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1、2.3 蛋白质化学蛋白质化学2.3.1蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成n蛋白质含有蛋白质含有碳、氢、氧和氮碳、氢、氧和氮元素，大部分还含有元素，大部分还含有硫。有些蛋白质还含有其它的元素，特别是磷、硫。有些蛋白质还含有其它的元素，特别是磷、铁、锌及铜。铁、锌及铜。 n大多数蛋白质所含氮素约为大多数蛋白质所含氮素约为16%16%，因该元素容易用，因该元素容易用凯氏凯氏( (KjeldahlKjeldahl) )定氮法定氮法进行测定，故蛋白质的含进行测定，故蛋白质的含量可由氮的含量乘以量可由氮的含量乘以6.25(100/16)6.25(100/16)计算出来。计算出来。n蛋白质含量蛋白质含量=式样
2、中氮含量式样中氮含量*6.25 2.3.2氨基酸氨基酸n蛋蛋白白质质的的相相对对分分子子量量非非常常大大，但但是是用用酸酸水水解解后后，蛋蛋白白质质分分子子产产生生一一系系列列相相对对分分子子质质量量低低的的简简单单有有机机化化合合物物-氨氨基基酸酸，构构成成蛋蛋白白质质的的-氨氨基基酸共有酸共有2020种，称为种，称为天然氨基酸或基本氨基酸。天然氨基酸或基本氨基酸。n不参与蛋白质组成的氨基酸称为不参与蛋白质组成的氨基酸称为非蛋白氨基酸非蛋白氨基酸（稀有氨基酸）。（稀有氨基酸）。n（1）蛋白质氨基酸的结构特点即表示方法）蛋白质氨基酸的结构特点即表示方法 n（2）常见的蛋白质氨基酸的分类）常见的
3、蛋白质氨基酸的分类具有非极性或疏水的具有非极性或疏水的R基团的氨基酸基团的氨基酸具有极性不带电荷具有极性不带电荷R基团的氨基酸基团的氨基酸 基团带负电荷的氨基酸基团带负电荷的氨基酸 R基团带正电荷的氨基酸基团带正电荷的氨基酸 2.3.3蛋白质的结构蛋白质的结构p一级结构一级结构p二级结构二级结构p三级结构三级结构p四级结构四级结构2.3.3.1蛋白质分子的蛋白质分子的一级结构一级结构n概念：概念：蛋白质的一级结构，是指多肽链的氨蛋白质的一级结构，是指多肽链的氨基酸残基的排列顺序，也是蛋白质最基本的基酸残基的排列顺序，也是蛋白质最基本的结构。结构。n每种蛋白质都有其特定的氨基酸排列顺序。每种蛋白
4、质都有其特定的氨基酸排列顺序。肽链中氨基酸间以肽键为连接键。肽链中氨基酸间以肽键为连接键。n氨基酸能够彼此以酰胺键互相连接在一起，即一氨基酸能够彼此以酰胺键互相连接在一起，即一个氨基酸的羧基与另一氨基酸的氨基形成一个取个氨基酸的羧基与另一氨基酸的氨基形成一个取代的代的酰胺键酰胺键，这个键称为，这个键称为肽键肽键，如下式虚线区所，如下式虚线区所示：示： 氨基酸残基：氨基酸残基：肽链中的氨基酸由于参加肽键的形成因而肽链中的氨基酸由于参加肽键的形成因而 不在不在是原来完整的分子，称为氨基酸残基。是原来完整的分子，称为氨基酸残基。n两个分子氨基酸所形成的肽称为二肽，三个氨基两个分子氨基酸所形成的肽称为
5、二肽，三个氨基酸缩合成的肽称为三肽，依此类推。若一种肽含酸缩合成的肽称为三肽，依此类推。若一种肽含有少于有少于10个氨基酸，则为寡肽，超过此数的肽统个氨基酸，则为寡肽，超过此数的肽统称为称为多肽多肽。n一条多肽链至少有两个末端，带游离氨基的一端一条多肽链至少有两个末端，带游离氨基的一端称为称为N端端，带游离羧基的一端称为，带游离羧基的一端称为C端端。n在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为种排列顺序称为氨基酸顺序氨基酸顺序。n书写：书写：氨基酸的顺序是从氨基酸的顺序是从N-N-端的氨基酸残基开始端的氨基酸残基开始，以以C-C-端氨基酸
6、残基为终点的排列顺序。如上述五端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-GlnS-V-Y-Q丝氨酸丝氨酸-缬氨酸缬氨酸-酪氨酸酪氨酸-谷氨酰胺谷氨酰胺2.3.3.2蛋白质分子的蛋白质分子的二级结构二级结构n概念：概念：蛋白质的二级结构，是指多肽链中蛋白质的二级结构，是指多肽链中彼此靠近的氨基酸残基之间由于氢键相互彼此靠近的氨基酸残基之间由于氢键相互作用而形成的空间关系；是指蛋白质分子作用而形成的空间关系；是指蛋白质分子中多肽链本身的折叠方式。中多肽链本身的折叠方式。n主要是主要是-螺旋结构，其次是螺旋结构，其次是-折叠结构和折叠结构和-转角
7、。转角。（1）-螺旋螺旋左手和右手螺旋左手和右手螺旋左图显示氢键和左图显示氢键和R侧链的位置，右图显示右手螺旋侧链的位置，右图显示右手螺旋-螺旋：是指多肽主链借助氢键螺旋：是指多肽主链借助氢键紧密卷曲而成的周期性螺旋状构紧密卷曲而成的周期性螺旋状构象。象。NNCNNCCC平平行行反反平平行行（2）-折叠折叠-折叠（片）：两条或多条几乎完全伸展的多肽折叠（片）：两条或多条几乎完全伸展的多肽链或同一多肽链之中的不同肽段，考氢键侧向聚链或同一多肽链之中的不同肽段，考氢键侧向聚集在一起形成的片状结构。集在一起形成的片状结构。 （3）-转角转角-转角：连接转角：连接-折叠（片）的一类回折结构。折叠（片）
8、的一类回折结构。 （4 4）超二级结构）超二级结构n超二级结构：超二级结构：在在蛋白质分子中，蛋白质分子中，由若干相邻的二由若干相邻的二级结构单元组合级结构单元组合在一起，彼此相在一起，彼此相互作用，形成有互作用，形成有规则的、在空间规则的、在空间上能辨认的二级上能辨认的二级结构组合体。结构组合体。（5）结构域）结构域n结构域：在二级结构结构域：在二级结构或超二级结构基础上或超二级结构基础上形成的三级结构的局形成的三级结构的局部折叠区，一条多肽部折叠区，一条多肽链在这个域范围内来链在这个域范围内来回折叠，但相邻的域回折叠，但相邻的域却被一个或两个多肽却被一个或两个多肽片段连接。片段连接。 3-
9、磷酸甘油醛脱氢酶的三级结构及其结构域磷酸甘油醛脱氢酶的三级结构及其结构域2.3.3.3蛋白质分子的蛋白质分子的三级结构三级结构n概念：概念：蛋白质的三级结构是指多肽链的距蛋白质的三级结构是指多肽链的距离较远的氨基酸之间的相互作用而使多肽离较远的氨基酸之间的相互作用而使多肽链弯曲或折叠形成的紧密而具有一定刚性链弯曲或折叠形成的紧密而具有一定刚性的结构。的结构。n是二级结构的多肽链进一步折叠、卷曲形是二级结构的多肽链进一步折叠、卷曲形成复杂的球状分子结构。成复杂的球状分子结构。2.3.3.4蛋白质分子的蛋白质分子的四级结构四级结构n概念概念 ：四级结构是指两条或多条四级结构是指两条或多条肽链以特殊
10、方式结合成有生物活性肽链以特殊方式结合成有生物活性的蛋白质。的蛋白质。n维持四级结构的内聚力与维持三级维持四级结构的内聚力与维持三级结构的力是相同的，有些寡聚体依结构的力是相同的，有些寡聚体依靠疏水键，另一些则靠静电吸引靠疏水键，另一些则靠静电吸引（离子键）。（离子键）。n四级结构分为均一的（含有相同的四级结构分为均一的（含有相同的亚基）及不均一的（含有不同的亚亚基）及不均一的（含有不同的亚基）两类。基）两类。2.3.3.5稳定蛋白质三维结构的作用力稳定蛋白质三维结构的作用力n（1）氢键）氢键n（2）范德华力）范德华力n（3）疏水作用）疏水作用n（4）盐键（离子键）盐键（离子键）n（5）二硫键
11、）二硫键离子键离子键氢键氢键范德华力范德华力疏水作用疏水作用维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键华力、盐键维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键 a盐键（离子键盐键（离子键 ） b氢键氢键 c疏水相互作用力疏水相互作用力 d 范德华力范德华力 e二硫键二硫键2.3.4蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质n2.3.4.1蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体
12、性质n2.3.4.2蛋白质的两性电离及等电点蛋白质的两性电离及等电点n2.3.4.3蛋白质的变性蛋白质的变性n2.3.4.4蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀n2.3.4.5蛋白质的显色反应蛋白质的显色反应2.3.4.1蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质n蛋白质的相对分子质量很大，一般在蛋白质的相对分子质量很大，一般在10 000至至1 000 000之间，水溶液具有胶体的性质。之间，水溶液具有胶体的性质。n蛋白质是亲水力很强的胶体。蛋白质是亲水力很强的胶体。n在一定的条件下，蛋白质溶液可以变为凝胶，在在一定的条件下，蛋白质溶液可以变为凝胶，在凝胶体内，溶剂和蛋白质形成一种如同胶冻的外凝胶体内，溶剂和蛋白
13、质形成一种如同胶冻的外表均一体，其中有的水形成很厚的水膜包围着蛋表均一体，其中有的水形成很厚的水膜包围着蛋白质颗粒，有的水则积存在胶粒间的空隙。豆腐、白质颗粒，有的水则积存在胶粒间的空隙。豆腐、奶酪等就是用蛋白质制成的凝胶体。奶酪等就是用蛋白质制成的凝胶体。 布朗运动、光散射现象、电泳现象，不能透过半透膜及吸附能力等布朗运动、光散射现象、电泳现象，不能透过半透膜及吸附能力等2.3.4.2蛋白质的两性电离及等电点蛋白质的两性电离及等电点n蛋白质是由各种氨基酸组成的高分子，具有许多蛋白质是由各种氨基酸组成的高分子，具有许多游离的氨基和羧基，以及咪唑基、胍基、巯基等，游离的氨基和羧基，以及咪唑基、胍
14、基、巯基等，所以在化学性质上也和氨基酸一样既能像酸一样所以在化学性质上也和氨基酸一样既能像酸一样的解离，也能像碱一样的解离，因此，也是的解离，也能像碱一样的解离，因此，也是两性两性离子离子。 n在在碱性碱性介质（介质（pHpI）中，蛋白质解离成酸，使）中，蛋白质解离成酸，使蛋白质带蛋白质带负电荷负电荷。n在在酸性酸性介质（介质（pHpI）中则能解离成碱，使分子）中则能解离成碱，使分子带带正电荷正电荷。 n因此，若以电流通过蛋白质溶液时，则在碱性介因此，若以电流通过蛋白质溶液时，则在碱性介质中蛋白质分子就移向阳极，而在酸性介质中，质中蛋白质分子就移向阳极，而在酸性介质中，蛋白质分子便移向阴极。蛋
15、白质在电场中能够泳蛋白质分子便移向阴极。蛋白质在电场中能够泳动的现象，称为动的现象，称为电泳电泳。n当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一PH时，蛋白质游离成正负时，蛋白质游离成正负离子的趋势相等，此时溶液的离子的趋势相等，此时溶液的PH值称为值称为蛋白质的蛋白质的等电点等电点。（电场中不移动）。（电场中不移动）n等电点与蛋白质性质有密切的关系，在等电点时，等电点与蛋白质性质有密切的关系，在等电点时，蛋白质的溶解度最小，其它性质如粘度、渗透压蛋白质的溶解度最小，其它性质如粘度、渗透压及膨胀性等也都最小。及膨胀性等也都最小。n在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子解离成带正电在酸性或碱性溶液中，蛋白质
16、分子解离成带正电荷或负电荷的离子，如果将蛋白质的胶体溶液的荷或负电荷的离子，如果将蛋白质的胶体溶液的pH调节到等电点调节到等电点，此时胶体颗粒很不稳定，再经，此时胶体颗粒很不稳定，再经过脱水作用就过脱水作用就发生沉淀发生沉淀。 n利用胶体对半透膜的不可渗过性，可将蛋白溶液利用胶体对半透膜的不可渗过性，可将蛋白溶液内低分子的杂质与蛋白质分离开，因而得到较为内低分子的杂质与蛋白质分离开，因而得到较为纯净的蛋白质，这样以半透膜提纯蛋白质的方法，纯净的蛋白质，这样以半透膜提纯蛋白质的方法，称为称为透析法透析法。2.3.4.3蛋白质的变性蛋白质的变性n大多数蛋白质分子只有在一定的温度和大多数蛋白质分子只
17、有在一定的温度和pH范围内范围内才能保持其生物学活性。将蛋白质分子暴露在极才能保持其生物学活性。将蛋白质分子暴露在极端的温度或端的温度或pH中就会使它们发生变化，称为中就会使它们发生变化，称为变性变性。n球蛋白变性最显著的效应就是溶解度下降。大多球蛋白变性最显著的效应就是溶解度下降。大多数蛋白质加热到数蛋白质加热到5060以上即发生变性，有些以上即发生变性，有些蛋白质冷却到蛋白质冷却到1015以下也会发生变性。以下也会发生变性。n变性蛋白质丧失其特有的生物学活性。变性蛋白质丧失其特有的生物学活性。例如，将例如，将酶加热，它催化特异的化学反应的能力就会丧失。酶加热，它催化特异的化学反应的能力就会
18、丧失。由于变性时蛋白质肽链的主链中的共价键并未打由于变性时蛋白质肽链的主链中的共价键并未打断，所以变性是因为天然蛋白分子多肽链的特有断，所以变性是因为天然蛋白分子多肽链的特有折叠结构的任意卷曲或伸展所致。折叠结构的任意卷曲或伸展所致。 n对于单一蛋白质，如果变性条件不剧烈，除去变对于单一蛋白质，如果变性条件不剧烈，除去变性因素后，蛋白质还可恢复其天然构象和生物学性因素后，蛋白质还可恢复其天然构象和生物学活性，这种现象称为活性，这种现象称为蛋白质的复性蛋白质的复性。n许多蛋白质的变性之所以表现为不可逆，是由于许多蛋白质的变性之所以表现为不可逆，是由于重新折叠成天然状态往往是极慢的过程。重新折叠成
19、天然状态往往是极慢的过程。n细胞或组织蛋白质变性后不能复性。细胞或组织蛋白质变性后不能复性。核糖核酸酶变性与复性作用核糖核酸酶变性与复性作用Native ribonucleaseDenative reduced ribonucleaseNative ribonuclease8 M urea and -mercapotoethanolDialysis变性变性复性复性2.3.4.4蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀n蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水，水膜和电荷一旦膜和电荷一旦除去除去，蛋白质就开始粘在一起而形，蛋白质就开始粘在一起而形成较大的蛋白质团，最后就从
20、溶液中成较大的蛋白质团，最后就从溶液中沉淀沉淀出来。出来。n蛋白质的这种脱水作用可借各种脱水剂、中性盐蛋白质的这种脱水作用可借各种脱水剂、中性盐和重金属盐等来进行。如将甲醇、乙醇及丙醇等和重金属盐等来进行。如将甲醇、乙醇及丙醇等脱水剂加入蛋白质溶液中，由于这些脱水剂分子脱水剂加入蛋白质溶液中，由于这些脱水剂分子的亲水性比蛋白质的亲水能力更强，使蛋白质失的亲水性比蛋白质的亲水能力更强，使蛋白质失去水膜，在分子亲和力的影响下聚合而产生沉淀。去水膜，在分子亲和力的影响下聚合而产生沉淀。如能迅速使蛋白质与脱水剂分离，则蛋白质仍能如能迅速使蛋白质与脱水剂分离，则蛋白质仍能保持原有的溶解状态。保持原有的溶
21、解状态。 n若在蛋白质溶液中加入定量的中性盐时，则能使若在蛋白质溶液中加入定量的中性盐时，则能使蛋白质脱水并中和其电荷而从溶液中沉淀出来，蛋白质脱水并中和其电荷而从溶液中沉淀出来，中性盐的这种沉淀作用称为中性盐的这种沉淀作用称为盐析作用盐析作用。n常见的几种蛋白质盐析剂：常见的几种蛋白质盐析剂：硫酸铵、硫酸钠和氯硫酸铵、硫酸钠和氯化钠化钠。（盐除去，可恢复其溶于水的性质）。（盐除去，可恢复其溶于水的性质）n含有各种不同蛋白质的溶液如用不同浓度的盐类含有各种不同蛋白质的溶液如用不同浓度的盐类进行盐析，可将蛋白质分离成不同的部分。例如进行盐析，可将蛋白质分离成不同的部分。例如用半饱和的硫酸胺可以将
22、球蛋白沉淀下来，再用用半饱和的硫酸胺可以将球蛋白沉淀下来，再用全饱和的硫酸铵可以从上述滤液中提取残留的清全饱和的硫酸铵可以从上述滤液中提取残留的清蛋白。因此，蛋白。因此，利用盐析法可以分离和制取各种蛋利用盐析法可以分离和制取各种蛋白质和酶制品。白质和酶制品。 n重金属盐如重金属盐如HgCl2、AgNO3、Pb(CH3COO)2及及FeCl3等及生物碱试剂如苦味酸、磷钨酸、三氯等及生物碱试剂如苦味酸、磷钨酸、三氯乙酸等都能与蛋白质结合成不溶解的蛋白质，而乙酸等都能与蛋白质结合成不溶解的蛋白质，而使其沉淀下来。使其沉淀下来。2.3.4.5蛋白质的显色反应蛋白质的显色反应n1、水合茚三酮反应、水合茚
23、三酮反应 凡含有凡含有-氨基酸的蛋白质都能与水合茚氨基酸的蛋白质都能与水合茚三酮发生三酮发生蓝紫色蓝紫色反应。反应。n2、双缩脲反应、双缩脲反应 双缩脲反应是用以测定肽键（双缩脲反应是用以测定肽键（CONH）特性的反应，蛋白质在碱性溶液中能与硫酸铜产生）特性的反应，蛋白质在碱性溶液中能与硫酸铜产生红色红色或或蓝紫色蓝紫色的反应。的反应。 n双缩脲是两分子脲经加热放出一分子双缩脲是两分子脲经加热放出一分子NH3而得到产物，其化而得到产物，其化学反应如下：学反应如下： n凡化合物含有二个或二个以上的肽键结构都可呈双缩脲反应。凡化合物含有二个或二个以上的肽键结构都可呈双缩脲反应。双缩脲反应产生的蓝色
24、物质是铜与二肽的肽键结合成的复杂双缩脲反应产生的蓝色物质是铜与二肽的肽键结合成的复杂化合物。化合物。 n3、米伦（、米伦（Millon）反应）反应 当在蛋白质溶液中加入米当在蛋白质溶液中加入米伦试剂（硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸及亚硝酸的混合伦试剂（硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸及亚硝酸的混合溶液），然后加热，即有砖红色沉淀析出。含有酚溶液），然后加热，即有砖红色沉淀析出。含有酚基的化合物都有这个反应，故含酪氨酸的蛋白质能基的化合物都有这个反应，故含酪氨酸的蛋白质能与米隆试剂生成与米隆试剂生成砖红色沉淀砖红色沉淀。 n4、酚试剂反应、酚试剂反应 蛋白质与碱性硫酸铜及磷钨酸钼蛋白质与碱性硫酸铜及磷钨酸钼酸反应
25、，产生酸反应，产生蓝色化合物蓝色化合物，反应有关基团为酚基，反应有关基团为酚基，有此反应的氨基酸为酪氨酸。有此反应的氨基酸为酪氨酸。 n5、乙醛酸反应、乙醛酸反应 将浓硫酸缓缓加入蛋白质与乙醛酸将浓硫酸缓缓加入蛋白质与乙醛酸的混合液中时，硫酸与混合液形成两层，在两层交的混合液中时，硫酸与混合液形成两层，在两层交界处有些界处有些色环色环出现，为色氨酸与乙醛酸缩合物的颜出现，为色氨酸与乙醛酸缩合物的颜色。色。 n6、蛋白黄色反应、蛋白黄色反应 蛋白质在硝酸溶液中，产生黄蛋白质在硝酸溶液中，产生黄色反应，此色反应，此黄色黄色为硝酸与苯环生成的硝基化合物，为硝酸与苯环生成的硝基化合物，故凡含苯丙氨酸、
26、酪氨酸的蛋白质均有此反应。故凡含苯丙氨酸、酪氨酸的蛋白质均有此反应。 n7、醋酸铅反应、醋酸铅反应 凡含有半胱氨酸、胱氨酸的蛋白凡含有半胱氨酸、胱氨酸的蛋白质都能与醋酸铅起反应，因其中含质都能与醋酸铅起反应，因其中含SS或或SH基，故能生成基，故能生成黑色黑色的硫化铅沉淀。的硫化铅沉淀。n8、考马斯亮蓝、考马斯亮蓝G-250 本身为红色，与蛋白质反本身为红色，与蛋白质反应呈应呈蓝色蓝色。与蛋白的亲和力强，灵敏度高。与蛋白的亲和力强，灵敏度高。2.3.5蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化n2.3.5.1蛋白质的分离纯化的一般原则蛋白质的分离纯化的一般原则（1）前处理）前处理（2）粗分级）粗分级（3
27、）细分级）细分级（4）结晶）结晶（1）前处理：）前处理：选择适当的细胞破碎法和适宜的提取介质，将蛋白质从细胞中以溶解状态释放出来，保持天然状态，过滤除渣后即得到蛋白质提取液。（2）粗分级：）粗分级：建立一系列分离纯化的方法，使目的蛋白与其他较大的杂蛋白分开。（3）细分级：）细分级：粗分级后的样品纯度低，在细分级中也要建立一套适宜的方法，进一步将目的蛋白与少量结构类似的杂蛋白分开，最终使纯度达到预期要求。（4）结晶：）结晶：结晶本身也是纯化的过程，因为结晶中未发现变性蛋白质，因此蛋白质结晶不仅是纯度的指标，也是确定制品处于天然状态的可靠指标。2.3.5.2蛋白质的分离纯化的基本原理蛋白质的分离纯
28、化的基本原理（1）按蛋白质分子大小不同的分离）按蛋白质分子大小不同的分离（2）按蛋白质溶解度的差异进行分离）按蛋白质溶解度的差异进行分离（3）根据蛋白质电离性质不同分离）根据蛋白质电离性质不同分离（4）亲和色谱）亲和色谱透析和超滤透析和超滤离心沉降法离心沉降法凝胶过滤（凝胶色凝胶过滤（凝胶色谱）谱）等电点沉降等电点沉降盐析盐析有机溶剂分级分离有机溶剂分级分离电泳电泳离子交换色谱离子交换色谱透析和超滤透析和超滤透析透析是根据分子大小、利用半透膜选择性除去某是根据分子大小、利用半透膜选择性除去某些小分子物质的技术。些小分子物质的技术。n超滤超滤是利用压力或离心力使小分子溶质通过半透是利用压力或离心
29、力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上而分离。膜而蛋白质被截留在膜上而分离。图图 超滤装置超滤装置离心沉降法离心沉降法n原理：原理：不同蛋白质颗粒在质量、密度和不同蛋白质颗粒在质量、密度和性状上存在差异，在一定的强离心力场性状上存在差异，在一定的强离心力场中表现出不同的下沉速度中表现出不同的下沉速度-沉降速度。沉降速度。n密度梯度离心密度梯度离心凝胶过滤（分子筛层析）凝胶过滤（分子筛层析）n原理：原理：是利用固定相内一定大小的网孔对相对分子质量不同是利用固定相内一定大小的网孔对相对分子质量不同的祖坟的阻滞程度不同而进行蛋白质分离的层析技术。的祖坟的阻滞程度不同而进行蛋白质分离的层析技术。
30、n凝胶过滤层析柱的填充料凝胶过滤层析柱的填充料为不溶于水但又能高度水化的珠状为不溶于水但又能高度水化的珠状碳水化合物聚合体，如交联葡聚糖（商品名为碳水化合物聚合体，如交联葡聚糖（商品名为Sephadex）等电点沉降法等电点沉降法n原理：原理：利用蛋白质在利用蛋白质在等电点溶解度最低的等电点溶解度最低的原理，调节混合蛋白原理，调节混合蛋白质溶液的质溶液的PH值，达到值，达到目的蛋白的等电点使目的蛋白的等电点使其沉淀，其他蛋白质其沉淀，其他蛋白质仍溶于溶液中。仍溶于溶液中。盐析盐析n原理：原理：不同的蛋白质在不同的盐溶液中溶不同的蛋白质在不同的盐溶液中溶解度不同。用逐步提高盐浓度的方法，可解度不同
31、。用逐步提高盐浓度的方法，可以把不同蛋白质逐个沉淀出来。以把不同蛋白质逐个沉淀出来。n常用盐类：硫酸铵常用盐类：硫酸铵有机溶剂分级分离（有机溶剂沉淀）有机溶剂分级分离（有机溶剂沉淀）n原理：原理：蛋白质的溶解度与介质的介电常数有关，蛋白质的溶解度与介质的介电常数有关，在蛋白质溶液中加入介电常数较低而与水相溶的在蛋白质溶液中加入介电常数较低而与水相溶的有机溶剂（乙醇、丙酮），能降低水的介电常数，有机溶剂（乙醇、丙酮），能降低水的介电常数，使蛋白质分子中相反电荷间吸引力增强，加之有使蛋白质分子中相反电荷间吸引力增强，加之有机溶剂也存在脱去蛋白质分子水化膜的作用，故机溶剂也存在脱去蛋白质分子水化膜的
32、作用，故蛋白质易发生凝集而沉淀。蛋白质易发生凝集而沉淀。n蛋白质易变性蛋白质易变性n电泳方法有多种，一种是将蛋白质溶于缓冲液中电泳方法有多种，一种是将蛋白质溶于缓冲液中通电进行电泳，在溶液与溶剂间形成界面，称为通电进行电泳，在溶液与溶剂间形成界面，称为自由界面电泳自由界面电泳；另一种方法是将蛋白质溶液加在；另一种方法是将蛋白质溶液加在含有缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成含有缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状，称为带状，称为区带电泳区带电泳。n其中用滤纸作支持物的称为其中用滤纸作支持物的称为纸电泳纸电泳，用凝胶（如，用凝胶（如淀粉、琼脂、聚丙烯酰胺等）作支持物的称为淀粉、琼脂、聚丙
33、烯酰胺等）作支持物的称为凝凝胶电泳胶电泳。如果在玻璃管中进行凝胶电泳，蛋白质。如果在玻璃管中进行凝胶电泳，蛋白质的不同组分在分开后形成环状如圆盘，称为的不同组分在分开后形成环状如圆盘，称为圆盘圆盘电泳电泳。也可以在铺有凝胶的玻璃板上或在其他凝。也可以在铺有凝胶的玻璃板上或在其他凝胶膜（如醋酸纤维膜）上进行电泳，称为胶膜（如醋酸纤维膜）上进行电泳，称为平板电平板电泳泳。 电泳电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳图图 垂直板电泳原理示意图垂直板电泳原理示意图A垂直板凝胶侧面观垂直板凝胶侧面观 B染色后的电泳凝胶染色后的电泳凝胶以聚丙烯酰胺凝以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质进胶为支持介质进行电泳，即聚
34、丙行电泳，即聚丙烯酰胺凝胶电泳。烯酰胺凝胶电泳。通过调节浓度课通过调节浓度课获得网孔大小不获得网孔大小不同的凝胶。同的凝胶。丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度5%7%等点聚焦电泳（等点聚焦电泳（IEF）n原理：原理：是根据蛋白质等是根据蛋白质等电点不同而分离、鉴定电点不同而分离、鉴定蛋白质的一种电泳技术。蛋白质的一种电泳技术。图图 等点聚焦电泳示意图等点聚焦电泳示意图双向电泳双向电泳图图 拟南芥叶片全蛋白双向电泳分析拟南芥叶片全蛋白双向电泳分析n原理：原理：是一种在二维方是一种在二维方向上对同一蛋白质样品向上对同一蛋白质样品先后进行两种不同性质先后进行两种不同性质的电泳，目的是分离高的电泳，目的是分离高
35、分辨率的蛋白质。分辨率的蛋白质。n最常见：最常见：nIEF/SDS-PAGE离子交换色谱（离子交换层析）离子交换色谱（离子交换层析）2.3.6蛋白质相对分子质量的测定蛋白质相对分子质量的测定n（1）化学测定法）化学测定法n（2）超离心沉降速度法）超离心沉降速度法n（3）凝胶过滤法）凝胶过滤法n (4) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）nSDS:十二烷基硫酸钠，变性剂十二烷基硫酸钠，变性剂蛋白质分类蛋白质分类n分子形状：分子形状：球状蛋白（球蛋白）、纤维状蛋白球状蛋白（球蛋白）、纤维状蛋白n分子组成和溶解度：分子组成和溶解度：n1.单纯蛋白质单纯蛋白质（清蛋白、
36、谷蛋白、球蛋白、组蛋（清蛋白、谷蛋白、球蛋白、组蛋白、醇溶谷蛋白、精蛋白、硬蛋白）白、醇溶谷蛋白、精蛋白、硬蛋白）n2.结合蛋白质结合蛋白质（核蛋白，磷蛋白、脂蛋白、糖蛋（核蛋白，磷蛋白、脂蛋白、糖蛋白、色蛋白）白、色蛋白）n营养学：营养学：完全蛋白质、半完全蛋白质、不完全蛋完全蛋白质、半完全蛋白质、不完全蛋白质白质作业与思考题作业与思考题 n1. 名词解释：肽键、名词解释：肽键、一级结构、二级结构、三级一级结构、二级结构、三级结构、四级结构结构、四级结构、-螺旋、螺旋、-折叠、折叠、-转角、结转角、结构域构域n2. 写出写出20种常见氨基酸名称和符号种常见氨基酸名称和符号 。n3. 何谓蛋白质的变性与复性？何谓蛋白质的变性与复性？n4. 维持蛋白质分子的一级、二级、三级、四级结维持蛋白质分子的一级、二级、三级、四级结构的主要次级键是什么？构的主要次级键是什么？n5. 简述几种常见的蛋白质分离纯化的基本原理。简述几种常见的蛋白质分离纯化的基本原理。n6. 蛋白质相对分子质量的测定的方法有哪些？蛋白质相对分子质量的测定的方法有哪些？
