可根据裂解方法特点选择多种结合，综合分析，推可根据裂解方法特点选择多种结合，综合分析，推导出肽链中导出肽链中AA排列顺序。排列顺序。 另有：另有：X线结构分析法；线结构分析法； 气质谱连用法；气质谱连用法；核酸推导核酸推导法法（最有效）对蛋白质一级结构进行测定

19、。（最有效）对蛋白质一级结构进行测定。.27二、蛋白质的构象二、蛋白质的构象conformation （ 空间结构、立体结构、高级结构、三维构象）空间结构、立体结构、高级结构、三维构象） 指蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列、分布及肽链的走向 以一级结构为基础以一级结构为基础 空间构象为蛋白质生物活性、功能所必需空间构象为蛋白质生物活性、功能所必需.28（一）维持蛋白质构象的化学键（稳定力量）一）维持蛋白质构象的化学键（稳定力量） 主要是次级键（副键）主要是次级键（副键） 键能小，稳定性差，但数量众多，使其在键能小，稳定性差，但数量众多，使其在Pr的空的空间构象的稳定性中起重要作用间构象

20、的稳定性中起重要作用1.氢键氢键(=OH-）；）；2.疏水键；疏水键；3.盐键（离子键）；盐键（离子键）；4.配位键配位键(与金属离子）；与金属离子）；5.二硫键二硫键(-s-s-)；6.范德华引力。范德华引力。 Van der Waals.29（二）蛋白质的二级结构（二）蛋白质的二级结构 secondary structure 多肽链中主链骨架中若干肽单位各自形成局部的多肽链中主链骨架中若干肽单位各自形成局部的多肽链中主链骨架中若干肽单位各自形成局部的多肽链中主链骨架中若干肽单位各自形成局部的有一定规则的结构。有一定规则的结构。有一定规则的结构。有一定规则的结构。 稳定力量：氢键稳定力量：氢

21、键 形式：形式： 螺旋、螺旋、折叠、折叠、拐角、无规卷曲拐角、无规卷曲.301.肽单位（肽平面）肽单位（肽平面）peptide unit 肽键与相邻的两个肽键与相邻的两个 碳原子所组成的基团（形成构象）碳原子所组成的基团（形成构象）特性特性（1）肽键具有双键性质，不能自由旋转）肽键具有双键性质，不能自由旋转 （2) 肽单位为肽单位为刚性平面结构刚性平面结构即六个原子位于同一平面上即六个原子位于同一平面上 （3) 与与CN相连的相连的H和和O与两个与两个碳原子反向分布碳原子反向分布 .312. 螺旋（螺旋（ helix） Pr中多个肽平面通过中多个肽平面通过AA- 碳原子的旋转碳原子的旋转, 多

22、肽链多肽链的主骨架沿中性轴盘曲成稳定的的主骨架沿中性轴盘曲成稳定的 螺旋构象。螺旋构象。结构特征结构特征：（1）右手螺旋，每）右手螺旋，每3.6个个AA旋转一周，螺距为旋转一周，螺距为0.54nm，肽平面与螺旋长轴平行，肽平面与螺旋长轴平行（2)氢键为主要次级键：氢键为主要次级键： 相邻（相邻（1-4）肽平面上的）肽平面上的N-H和和CO生成氢键生成氢键（3）AA残基的残基的R基团分布在螺旋外侧基团分布在螺旋外侧 R基团影响螺旋稳定性：酸（碱）性基团影响螺旋稳定性：酸（碱）性AA连续，或较连续，或较大的大的R基团，基团，N原子无原子无H游离（脯）均不能形成螺旋游离（脯）均不能形成螺旋.32.3

23、33.折叠结构（折叠结构（ pleated sheet structure） 又称又称片层结构片层结构结构特征：结构特征：（1）肽链的伸展使肽键平面之间折叠成）肽链的伸展使肽键平面之间折叠成锯齿状锯齿状；（2) 肽链平行排列，肽链平行排列，相邻肽链之间的肽键相邻肽链之间的肽键交替形成交替形成氢键氢键氢键氢键 为维持构象的主要次级键为维持构象的主要次级键（3)肽链平行走向有顺式和反式两种，肽链平行走向有顺式和反式两种，N端同侧为顺式，端同侧为顺式， 不在同侧为反式；不在同侧为反式；（4)AA残基的残基的R基团在片层的上下基团在片层的上下.344.折角（转角）（折角（转角）（ -bend） 伸展的

24、肽链形成伸展的肽链形成180回折回折U型转折结构型转折结构 由连续的四个由连续的四个AA残基构成，残基构成， 第一个第一个AA残基残基的的O与与 第四第四个个AA残基残基的的N-H形成氢键。形成氢键。这一段结构往往第二个这一段结构往往第二个AA残残基为基为Pro（亚氨酸）。（亚氨酸）。5. 无规线团（卷曲）无规线团（卷曲）random coil 除上述构象外的不规则构象（自由折叠或无规线团）除上述构象外的不规则构象（自由折叠或无规线团） 一种蛋白质的二级结构并非单纯的一种蛋白质的二级结构并非单纯的 螺旋或螺旋或折叠，折叠，由不同类型的组合。由不同类型的组合。.35（三）超二级结构（三）超二级结

25、构：模块或模序：模块或模序(motif) 在多肽链内顺序上相邻的二级结构常常在空间折叠在多肽链内顺序上相邻的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成有规则的二级结构聚集中靠近，彼此相互作用，形成有规则的二级结构聚集体。如：体。如：、等。等。 .36（四）结构域（四）结构域domain 是位于超二级结构与三级结构间的一个层次。是位于超二级结构与三级结构间的一个层次。 在在较大的蛋白质分子中，多肽链上相邻的超二级结构较大的蛋白质分子中，多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，进一步折叠形成一个或多个相对独立的紧密联系，进一步折叠形成一个或多个相对独立的致密三维实体。致密三维实体。 每个结构域由每

26、个结构域由100200AA残基组成，各有独特残基组成，各有独特的空间结构，并担负不同的生物学功能。的空间结构，并担负不同的生物学功能。 较大的蛋白质有多个结构域，可以是相似的，也可较大的蛋白质有多个结构域，可以是相似的，也可能是完全不同的。能是完全不同的。 IgG由由12个结构域组成个结构域组成 .37.38（五）蛋白质的三级结构（五）蛋白质的三级结构tertiary structure多肽链中所有原子或基团的在三维空间的整体排布多肽链中所有原子或基团的在三维空间的整体排布。稳定三级结构的次级键：稳定三级结构的次级键：疏水键、氢键、盐键疏水键、氢键、盐键.39（六）蛋白质的四级结构（六）蛋白质

27、的四级结构 quarternary structure 由两个或两个以上的亚基之间相互作用，彼此以由两个或两个以上的亚基之间相互作用，彼此以非共价键非共价键相连而形成更复杂的构象。相连而形成更复杂的构象。1.亚基（又称亚单位，亚基（又称亚单位，subunit）:四级结构中具独立三级四级结构中具独立三级结构的多肽链结构的多肽链寡聚体寡聚体寡聚体寡聚体oligomeroligomer：210个亚基组成的具有四级结构的个亚基组成的具有四级结构的Pr。 更多的亚基数目则称更多的亚基数目则称多聚体（多聚体（多聚体（多聚体（polymerpolymer）2.亚基间结合力：疏水键亚基间结合力：疏水键、盐键、

28、氢键、范德华力、二硫、盐键、氢键、范德华力、二硫键键.40.41蛋白质的四级结构小结图示如下：蛋白质的四级结构小结图示如下：motifdomain.42三、蛋白质和多肽合成的基本原理三、蛋白质和多肽合成的基本原理 （一）化学合成法的基本原理（一）化学合成法的基本原理 一级结构的阐明使得合成某些特定的一级结构的阐明使得合成某些特定的Pr成为可能。成为可能。 1.AA基团保护基团保护： 合成过程中将不该参加反应的基团加以封闭或保合成过程中将不该参加反应的基团加以封闭或保护，以减少副反应的发生。护，以减少副反应的发生。条件条件：合成肽时保护起来，合成后易除去，并不引起：合成肽时保护起来，合成后易除去

29、，并不引起肽链的断裂。肽链的断裂。 氨基保护氨基保护： 苄氧羰酰氯（苄氧羰酰氯（Cbz-Cl），叔丁羰酰氯（），叔丁羰酰氯（BOC-Cl) 羧基保护羧基保护：醇酯化：醇酯化.432.多肽的液相合成多肽的液相合成（1) AA的基团的保护的基团的保护（2) 接肽缩合反应：接肽缩合反应： 接肽缩合剂：接肽缩合剂：N,N-二环已基碳二亚胺（二环已基碳二亚胺（DCCI) （3) 肽合成：将基团保护剂除去，分离纯化。肽合成：将基团保护剂除去，分离纯化。 .44.453.多肽的固相合成多肽的固相合成 .46（二）采用生物技术合成蛋白质（二）采用生物技术合成蛋白质 现代生物技术发展为蛋白质的生物合成提供了新兴

30、的现代生物技术发展为蛋白质的生物合成提供了新兴的极为重要的有效手段。极为重要的有效手段。1.基因工程基因工程 genetic engineering（DNA重组）重组） 利用利用DNA重组技术合成蛋白质类药物愈来愈多，如胰岛素、重组技术合成蛋白质类药物愈来愈多，如胰岛素、生长激素、生长激素、EPO、白介素等。、白介素等。生物反应器：转基因动物生物反应器：转基因动物 将目标基因导入动物的受精卵或单卵胚胎细胞并在动物体将目标基因导入动物的受精卵或单卵胚胎细胞并在动物体内正常表达，从其体液与组织中分离外源基因的表达产物（细内正常表达，从其体液与组织中分离外源基因的表达产物（细胞因子等）胞因子等）优点

31、：不干扰动物的正常代谢；从体液（奶）中易于提取纯产品；优点：不干扰动物的正常代谢；从体液（奶）中易于提取纯产品；基因表达可精确控制；产量高。基因表达可精确控制；产量高。.472.细胞工程细胞工程 cell engineering 细胞为构成生命的基本单位。可自身合成蛋白质。细胞为构成生命的基本单位。可自身合成蛋白质。 用细胞融合技术建立可合成制备许多蛋白质类药物用细胞融合技术建立可合成制备许多蛋白质类药物（单克隆抗体，（单克隆抗体，EPO，干扰素等），干扰素等）3. 酶工程酶工程 enzyme engineering 应用酶的特异性催化作用制备目标产物的工艺过程应用酶的特异性催化作用制备目标产

32、物的工艺过程优点：酶反应专一，效率高。优点：酶反应专一，效率高。.48第四节第四节 蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能一、一、Pr的一级结构与功能的关系的一级结构与功能的关系1.1.一级结构不同，生物学功能各异一级结构不同，生物学功能各异 不同不同PrPr结构间仅有微小的差别就可表现出不同的结构间仅有微小的差别就可表现出不同的生物学功能。生物学功能。 加压素（升压、抗利尿）与催产素（子宫平滑肌收缩）均加压素（升压、抗利尿）与催产素（子宫平滑肌收缩）均为为9 9肽激素，结构中仅有肽激素，结构中仅有2 2个个AAAA有差异。有差异。.492.一级结构中一级结构中“关键关键”部分相同，其功能也相同

33、；关部分相同，其功能也相同；关键部分变化影响其功能。键部分变化影响其功能。 来源不同的促肾上腺皮质激素（来源不同的促肾上腺皮质激素（ACTH），存），存在结构差异，但在肽链的在结构差异，但在肽链的124位位AA残基顺序相同，残基顺序相同，所以表现出相同的生物学活性。促黑激素（所以表现出相同的生物学活性。促黑激素（ MSH ）亦是。）亦是。 说明，其活性仅需所必需的关键部分。说明，其活性仅需所必需的关键部分。3一级结构的变化与疾病的关系一级结构的变化与疾病的关系 基因突变导致基因突变导致Pr的一级结构改变，使其功能降的一级结构改变，使其功能降低或丧失。低或丧失。分子病分子病：分子水平上的改变（碱

34、基突变）而导致的疾病。分子水平上的改变（碱基突变）而导致的疾病。.50镰刀形红细胞贫血：镰刀形红细胞贫血： HbA 肽链（正常）肽链（正常） N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-GluC(146) HbS 肽链肽链 N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-GluC(146)这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称分子病分子病。还有糖尿病胰岛素分子病还有糖尿病胰岛素分子病(B链链Thr27-Leu).51二、的空间构象与功能的关系二、的空间构象与功能的关系 特定空间构象与生物学活性密切相关特定空间构象与生物学活性密切相关前体的活

35、化前体的活化一些蛋白质以无活性的蛋白质原的前体形式分泌合成。一些蛋白质以无活性的蛋白质原的前体形式分泌合成。经活化后（如酶解部分片段），使活性升高或具有活性。经活化后（如酶解部分片段），使活性升高或具有活性。实质是：特定空间构象的形成实质是：特定空间构象的形成如：胰岛素如：胰岛素前体（胰岛素原）为前体（胰岛素原）为84个个AA残基组成多肽链残基组成多肽链（猪），活性仅为（猪），活性仅为10%；经酶解生成：肽（经酶解生成：肽（29）链（）链（21）链）链（30），链与链经两对），链与链经两对-S-S-连接，即具活连接，即具活性。性。.522.Pr的变构现象的变构现象 一些一些Pr受某些因素影响，

36、一级结构不变而空间构象变化，受某些因素影响，一级结构不变而空间构象变化，导致生物学功能的改变称导致生物学功能的改变称Pr的别构现象（变构现象）的别构现象（变构现象） 酶的变构调节，酶的变构调节，Hb运输运输O2。.53解释解释O2与与Hb结合的正协同效应的理论：结合的正协同效应的理论：未结合未结合O2时结构较为紧密，称为时结构较为紧密，称为紧张态（紧张态（tense state, T态态)，T态与态与O2的亲和力小。的亲和力小。随着随着O2的结合，的结合，4个亚基羧基末端个亚基羧基末端之间的盐键断裂，结构相对松弛，之间的盐键断裂，结构相对松弛，称为松弛态称为松弛态(relaxed state,

37、R态态)，R态利于与态利于与O2的结合的结合（二、三、四级结构也发生变化）（二、三、四级结构也发生变化） Heme与与O2结合使得结合使得Fe半径变小，半径变小，牵动肽段移动牵动肽段移动，影响其构象，最影响其构象，最后使亚基间松弛，有利于进一步后使亚基间松弛，有利于进一步结合结合O2。.54O2血血红红素素与与氧氧结结合合后后，铁铁原原子子半半径径变变小小，就就能能进进入入卟卟啉啉环环的的小小孔孔中中，继继而而引引起起肽肽链链位位置置的的变动。变动。.55蛋白质构象改变可引起疾病 多肽链的正确折叠对蛋白质正确构象的形成和功能多肽链的正确折叠对蛋白质正确构象的形成和功能发挥至关重要。发挥至关重要

38、。 若多肽链折叠发生错误，尽管其一级结构不变，若多肽链折叠发生错误，尽管其一级结构不变，其构象发生改变，仍可影响其功能，其构象发生改变，仍可影响其功能， 严重时可导致严重时可导致疾病疾病蛋白构象疾病蛋白构象疾病 有些蛋白质错折叠后相互聚集，形成抗蛋白水解酶的有些蛋白质错折叠后相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。人纹状体脊髓变性病，淀粉样纤维沉淀的病理改变。人纹状体脊髓变性病，老年痴呆症，亨丁顿舞蹈病和疯牛病。老年痴呆症，亨丁顿舞蹈病和疯牛病。.56疯牛病：朊（ruan “软” 音）病毒蛋白

39、prion protein ,PrP（传染颗粒，不含核酸）引起的一组人和动物神经的退行性疾病。PrPCPrPSC，聚集，形成淀粉样纤维沉淀一级结构完全相似一级结构完全相似.57 研究不同来源研究不同来源Pr结构上的差结构上的差异，是研究生物进化的重要异，是研究生物进化的重要方法。方法。 三、蛋白质结构与生物进化三、蛋白质结构与生物进化.58第五节第五节 蛋白质的性质蛋白质的性质一、一、Pr分子大小、形状及分子量测定分子大小、形状及分子量测定 Pr是一类是一类高分子化合物高分子化合物，分子量，分子量1104-106D或更高。或更高。 衡量衡量Pr分子形状依据：分子形状依据： 根据扩散系数、粘度或

40、其他物理方法推算出根据扩散系数、粘度或其他物理方法推算出Pr的不对称常数。的不对称常数。 不对称常数近于不对称常数近于1呈球形呈球形 不对称常数越大，则分子呈不对称常数越大，则分子呈纤维状纤维状； 介于之间则为介于之间则为椭圆形椭圆形。 高分子性质是蛋白质的重要性质，是蛋白质胶体性、变性和免高分子性质是蛋白质的重要性质，是蛋白质胶体性、变性和免疫学性质的基础。测定蛋白质分子的大小是蛋白质化学的重要疫学性质的基础。测定蛋白质分子的大小是蛋白质化学的重要内容。内容。 .59分子量测定常用方法分子量测定常用方法：1.分子筛层析法分子筛层析法： Pr混合物通过一定大小的凝胶介质，大、小分子混合物通过一

41、定大小的凝胶介质，大、小分子流程不同而分离。洗脱体积是分子量对数的线性函流程不同而分离。洗脱体积是分子量对数的线性函数。以标准数。以标准Pr对照，可求出分子量。对照，可求出分子量。2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE) SDS含丰富的负电荷，与含丰富的负电荷，与Pr形成复合物后，不形成复合物后，不同的同的Pr带有相同的电荷，消除电荷差异使电泳行为带有相同的电荷，消除电荷差异使电泳行为只受分子量大小的影响。只受分子量大小的影响。3.生物质谱生物质谱 测定分子质量和相对应离子电荷，获得样品的分测定分子质量和相对应离子电荷，获得样品的分子量、分子式、分子中放射性核素构

42、成和分子结构。子量、分子式、分子中放射性核素构成和分子结构。.60二、蛋白质的变性二、蛋白质的变性蛋白质的变性作用：蛋白质的变性作用：denaturation 物理和化学的因素使蛋白质的空间结构物理和化学的因素使蛋白质的空间结构发生改变或破坏，导致其生物学活性丧失，发生改变或破坏，导致其生物学活性丧失，理化性质改变的现象。理化性质改变的现象。 1.变性本质：变性本质：空间构象改变，一级结构不变空间构象改变，一级结构不变空间构象改变，一级结构不变空间构象改变，一级结构不变 次级键破坏次级键破坏 .612.变性作用的特征：变性作用的特征： （1）结构：蛋白质分子从有规律的紧密结构变为无规则的松）结

43、构：蛋白质分子从有规律的紧密结构变为无规则的松散状态。散状态。 （2）生物活性丧失生物活性丧失：如酶活性，激素作用等等丧失；：如酶活性，激素作用等等丧失； （3）理化性质改变：）理化性质改变： 结晶能力丧失；溶解度降低；粘度增加；扩散系数降低。结晶能力丧失；溶解度降低；粘度增加；扩散系数降低。变性后分子结构松散，易为蛋白酶水解。变性后分子结构松散，易为蛋白酶水解。3.变性作用的因素和程度：变性作用的因素和程度： 物理因素：高温、紫外线、物理因素：高温、紫外线、X射线、超声波、剧烈振荡等；射线、超声波、剧烈振荡等； 化学因素：化学因素： 强酸碱、尿素、去污剂、重金属、有机酸、生物碱试剂等强酸碱、

44、尿素、去污剂、重金属、有机酸、生物碱试剂等 影响次级键的形成与稳定影响次级键的形成与稳定4.变性的意义：变性的意义： 灭菌；灭菌； 活性蛋白制备需避免变性因素。活性蛋白制备需避免变性因素。 .62Pr空间结构破坏，一级结构仍存在，功能丧失；空间结构破坏，一级结构仍存在，功能丧失；恢复空间结构，功能恢复（酶活性）。恢复空间结构，功能恢复（酶活性）。.63三、蛋白质的两性电离与等电点三、蛋白质的两性电离与等电点 AA为两性物质，即可接受质子，又可给出质子（游为两性物质，即可接受质子，又可给出质子（游离氨基羧基，及离氨基羧基，及R基团）；基团）； 所以，所以，Pr也是两性物质。也是两性物质。 蛋白质

45、的等电点蛋白质的等电点：pI Pr在溶液中带电荷的状态主要取决于溶液的在溶液中带电荷的状态主要取决于溶液的pH。当。当溶液的溶液的pH使蛋白质所带的正负电荷相等，净电荷为零使蛋白质所带的正负电荷相等，净电荷为零时时溶液的溶液的pH即为即为该蛋白质的该蛋白质的pI。 蛋白质蛋白质 酸性酸性AA残基数残基数 碱性碱性AA残基数残基数 pI 胃蛋白酶胃蛋白酶 37 6 1.0 胰岛素胰岛素 4 4 5.35 RNA酶酶 10 18 7.8 细胞色素细胞色素C 12 25 9.810.8 .64体内多数蛋白质的体内多数蛋白质的pI为为5左右，在生理条件下左右，在生理条件下（pH为为7.4）多以负离子形

46、式存在。）多以负离子形式存在。.65四、四、Pr的胶体性质的胶体性质Pr为亲水胶体为亲水胶体 具有布朗运动、光散射现象、不透过半透膜以具有布朗运动、光散射现象、不透过半透膜以及具吸附力等胶体性质及具吸附力等胶体性质Pr亲水胶体的稳定因素：亲水胶体的稳定因素： 1.Pr表面具有水化层表面具有水化层 由其表面亲水的极性基团的水合作用，在由其表面亲水的极性基团的水合作用，在Pr表面形成表面形成较厚的水化层，使较厚的水化层，使Pr分子隔开，阻止其聚集而沉淀。分子隔开，阻止其聚集而沉淀。 极性基团极性基团：NH3、COO-、CO-NH、OH、SH等等2.Pr表面具同性电荷表面具同性电荷 同电相斥，使同电

47、相斥，使Pr颗粒不致聚集而沉淀。颗粒不致聚集而沉淀。 Pr亲水胶体性质可作为分离纯化亲水胶体性质可作为分离纯化Pr方法的依据。方法的依据。.66 .67五、五、Pr的沉淀反应的沉淀反应Pr的沉淀反应的沉淀反应： Pr分子聚集而从溶液中析出的现象分子聚集而从溶液中析出的现象1.中性盐沉淀反应中性盐沉淀反应 低浓度盐可使低浓度盐可使Pr溶解度增加盐溶作用溶解度增加盐溶作用 与与Pr 表面吸附离子导致其带同种电荷排斥增强；表面吸附离子导致其带同种电荷排斥增强； 高浓度盐使高浓度盐使Pr聚集沉淀盐析作用聚集沉淀盐析作用 与破坏水化层并中和电荷有关与破坏水化层并中和电荷有关 常用的盐：硫酸铵，常用的盐：

48、硫酸铵，NaCl，Na2SO4等等 可进行分级沉淀。沉淀之可进行分级沉淀。沉淀之Pr不变性不变性。.682.有机溶剂沉淀反应：有机溶剂沉淀反应： 使使Pr失去水化层而沉淀。温和条件失去水化层而沉淀。温和条件Pr 不变性（低温）不变性（低温） 3.加热沉淀加热沉淀 可使可使Pr变性，但是沉淀与否与溶液变性，但是沉淀与否与溶液pH有关。有关。pI时时最易沉淀。偏酸或偏碱最易沉淀。偏酸或偏碱Pr变性并不沉淀。变性并不沉淀。4.重金属盐沉淀反应重金属盐沉淀反应 碱性条件下，碱性条件下，Pr带负电荷，与重金属离子结合带负电荷，与重金属离子结合成不溶性蛋白盐沉淀成不溶性蛋白盐沉淀重金属：重金属：Cu+、H

49、g2+、Pb2+、Ag+等等.695.生物碱试剂生物碱试剂沉淀反应沉淀反应 酸性条件下，酸性条件下，Pr带正电荷，与生物碱试剂结带正电荷，与生物碱试剂结合成不溶性的沉淀。合成不溶性的沉淀。 生物碱试剂：生物碱试剂： 苦味酸、磷钨酸、磷钼酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基苦味酸、磷钨酸、磷钼酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水杨酸等水杨酸等 蛋白质变性和沉淀是两个不同的概念蛋白质变性和沉淀是两个不同的概念。 蛋白质变性有时表现为沉淀，亦可表现为溶解状态；蛋白质变性有时表现为沉淀，亦可表现为溶解状态；同样蛋白质沉淀可变性也可不变性。这取决于沉淀的同样蛋白质沉淀可变性也可不变性。这取决于沉淀的方法和条件以及是否对蛋白质

50、空间结构有无破坏而定。方法和条件以及是否对蛋白质空间结构有无破坏而定。.70六、颜色反应：六、颜色反应： .71 蛋白质蛋白质的呈色反应的呈色反应 （1）茚茚三三酮酮反反应应：蛋蛋白白质质经经水水解解后后产产生生的的AAAA也可与茚三酮试剂作用生成蓝紫色化合物也可与茚三酮试剂作用生成蓝紫色化合物. .（2）双双缩缩脲脲反反应应：蛋蛋白白质质在在碱碱性性条条件件下下与与稀稀硫酸铜硫酸铜反应，出现紫色或紫红色反应，出现紫色或紫红色. .（3 3）酚酚试试剂剂反反应应：在在碱碱性性条条件件下下，蛋蛋白白质质分分子子中中的的Tyr,TrpTyr,Trp可可与与酚酚试试剂剂反反应应生生成成蓝蓝色色化化合

51、合物物. .（酚试剂为磷钨酸（酚试剂为磷钨酸磷钼酸化合物）磷钼酸化合物） .72第六节 蛋白质的分离纯化等电点沉淀等电点沉淀:蛋白质在等电点时溶解度最小蛋白质在等电点时溶解度最小盐析沉淀盐析沉淀:一定浓度的中性盐可破坏蛋白质胶体的一定浓度的中性盐可破坏蛋白质胶体的稳定因素而使蛋白质盐析沉淀。盐析沉淀的蛋白稳定因素而使蛋白质盐析沉淀。盐析沉淀的蛋白质一般保持着天然构象而不变性。有时不同盐浓质一般保持着天然构象而不变性。有时不同盐浓度可有效的使蛋白质分级沉淀。度可有效的使蛋白质分级沉淀。低温有机溶剂沉淀法低温有机溶剂沉淀法:有机溶剂的介电常数较水低，有机溶剂的介电常数较水低，因此在一定量有机溶剂中，蛋白质分子间极性基因此在一定量有机溶剂中，蛋白质分子间极性基团的静电引力增加，而水化作用降低，促使蛋白团的静电引力增加，而水化作用降低，促使蛋白质聚集沉淀。质聚集沉淀。温度对蛋白质荣季度的影响温度对蛋白质荣季度的影响.73