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1、第七章第七章 克隆基因的表达克隆基因的表达外源基因外源基因表达载体表达载体重组载体重组载体导入宿主细胞导入宿主细胞在宿主细胞中在宿主细胞中表达出蛋白质表达出蛋白质提取蛋白提取蛋白宿主细胞：宿主细胞：原核细胞原核细胞或或真核细胞真核细胞。克隆基因的表达克隆基因的表达外源基因外源基因mRNARNAPol载体载体外源基因外源基因大肠杆菌大肠杆菌基基因因克克隆隆植物基因工程据受体细胞的不同可分为：1、原核表达载体系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。2、真核表达系统： 使外源基因在真核细胞中表达的体系。7.1外源基因在原核细胞中的表达外源基因在
2、原核细胞中的表达用原核生物作宿主表达用原核生物作宿主表达外源基因。外源基因。一、原核生物基因表达的特点一、原核生物基因表达的特点1. 1. 原核生物只有一种原核生物只有一种RNARNA聚合酶识别原核细胞聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有的启动子，催化所有RNARNA的合成。的合成。2. 2. 原核生物的表达式以原核生物的表达式以操纵子操纵子为单位的。为单位的。操纵子（操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。 原原核核生生物物基基因因表表达达的的基基本本单单位位（即即一一个个转转录单位）。录单位）。共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。共同协调作用，
3、完成某一多肽的表达调控。包包括括：调调控控区区(调调节节基基因因、启启动动基基因因、 操操作基因作基因)、结构基因、结构基因3. 3. 由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是耦联的，也是连续进行的。耦联的，也是连续进行的。4. 4. 原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。缺乏真核细胞的转录后加工系统。一、原核生物基因表达的特点一、原核生物基因表达的特点5. 5. 原核生物基因的控制主要在转录水平，这原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。种控制要比对基因产物的直
4、接控制要慢。6. 6. 在大肠杆菌在大肠杆菌mRNAmRNA的核糖体结合位点上，含的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子以及与有一个转译起始密码子以及与16S16S核糖体核糖体RNA3RNA3末端碱基互补的序列，即末端碱基互补的序列，即S-DS-D序列，而真核基序列，而真核基因则缺乏此序列。因则缺乏此序列。一、原核生物基因表达的特点一、原核生物基因表达的特点原核或噬菌体启动子原核或噬菌体启动子MCSSD序列序列终止子终止子二、原核生物基因表达的调控序列二、原核生物基因表达的调控序列1.启动子启动子(Promoter) 指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 一般长40
5、-60bp，富含A-T碱基对共有保守序列： -10区（pribnow box）：TATAAT -35区5-TTGACA-3-10box（PribnowBoxPribnowBox）5-TATAAT-3TTGACATATAAT 转录起始位点转录起始位点17bp5核糖体结合位点核糖体结合位点RNA聚合酶聚合酶 亚基的识别位点亚基的识别位点。-35box核糖体结合位点（核糖体结合位点（RBS（ribosome binding site) ）Shine-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上与核糖体上与核糖体16sRNA结合的结合的DNA序列。序列。SDmRNA5AGGAGGUAUG16S
6、rRNA3UCCUCCAS-D序列距离序列距离AUG的距离也影响翻译的距离也影响翻译2.SD序列序列位于位于SD序列下游。序列下游。ii）起始密码）起始密码AUG(ATG)（91%）GUG（8%）UUG（1%）启动子启动子S-D序列序列起始密码起始密码目的基因目的基因内终止子内终止子内终止子内终止子（intrinsicterminator）E.coli中促使转录终止的中促使转录终止的DNA位置有一段位置有一段反向回文顺序反向回文顺序，其后紧接一串其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。，称为内终止子，形成终止信号。位于基因位于基因位于基因位于基因33端端端端, ,给予给予给予给予RNARN
7、A聚合酶转录聚合酶转录聚合酶转录聚合酶转录终止信号终止信号终止信号终止信号的的的的DNADNA序列。序列。序列。序列。启动子启动子S-D序列序列目的基因目的基因终止子终止子3.终止子终止子5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTCTTTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板模板)转录转录5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠折叠mRNA折叠折叠U CCU GGCAUCGCGGCCGCGGCA ACCCAC UUUU3DNARNA
8、聚合酶聚合酶脱落脱落大肠杆菌偏爱大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上。一般安置上全部的三全部的三个终止密码个终止密码防止核糖体跳跃（防止核糖体跳跃（skipping）。）。能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。中的表达效率的特殊序列。4.翻译终止密码子翻译终止密码子5.翻译增强子翻译增强子（Translation enhancer）（1 1）必须是一种强启动子必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。以上。（2 2）应呈现低水平的应呈现低水平的基础转录基础转录便于表达毒性蛋
9、白等。便于表达毒性蛋白等。（3 3）应是可诱导型的应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。用温度或化学试剂诱导。A.A.最佳启动子必须具备的条件最佳启动子必须具备的条件最佳启动子必须具备的条件最佳启动子必须具备的条件三、基因工程常用的原核启动子三、基因工程常用的原核启动子B. 基因工程常用的原核生物启动基因工程常用的原核生物启动子举例子举例来自大肠杆菌的乳糖操纵子。来自大肠杆菌的乳糖操纵子。可用乳糖或其类似物可用乳糖或其类似物IPTGIPTG诱导。诱导。lacP lacO目的基因目的基因IPTG=异丙基硫代异丙基硫代-D半乳糖半乳糖lac Z lac Y lac Alac P lac Olac I
10、结构基因结构基因阻遏基因阻遏基因启动子启动子操纵单元操纵单元（1 1）乳糖启动子乳糖启动子lac（2）色氨酸启动）色氨酸启动子子trptrpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpAtrpR阻遏蛋白基因；阻遏蛋白基因；P1P2启动子；启动子；O操纵基因；操纵基因； 衰减子衰减子来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。（3）PL和和PR启启动子动子是从是从 噬菌体中得到的一类启动子，比噬菌体中得到的一类启动子，比lac启动子的活启动子的活性高性高8-10倍，比倍，比trp启动子活性高。启动子活性高。cIII N PL/OLcI PMOR/PRCro PEcIIN:抗
11、终止蛋白；抗终止蛋白；Cro:抗阻遏蛋白抗阻遏蛋白(裂解必需的）；裂解必需的）；cI,cII,cIII:阻遏蛋白；阻遏蛋白；P:启动子；启动子；O:操纵子。操纵子。R:右；右；L:左左当当cIcI合成后，与合成后，与O OL L和和O OR R结合阻止结合阻止RNARNA聚合酶，则左右基因聚合酶，则左右基因都受到抑制。但促进都受到抑制。但促进P PM M使使cIcI进一步转录。进入溶原期。进一步转录。进入溶原期。cIII N PL/OLcI PMOR/PRCro PEcII阻遏物阻遏物转录转录转录转录转录转录转录转录转录转录转录转录早期左边早期左边早期右边早期右边cI857:cI857:表达载
12、体常用的噬菌体启动子是表达载体常用的噬菌体启动子是PL。调节基因调节基因cI 则是选择一个温度敏感性的突则是选择一个温度敏感性的突变基因变基因cI857。42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录cI857PL外源基因外源基因28oC时阻遏时阻遏PL，外源基因不转录。，外源基因不转录。四、几种类型的原核表达载体四、几种类型的原核表达载体适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。 主要元件主要元件：强启动子：强启动子 SD顺序顺序 筛选标志筛选标志 其它调控基因其它调控基因类型：类型： 非融合型表达载体：非融合型表达载体：-天然完整
13、蛋白天然完整蛋白 融合型表达载体：融合型表达载体： -融合蛋白融合蛋白 分泌型表达载体：分泌型表达载体： -产物可跨膜产物可跨膜分分 泌至胞外间隙泌至胞外间隙PSDForeignDNA非融合型表达载体非融合型表达载体非融合基因非融合基因1 1、非融合型表达载体、非融合型表达载体 载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。质融合在一起。PL启动子启动子-温度温度诱导诱导插入位点插入位点-HpaI非融合型表达载体非融合型表达载体-pPL-LamdaS-D序列序列ATG-外源基因外源基因-TAA优点优点：产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结
14、构。产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。缺点：缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。2 2、融合型表达载体、融合型表达载体 PSDForeignDNA融合型表达载体融合型表达载体融合基因融合基因Ptac：IPTG诱导诱导GST融合蛋白融合蛋白直接纯化直接纯化产物切割方便：产物切割方便：pGEX-1 T凝血酶凝血酶pGEX-2T-凝血酶凝血酶pGEX-3T-X因子因子位相载体位相载体融合型载体融合型载体-pGEX系列系列优点：表达效率高表达效率高产物稳定产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定易纯化：利用融合原核多肽的特性易纯化：利用融合原核多肽的特性（1）主要元件：）主要元件： 启动子和启动子和SD序列序列 信信号号肽肽序序列列：SD下下游游，编编码码信信号号肽肽， 可引导蛋白跨膜。可引导蛋白跨膜。（2）优点：分泌表达，避免降解。）优点：分泌表达，避免降解。3 3、分泌型表达载体、分泌型表达载体分泌型表达载体分泌型表达载体-pINIII-ompA1分泌型融合表达载体分泌型融合表达载体-pEZZ18五、提高克隆基因表达效率的途径五、提高克隆基因表达效率的途径感谢您的关注感谢您的关注
