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1、色色谱分离基本原理谱分离基本原理“两相分配，相似相溶”1色谱柱结构色谱柱结构色谱柱有方向性，主要与装填技术有关。筛板的内部孔形态会影响柱效2规格规格内径长度粒径碳载量孔径比表面积材质封端表观规格：柱管材质，填料分类，尺寸，粒径隐藏信息：碳载量，平均孔径，比表面积，封端，键合类型，pH范围，最大耐压，筛板孔径等 Waters XBridge Shield RP 18 4.6*250mm 5um柱效拖尾载样量（体积）载样量（浓度）分离度回收率你能正确连接它们吗？你能正确连接它们吗？3填料填料硅胶 等载体 （正相色谱）硅胶+键合相 （反相色谱）聚合物+键合相 （离子交换，手性色谱柱等）整体柱 （空间
2、排阻色谱等）4反相色谱反相色谱C18填料填料5硅胶硅胶注意：硅胶 颗粒大小分布金属残留内部孔径实心核颗粒实心核颗粒6四乙氧基硅烷四乙氧基硅烷(TEOS)硅甲基嵌入型聚乙氧基硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷硅烷 (MPEOS)甲基三乙氧基硅烷甲基三乙氧基硅烷(MTEOS)改性硅胶改性硅胶7 硅胶快速溶解 严重的柱失效 柱寿命短暂 因嵌入硅甲基的阻挡, 颗粒表面溶解速度明显减缓 柱寿命大大延长pH范围可达111普通硅胶柱普通硅胶柱waters改性硅胶柱改性硅胶柱碱性条件下硅胶溶解碱性条件下硅胶溶解8单、双、三官能团键合三官能团键合二官能团键合单官能团键合键合键合 碳载量影响残留硅羟基比率 键合相流失率键合
3、密度9常见键合相常见键合相 主要主要作用机作用机理理疏水疏水疏水疏水-疏水疏水疏疏水水氢键氢键 -氢键氢键氢键氢键阳离子阳离子交换交换阴离子阴离子交换交换10空间位阻：异丙基硅氧烷，异丁基硅氧烷增加pH范围，但有限，一般19空间位阻空间位阻AgilentPhenomenex11空间位阻空间位阻抗水解Agilent XDB 12极性嵌入极性嵌入Waters “Shield”13内嵌极性基团固定相：水表面层可能机理内嵌极性基团固定相：水表面层可能机理水 “屏蔽”层改善与水的浸润性100%水溶液兼容降低了碱性化合物的保留降低了拖尾现象屏蔽了带负电的硅羟基极性基团增加了表面层水的浓度14 与键合相的疏
4、水性作用与键合相的疏水性作用双重保留机理双重保留机理:1). 与键合相的的疏水性作与键合相的的疏水性作用用; 2). 与残余硅醇基间的离子交换作用与残余硅醇基间的离子交换作用O-SiO-SiO- O-SiO-SiO- O-SiO- O-SiO-SiO-SiO- - O-SiO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-SiOHO-SiOHO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-Si( (CH3 3) )2 2HN+ +(CH3)2HN+当流动相pH值小于3时, 硅醇基呈中性(未解离) BaseBase对碱性化合对碱性化合物的保留及物的保留及严重拖尾严重拖尾两实验使用相同的传统两实验使用相同的传统C8
5、硅胶柱硅胶柱离子交换作用离子交换作用碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理当流动相为 pH6-8时, 硅醇基带负电性(大部解离)15既然既然pH 8时时, ,许多许多C18硅胶基质过早地丧失柱效硅胶基质过早地丧失柱效由于填料颗粒溶解由于填料颗粒溶解, ,色谱柱内产生空隙色谱柱内产生空隙随着键合相覆盖率的增加，色谱柱寿命延长随着键合相覆盖率的增加，色谱柱寿命延长低低pH实验实验pH 2时时, ,许多许多C18硅胶基质过早地丧失柱效硅胶基质过早地丧失柱效由于键合相之水解作用由于键合相之水解作用, ,被测物丧失保留行为被测物丧失保留行为使用三官能团键合相可获得最佳的稳定性使用三
6、官能团键合相可获得最佳的稳定性宽宽pH 柱柱26宽宽pH值色谱柱的几种类型值色谱柱的几种类型Agilent 双齿键合宽宽pH 柱柱Waters Waters 杂化颗粒杂化颗粒27基质溶解度基质溶解度 ( (ppm)1 2 3 4 5 6 7 8 9 101 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 12240-240-220-220-200-200-180-180-160-160-140-140-120-120-100-100- 80- 80- 60- 60- 40- 40- 20- 20- 0- 0-pH基质溶解度曲线基质溶解度曲线传统硅胶柱适用范围传统硅胶柱适用范围pH 2-7 各种基质
7、的液相柱在高各种基质的液相柱在高pH中溶解速率的比较中溶解速率的比较液相柱基体材料的溶解导致柱前端形成空腔，液相柱基体材料的溶解导致柱前端形成空腔，由此而造成色谱峰畸形、分叉。由此而造成色谱峰畸形、分叉。现代超纯硅胶柱适用范围现代超纯硅胶柱适用范围pH 2-8宽宽pH值色谱柱值色谱柱适用范围适用范围pH 1-1228柱效下降，柱压升高的原因柱效下降，柱压升高的原因 键合相流失键合相流失 保留时间的急剧下降是因为疏水塌陷保留时间的急剧下降是因为疏水塌陷 硅胶溶解坍塌硅胶溶解坍塌 死吸附，硅胶内孔堵塞死吸附，硅胶内孔堵塞 筛板堵塞筛板堵塞 稀释剂与流动相差异大或流动相急剧变化导致的柱内析晶稀释剂与
8、流动相差异大或流动相急剧变化导致的柱内析晶 压力波动大致柱床松动，涡流效应增大压力波动大致柱床松动，涡流效应增大29我的色谱柱寿命为何不长我的色谱柱寿命为何不长? ? 您是否有恰当的样品前处理手段您是否有恰当的样品前处理手段? 样品前处理样品前处理 ( (净化和富集净化和富集)的好坏不仅影响分析结果的灵敏度和的好坏不仅影响分析结果的灵敏度和可靠性，而且直接影响色谱柱的寿命可靠性，而且直接影响色谱柱的寿命 您的色谱柱是否有适当的保护措施您的色谱柱是否有适当的保护措施? ? 在线过滤器在线过滤器 保护柱保护柱 您的色谱柱是否曾暴露在过于剧烈的分离条件您的色谱柱是否曾暴露在过于剧烈的分离条件? ?
9、使用某些对填料基体有腐蚀性的高浓度缓冲盐使用某些对填料基体有腐蚀性的高浓度缓冲盐 (如在中性或碱性如在中性或碱性pH区域使用区域使用高浓度缓冲盐的磷酸盐或硼酸盐高浓度缓冲盐的磷酸盐或硼酸盐) 柱温过高柱温过高 将色谱柱暴露在极端将色谱柱暴露在极端pH的流动相中的流动相中 30选择性与选择性与pH影响影响带离子型官能团的待测物带离子型官能团的待测物如：胺，羧酸及酚类等如：胺，羧酸及酚类等pH不影响不能发生电离的中性物质的不影响不能发生电离的中性物质的保留保留大多数药物含有一个或多个离子型大多数药物含有一个或多个离子型官能团官能团pH变化引起的选择性变化最大变化引起的选择性变化最大化合物从离子化状
10、态变化到非离子化状态其保留因子变化化合物从离子化状态变化到非离子化状态其保留因子变化10 10 到到 30 30倍倍上述变化相当于有机溶剂的比例变化上述变化相当于有机溶剂的比例变化20% 20% pH带来最显著的选择性变化带来最显著的选择性变化pH是方法开发最强有力的选择性调节工具是方法开发最强有力的选择性调节工具 31重要的方法开发为何要从新色谱柱开始？重要的方法开发为何要从新色谱柱开始？ 随使用条件和样品洁净度的不同，多数色谱柱在使用过程中可随使用条件和样品洁净度的不同，多数色谱柱在使用过程中可发生化学污染、表面状态改变、基体材料部分溶解等等潜在变发生化学污染、表面状态改变、基体材料部分溶
11、解等等潜在变化。化。此类改变可导致柱内填料的活化或钝化，使其对某些化合物的此类改变可导致柱内填料的活化或钝化，使其对某些化合物的分离选择性加强或变劣。此类特殊分离选择性常常是无法重复分离选择性加强或变劣。此类特殊分离选择性常常是无法重复的。的。在此类旧色谱柱建立起来的方法将无法在新柱和其他旧色谱柱在此类旧色谱柱建立起来的方法将无法在新柱和其他旧色谱柱上得以重现，造成未来可能需要重新开发方法或进行大量针对上得以重现，造成未来可能需要重新开发方法或进行大量针对仪器系统、色谱柱和流动相的不必要的诊断工作。仪器系统、色谱柱和流动相的不必要的诊断工作。32反相色谱柱的选择小结反相色谱柱的选择小结: :常
12、规应用常规应用 现代高纯硅胶色谱柱现代高纯硅胶色谱柱：优点：峰形好，重现性高，寿命长优点：峰形好，重现性高，寿命长限制：限制：pH 2-8pH 2-8流动相中含有大量水溶液流动相中含有大量水溶液采用采用AQ技术：技术：优点优点：在含有大量水溶液（：在含有大量水溶液（100100水溶液）水溶液）流动相中流动相中 性能稳定：峰形好性能稳定：峰形好使用宽使用宽pHpH值或高温条件值或高温条件 如生物碱分离如生物碱分离宽宽pH值色谱柱：值色谱柱：pH1-12pH1-12优点：优点：pHpH范围宽，高温条件下填料稳定性好，色谱峰范围宽，高温条件下填料稳定性好，色谱峰 形好，寿命长形好，寿命长 快速分离或采用质谱检测器快速分离或采用质谱检测器: : 窄内径窄内径/ /小颗粒小颗粒/ /短柱短柱33
