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1、第四章蛋白质 - 王镜岩 生物化学 第三版笔记 ( 完美打印版 ) 文库 .txt如果不懂就说出来，如果懂了，就笑笑别说出来。贪婪是最真实的贫穷，满足是最真实的财富。幽默就是一个人想哭的时候还有笑的兴致。第四章蛋白质提要一. 概念简单蛋白、结合蛋白、基本氨基酸、等电点、甲醛滴定法、Edman降解、一级结构、肽键、构型与构象、二面角、二级结构、超二级结构、结构域、三级结构、四级结构、亚基、别构蛋白、分子病、水化层、双电层、蛋白质的变性与复性、盐析与盐溶二. 氨基酸分类、基本氨基酸的结构、分类、名称、符号、化学反应、鉴定、蛋白质的水解三. 蛋白质的结构一级结构结构特点、测定步骤、常用方法、酶二级结
2、构四种结构特点、数据、超二级结构三级结构主要靠疏水键维持四级结构变构现象结构与功能的适应、结构变化对功能的影响、典型蛋白质四. 蛋白质的性质分子量的测定方法、酸碱性、溶解性、变性、颜色反应第一节蛋白质通论一、蛋白质的功能多样性蛋白质是原生质的主要成分，任何生物都含有蛋白质。自然界中最小、 最简单的生物是病毒，它是由蛋白质和核酸组成的。没有蛋白质也就没有生命。自然界的生物多种多样，因而蛋白质的种类和功能也十分繁多。概括起来，蛋白质主要有以下功能：1. 催化功能生物体内的酶都是由蛋白质构成的，它们有机体新陈代谢的催化剂。没有酶， 生物体内的各种化学反应就无法正常进行。例如，没有淀粉酶，淀粉就不能被
3、分解利用。2. 结构功能蛋白质可以作为生物体的结构成分。在高等动物里， 胶原是主要的细胞外结构蛋白，参与结缔组织和骨骼作为身体的支架，占蛋白总量的1/4 。细胞里的片层结构，如细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等都是由不溶性蛋白与脂类组成的。动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。3. 运输功能脊椎动物红细胞中的血红蛋白和无脊椎动物体内的血蓝蛋白在呼吸过程中起着运输氧气的作用。血液中的载脂蛋白可运输脂肪，转铁蛋白可转运铁。一些脂溶性激素的运输也需要蛋白，如甲状腺素要与甲状腺素结合球蛋白结合才能在血液中运输。4. 贮存功能某些蛋白质的作用是贮存氨基酸作为生物体的养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。此类蛋白质
4、包括蛋类中的卵清蛋白、奶类中的酪蛋白和小麦种子中的麦醇溶蛋白等。肝脏中的铁蛋白可将血液中多余的铁储存起来，供缺铁时使用。5. 运动功能肌肉中的肌球蛋白和肌动蛋白是运动系统的必要成分，它们构象的改变引起肌肉的收缩，带动机体运动。细菌中的鞭毛蛋白有类似的作用，它的收缩引起鞭毛的摆动，从而使细菌在水中游动。6. 防御功能高等动物的免疫反应是机体的一种防御机能，它主要也是通过蛋白质抗体 来实现的。凝血与纤溶系统的蛋白因子、溶菌酶、干扰素等，也担负着防御和保护功能。7. 调节功能某些激素、一切激素受体和许多其他调节因子都是蛋白质。8. 信息传递功能生物体内的信息传递过程也离不开蛋白质。例如，视觉信息的传
5、递要有视紫红质参与，感受味道需要味觉蛋白。视杆细胞中的视紫红质，只需1 个光子即可被激发，产精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 21 页生视觉。9. 遗传调控功能遗传信息的储存和表达都与蛋白质有关。DNA在储存时是缠绕在蛋白质组蛋白上的。有些蛋白质，如阻遏蛋白，与特定基因的表达有关。半乳糖苷酶基因的表达受到一种阻遏蛋白的抑制，当需要合成半乳糖苷酶时经过去阻遏作用才能表达。10. 其他功能某些生物能合成有毒的蛋白质，用以攻击或自卫。如某些植物在被昆虫咬过以后会产生一种毒蛋白。白喉毒素可抑制生物蛋白质合成。二、蛋白质的分类一按分
6、子形状分类1. 球状蛋白外形近似球体， 多溶于水， 大都具有活性， 如酶、 转运蛋白、 蛋白激素、 抗体等。球状蛋白的长度与直径之比一般小于10。2. 纤维状蛋白外形细长，分子量大，大都是结构蛋白，如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等。纤维蛋白按溶解性可分为可溶性纤维蛋白与不溶性纤维蛋白。前者如血液中的纤维蛋白原、肌肉中的肌球蛋白等，后者如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等结构蛋白。二按分子组成分类1. 简单蛋白完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分。如血清清蛋白等。根据溶解性的不同，可将简单蛋白分为以下7 类：清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和硬蛋白。2. 结合蛋白由蛋白质和非蛋白成分组成，后
7、者称为辅基。 根据辅基的不同，可将结合蛋白分为以下 7 类：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白和金属蛋白。三、蛋白质的元素组成与分子量1. 元素组成所有的蛋白质都含有碳氢氧氮四种元素，有些蛋白质还含有硫、磷和一些金属元素。蛋白质平均含碳50，氢 7，氧 23，氮 16。其中氮的含量较为恒定，而且在糖和脂类中不含氮，所以常通过测量样品中氮的含量来测定蛋白质含量。如常用的凯氏定氮：蛋白质含量蛋白氮其中是 16的倒数。2. 蛋白质的分子量蛋白质的分子量变化范围很大，从6000 到 100 万或更大。这个范围是人为规定的。 一般将分子量小于6000 的称为肽。 不过这个界限不是绝对的
8、，如牛胰岛素分子量为 5700，一般仍认为是蛋白质。蛋白质煮沸凝固，而肽不凝固。较大的蛋白质如烟草花叶病毒，分子量达4000 万。四、蛋白质的水解氨基酸是蛋白质的基本结构单位，这个发现是从蛋白质的水解得到的。蛋白质的水解主要有三种方法：1. 酸水解用 6MHCl或 4MH2SO4 ，105回流 20 小时即可完全水解。酸水解不引起氨基酸的消旋，但色氨酸完全被破坏，丝氨酸和苏氨酸部分破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解。如样品含有杂质，在酸水解过程中常产生腐黑质，使水解液变黑。 用 3mol/L 对甲苯磺酸代替盐酸，得到色氨酸较多，可像丝氨酸和苏氨酸一样用外推法求其含量。2. 碱水解用 5MN
9、aOH，水解 1020 小时可水解完全。碱水解使氨基酸消旋，许多氨基酸被破坏，但色氨酸不被破坏。常用于测定色氨酸含量。可加入淀粉以防止氧化。3. 酶水解酶水解既不破坏氨基酸，也不引起消旋。 但酶水解时间长，反应不完全。 一般用于部分水解，假设要完全水解，需要用多种酶协同作用。第二节氨基酸一、氨基酸的结构与分类一基本氨基酸组成蛋白质的20 种氨基酸称为基本氨基酸。它们中除脯氨酸外都是-氨基酸， 即在 - 碳原精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 21 页子上有一个氨基。基本氨基酸都符合通式，都有单字母和三字母缩写符号。按照氨基酸
10、的侧链结构，可分为三类：脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和杂环氨基酸。1. 脂肪族氨基酸共 15 种。侧链只是烃链：Gly, Ala, Val, Leu, Ile后三种带有支链，人体不能合成，是必需氨基酸。侧链含有羟基：Ser, Thr 许多蛋白酶的活性中心含有丝氨酸，它还在蛋白质与糖类及磷酸的结合中起重要作用。侧链含硫原子：Cys, Met 两个半胱氨酸可通过形成二硫键结合成一个胱氨酸。二硫键对维持蛋白质的高级结构有重要意义。半胱氨酸也经常出现在蛋白质的活性中心里。甲硫氨酸的硫原子有时参与形成配位键。甲硫氨酸可作为通用甲基供体，参与多种分子的甲基化反应。侧链含有羧基：AspD, Glu E侧链含酰
11、胺基：AsnN, Gln Q 侧链显碱性：ArgR , Lys K 2. 芳香族氨基酸包括苯丙氨酸Phe,F和酪氨酸 (Tyr,Y)两种。酪氨酸是合成甲状腺素的原料。3. 杂环氨基酸包括色氨酸 (Trp,W) 、组氨酸 (His) 和脯氨酸 (Pro) 三种。其中的色氨酸与芳香族氨基酸都含苯环，都有紫外吸收 (280nm) 。 所以可通过测量蛋白质的紫外吸收来测定蛋白质的含量。组氨酸也是碱性氨基酸，但碱性较弱，在生理条件下是否带电与周围内环境有关。它在活性中心常起传递电荷的作用。组氨酸能与铁等金属离子配位。脯氨酸是唯一的仲氨基酸，是 - 螺旋的破坏者。B是指 Asx，即 Asp 或 Asn；Z
12、 是指 Glx，即 Glu 或 Gln。基本氨基酸也可按侧链极性分类：非极性氨基酸：Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro共八种极性不带电荷：Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr共七种带正电荷： Arg, Lys, His 带负电荷： Asp, Glu 二不常见的蛋白质氨基酸某些蛋白质中含有一些不常见的氨基酸，它们是基本氨基酸在蛋白质合成以后经羟化、羧化、甲基化等修饰衍生而来的。也叫稀有氨基酸或特殊氨基酸。如4-羟脯氨酸、 5- 羟赖氨酸、锁链素等。 其中羟脯氨酸和羟赖氨酸在胶原和弹性蛋白中含量较多。在甲状腺素中还有3,5-
13、二碘酪氨酸。三非蛋白质氨基酸自然界中还有150 多种不参与构成蛋白质的氨基酸。它们大多是基本氨基酸的衍生物，也有一些是 D-氨基酸或、- 氨基酸。这些氨基酸中有些是重要的代谢物前体或中间产物，如瓜氨酸和鸟氨酸是合成精氨酸的中间产物，- 丙氨酸是遍多酸 泛酸， 辅酶 A前体 的前体， - 氨基丁酸是传递神经冲动的化学介质。二、氨基酸的性质一物理性质- 氨基酸都是白色晶体，每种氨基酸都有特殊的结晶形状，可以用来鉴别各种氨基酸。除胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中。脯氨酸和羟脯氨酸还能溶于乙醇或乙醚中。除甘氨酸外，- 氨基酸都有旋光性，- 碳原子具有手性。苏氨酸和异亮氨酸有两个手性碳原子。从蛋白质水解得
14、到的氨基酸都是L- 型。但在生物体内特别是细菌中，D-氨基酸也存在，如细菌的细胞壁和某些抗菌素中都含有D-氨基酸。三个带苯环的氨基酸有紫外吸收，F:257nm, =200; Y:275nm, =1400; W:280nm, =5600。通常蛋白质的紫外吸收主要是后两个氨基酸决定的，一般在280nm 。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 21 页氨基酸分子中既含有氨基又含有羧基，在水溶液中以偶极离子的形式存在。所以氨基酸晶体是离子晶体，熔点在200以上。氨基酸是两性电解质，各个解离基的表观解离常数按其酸性强度递降的顺序，分别以
15、K1 、K2 来表示。当氨基酸分子所带的净电荷为零时的pH 称为氨基酸的等电点(pI) 。等电点的值是它在等电点前后的两个pK 值的算术平均值。氨基酸完全质子化时可看作多元弱酸，各解离基团的表观解离常数按酸性减弱的顺序，以pK1 、pK2 、pK3 表示。氨基酸可作为缓冲溶液，在pK 处的缓冲能力最强，pI 处的缓冲能力最弱。氨基酸的滴定曲线如图。二化学性质1. 氨基的反应1酰化氨基可与酰化试剂，如酰氯或酸酐在碱性溶液中反应，生成酰胺。该反应在多肽合成中可用于保护氨基。2与亚硝酸作用氨基酸在室温下与亚硝酸反应，脱氨，生成羟基羧酸和氮气。因为伯胺都有这个反应，所以赖氨酸的侧链氨基也能反应，但速度
16、较慢。常用于蛋白质的化学修饰、水解程度测定及氨基酸的定量。3与醛反应氨基酸的 - 氨基能与醛类物质反应，生成西佛碱-C=N-。西佛碱是氨基酸作为底物的某些酶促反应的中间物。赖氨酸的侧链氨基也能反应。氨基还可以与甲醛反应，生成羟甲基化合物。由于氨基酸在溶液中以偶极离子形式存在，所以不能用酸碱滴定测定含量。与甲醛反应后，氨基酸不再是偶极离子，其滴定终点可用一般的酸碱指示剂指示，因而可以滴定，这叫甲醛滴定法，可用于测定氨基酸。4与异硫氰酸苯酯(PITC) 反应- 氨基与 PITC 在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物PTC-AA ，后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物
17、PTH-AA 。这些衍生物是无色的，可用层析法加以别离鉴定。这个反应首先为Edman用来鉴定蛋白质的N-末端氨基酸， 在蛋白质的氨基酸顺序分析方面占有重要地位。5磺酰化氨基酸与5-( 二甲胺基 ) 萘-1- 磺酰氯 (DNS-Cl) 反应，生成DNS-氨基酸。产物在酸性条件下(6NHCl)100 也不破坏，因此可用于氨基酸末端分析。DNS-氨基酸有强荧光，激发波长在360nm左右，比较灵敏，可用于微量分析。6与 DNFB反应氨基酸与2,4- 二硝基氟苯 (DNFB)在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸DNP氨基酸。这一反应是定量转变的，产物黄色，可经受酸性100高温。该反应曾被英国的Sang
18、er 用来测定胰岛素的氨基酸顺序，也叫桑格尔试剂，现在应用于蛋白质N-末端测定。7转氨反应在转氨酶的催化下，氨基酸可脱去氨基，变成相应的酮酸。2. 羧基的反应羧基可与碱作用生成盐，其中重金属盐不溶于水。羧基可与醇生成酯，此反应常用于多肽合成中的羧基保护。某些酯有活化作用，可增加羧基活性，如对硝基苯酯。将氨基保护以后，可与二氯亚砜或五氯化磷作用生成酰氯，在多肽合成中用于活化羧基。在脱羧酶的催化下，可脱去羧基，形成伯胺。3 茚三酮反应精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 21 页氨基酸与茚三酮在微酸性溶液中加热，最后生成蓝色物质。
19、而脯氨酸生成黄色化合物。根据这个反应可通过二氧化碳测定氨基酸含量。4. 侧链的反应丝氨酸、苏氨酸含羟基，能形成酯或苷。半胱氨酸侧链巯基反应性高：1二硫键 (disulfide bond) 半胱氨酸在碱性溶液中容易被氧化形成二硫键，生成胱氨酸。胱氨酸中的二硫键在形成蛋白质的构象上起很大的作用。氧化剂和复原剂都可以打开二硫键。在研究蛋白质结构时，氧化剂过甲酸可以定量地拆开二硫键，生成相应的磺酸。复原剂如巯基乙醇、巯基乙酸也能拆开二硫键，生成相应的巯基化合物。由于半胱氨酸中的巯基很不稳定，极易氧化，因此利用复原剂拆开二硫键时，往往进一步用碘乙酰胺、氯化苄、N-乙基丁烯二亚酰胺和对氯汞苯甲酸等试剂与巯
20、基作用，把它保护起来，防止它重新氧化。2烷化半胱氨酸可与烷基试剂，如碘乙酸、碘乙酰胺等发生烷化反应。半胱氨酸与丫丙啶反应，生成带正电的侧链，称为S-氨乙基半胱氨酸AECys 。3与重金属反应极微量的某些重金属离子，如Ag+ 、Hg2+，就能与巯基反应，生成硫醇盐，导致含巯基的酶失活。5. 以下反应常用于氨基酸的检验：l 酪氨酸、组氨酸能与重氮化合物反应(Pauly反应 ) ，可用于定性、定量测定。组氨酸生成棕红色的化合物，酪氨酸为桔黄色。l 精氨酸在氢氧化钠中与1- 萘酚和次溴酸钠反应，生成深红色，称为坂口反应。用于胍基的鉴定。l 酪氨酸与硝酸、亚硝酸、硝酸汞和亚硝酸汞反应，生成白色沉淀，加热
21、后变红，称为米伦反应，是鉴定酚基的特性反应。l 色氨酸中加入乙醛酸后再缓慢加入浓硫酸，在界面会出现紫色环，用于鉴定吲哚基。在蛋白质中，有些侧链基团被包裹在蛋白质内部，因而反应很慢甚至不反应。三、色谱与氨基酸的分析别离1. 色谱 chromatography 的发展史最早的层析实验是俄国植物学家在1903 年用碳酸钙别离叶绿素，属于吸附层析。 40年代出现了分配层析，50 年代出现了气相色谱，60 年代出现HPLC ，80 年代出现了超临界层析， 90 年代出现的超微量HPLC可别离 ng 级的样品。2. 色谱的分类：按流动相可分为气相、液相、超临界色谱等；按介质可分为纸层析、薄层层析、柱层析等
22、；按别离机制可分为吸附层析、分配层析、分子筛层析等3. 色谱的应用可用于别离、制备、纯度鉴定等。定性可通过保留值、内标、标准曲线等方法，定量一般用标准曲线法。氨基酸的分析别离是测定蛋白质结构的基础。在分配层析和离子交换层析法开始应用于氨基酸成分分析之后，蛋白质结构的研究才取得了显著的成就。现在这些方法已自动化。氨基酸从强酸型离子交换柱的洗脱顺序如下：Asp,Thr,Ser,Glu,Pro,Gly,Ala,Cys,Val,Met,Ile,Leu,Tyr,Phe,Lys,His,(NH3),Arg 第三节蛋白质的一级结构精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - -
23、 - - -第 5 页，共 21 页蛋白质是生物大分子，具有明显的结构层次性，由低层到高层可分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。一、肽键和肽一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩水形成的共价键，称为肽键。在蛋白质分子中，氨基酸借肽键连接起来，形成肽链。最简单的肽由两个氨基酸组成，称为二肽。含有三、四、五个氨基酸的肽分别称为三肽、四肽、五肽等。肽链中的氨基酸由于形成肽键时脱水，已不是完整的氨基酸，所以称为残基。肽的命名是根据组成肽的氨基酸残基来确定的。一般从肽的氨基端开始，称为某氨基酰某氨基酰 .某氨基酸。肽的书写也是从氨基端开始。肽键象酰胺键一样，由于键内原子处于共振状态而表现出较高的
24、稳定性。在肽键中 CN单键具有约 40双键性质， 而 C=O双键具有40单键性质。 这样就产生两个重要结果：1肽键的亚氨基在pH 0-14 的范围内没有明显的解离和质子化的倾向；2肽键中的C N单键不能自由旋转，使蛋白质能折叠成各种三维构象。除了蛋白质部分水解可以产生各种简单的多肽以外，自然界中还有长短不等的小肽，它们具有特殊的生理功能。动植物细胞中含有一种三肽，称为谷胱甘肽，即- 谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。因其含有巯基，故常以 GSH来表示。它在体内的氧化复原过程中起重要作用。脑啡肽是天然止痛剂。肌肉中的鹅肌肽是一个二肽，即 - 丙氨酰组氨酸。 肌肽可作为肌肉中的缓冲剂，缓冲肌肉产生的乳酸对 p
25、H的影响。 一种抗菌素叫做短杆菌酪肽，由 12 种氨基酸组成， 其中有几种是D-氨基酸。这些天然肽中的非蛋白质氨基酸可以使其免遭蛋白酶水解。许多激素也是多肽，如催产素、加压素、舒缓激肽等。二、肽的理化性质小肽的理化性质与氨基酸类似。许多小肽已经结晶。晶体的熔点很高，说明是离子晶体，在水溶液中以偶极离子存在。肽键的亚氨基不解离，所以肽的酸碱性取决于肽的末端氨基、羧基和侧链上的基团。在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链上的。肽中末端羧基的pK比自由氨基酸的稍大，而末端氨基的pK 则稍小。侧链基团变化不大。肽的滴定曲线和氨基酸的很相似。肽的等电点也可以根据它的pK 值确定。一般小肽的旋光度等于各
26、个氨基酸旋光度的总和，但较大的肽或蛋白质的旋光度不等于其组成氨基酸的旋光度的简单加和。肽的化学性质和氨基酸一样，但有一些特殊的反应，如双缩脲反应。一般含有两个或两个以上肽键的化合物都能与CuSO4 碱性溶液发生双缩脲反应而生成紫红色或蓝紫色的复合物。利用这个反应可以测定蛋白质的含量。三、一级结构的测定一一级结构蛋白质的一级结构是指肽链的氨基酸组成及其排列顺序。氨基酸序列是蛋白质分子结构的基础，它决定蛋白质的高级结构。一级结构可用氨基酸的三字母符号或单字母符号表示，从N-末端向 C-末端书写。采用三字母符号时，氨基酸之间用连字符隔开。二测定步骤测定蛋白质的一级结构，要求样品必须是均一的纯度大于9
27、7而且是已知分子量的蛋白质。一般的测定步骤是：1. 通过末端分析确定蛋白质分子由几条肽链构成。2. 将每条肽链分开，并别离提纯。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 21 页3. 肽链的一部分样品进行完全水解，测定其氨基酸组成和比例。4. 肽链的另一部分样品进行N末端和 C末端的鉴定。5. 拆开肽链内部的二硫键。6. 肽链用酶促或化学的部分水解方法降解成一套大小不等的肽段，并将各个肽段别离出来。7. 测定每个肽段的氨基酸顺序。8. 从第二步得到的肽链样品再用另一种部分水解方法水解成另一套肽段，其断裂点与第五步不同。别离肽段并测
28、序。比较两套肽段的氨基酸顺序，根据其重叠部分拼凑出整个肽链的氨基酸顺序。9. 测定原来的多肽链中二硫键和酰胺基的位置。三常用方法1. 末端分析1N末端蛋白质的末端氨基与2,4- 二硝基氟苯(DNFB)在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白质DNP- 蛋白质。产物黄色， 可经受酸性100高温。 水解时， 肽链断开， 但 DNP基并不脱落。DNP-氨基酸能溶于有机溶剂如乙醚中，这样可与其他氨基酸和-DNP赖氨酸分开。再经双向滤纸层析或柱层析，可以鉴定黄色的DNP氨基酸。丹磺酰氯法是更灵敏的方法。蛋白质的末端氨基与5-( 二甲胺基 ) 萘-1- 磺酰氯 (DNS-Cl) 反应，生成 DNS- 蛋白质。
29、 DNS- 氨基酸有强荧光，激发波长在360nm左右，比DNFB法灵敏 100 倍。目前应用最广泛的是异硫氰酸苯酯(PITC) 法。 末端氨基与PITC 在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来。产物可用气 - 液色谱法进行鉴定。这个方法最大的优点是剩下的肽链仍是完整的， 可依照此法重复测定新生的N末端氨基酸。 现在已经有全自动的氨基酸顺序分析仪，可测定含20 个以上氨基酸的肽段的氨基酸顺序。缺点是不如丹磺酰氯灵敏，可与之结合使用。N末端氨基酸也可用酶学方法即氨肽酶法测定。2C末端a) C末端氨基酸可用硼氢化锂复
30、原生成相应的氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定。有断裂干扰。b) 另一个方法是肼解法。多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼解下来的C末端氨基酸可用纸层析鉴定。精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。c) 也可用羧肽酶法鉴定。将蛋白质在pH 8.0, 30与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C末端氨基酸的排列顺序。羧肽酶A水解除精氨酸、赖氨酸和脯氨酸外所有肽键，羧肽酶B水解精氨酸和赖氨酸。2. 二硫键的拆开和肽链的别离一般情况下，蛋白质分子中肽链
31、的数目应等于N末端氨基酸残基的数目，可根据末端分析来确定一种蛋白质由几条肽链构成。必须设法把这些肽链别离开来，然后测定每条肽链的氨基酸顺序。如果这些肽链之间不是共价交联的，可用酸、碱、高浓度的盐或其他变性剂处理蛋白质，把肽链分开。如果肽链之间以二硫键交联，或肽链中含有链内二硫键，则必须用氧化或复原的方法将二硫键拆开。最普遍的方法是用过量的巯基乙醇处理，然后用碘乙酸保护生成的半胱氨酸的巯基，防止重新氧化。二硫键拆开后形成的个别肽链，可用纸层析、离子交换柱层析、电泳等方法进行别离。3. 肽链的完全水解和氨基酸组成的测定。在测定氨基酸顺序之前，需要知道多肽链的氨基酸组成和比例。一般用酸水解，得到氨基
32、酸精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 21 页混合物，再别离测定氨基酸。目前用氨基酸自动分析仪，24 小时即可完成。蛋白质的氨基酸组成，一般用每分子蛋白质中所含的氨基酸分子数表示。不同种类的蛋白质，其氨基酸组成相差很大。4. 肽链的部分水解和肽段的别离当肽链的氨基酸组成及N末端和 C末端已知后，随后的步骤是肽链的部分水解。这是测序工作的关键步骤。这一步通常用专一性很强的蛋白酶来完成。最常用的是胰蛋白酶trypsin ，它专门水解赖氨酸和精氨酸的羧基形成的肽键，所以生成的肽段之一的C末端是赖氨酸或精氨酸。用丫丙啶处理， 可增加
33、酶切位点 半胱氨酸 ；用马来酸酐顺丁烯二酸酐保护赖氨酸的侧链氨基，或用1,2- 环己二酮修饰精氨酸的胍基，可减少酶切位点。经常使用的还有糜蛋白酶，水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水残基的羧基形成的肽键。其他疏水残基反应较慢。用溴化氰处理，可断裂甲硫氨酸的羧基形成的肽键。水解后甲硫氨酸残基转变为C末端高丝氨酸残基。以上三种方法经常使用。胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。前者水解疏水残基之间的肽键，后者水解疏水残基的氨基形成的肽键。金葡菌蛋白酶，又称谷氨酸蛋白酶或V8蛋白酶，水解谷氨酸和天冬氨酸的羧基形成的肽键，但受缓冲液影响。在醋酸缓冲液中只水解谷氨酸，在磷酸缓冲液中还可水解天冬氨酸。梭状芽孢杆菌蛋白酶，
34、水解精氨酸羧基形成的肽键，又称精氨酸蛋白酶。耐变性剂，可经受6M尿素 2 小时。可用于水解不易溶解的蛋白。凝血酶，水解Arg-Gly肽键。羟胺可水解Asn-Gly ，但 Asn-Leu 和 Asn-Ala也能部分裂解。以上方法中，酶不能水解脯氨酸参与形成的肽键。多肽部分水解后，降解成长短不一的小肽段，可用层析或电泳加以别离提纯。经常用双向层析或电泳别离，再用茚三酮显色，所得的图谱称为肽指纹谱。5. 多肽链中氨基酸顺序的测定从多肽链中部分水解得到的肽段可用化学法或酶法测序，然后比较用不同方法获得的两套肽段的氨基酸顺序，根据它们彼此重叠的部分，确定每个肽段的适当位置，拼凑出整个多肽链的氨基酸顺序。
35、6. 二硫键位置确实定一般用蛋白酶水解带有二硫键的蛋白质，从部分水解产物中别离出含二硫键的肽段，再拆开二硫键，将两个肽段分别测序，再与整个多肽链比较，即可确定二硫键的位置。常用胃蛋白酶，因其专一性低，生成的肽段小，容易别离和鉴定，而且可在酸性条件下作用pH2 ，此时二硫键稳定。 肽段的别离可用对角线电泳，将混合物点到滤纸的中央，在进行第一次电泳，然后用过甲酸蒸汽断裂二硫键，使含二硫键的肽段变成一对含半胱氨磺酸的肽段。将滤纸旋转 90 度后在相同条件下进行第二次电泳，多数肽段迁移率不变，处于对角线上， 而含半胱氨磺酸的肽段因负电荷增加而偏离对角线。用茚三酮显色，别离，测序，与多肽链比较，即可确定
36、二硫键位置。四、多肽合成多肽的人工合成有两种类型，一种是由不同氨基酸按照一定顺序排列的控制合成，另一种是由一种或两种氨基酸聚合或共聚合。控制合成的一个困难是进行接肽反应所需的试剂，能同时和其他官能团反应。因此在接肽以前必须首先将这些基团加以封闭或保护，肽键形成后再除去保护基。这样每连接一个氨基酸残基都要经过几个步骤，要得到较长的肽链就必须每步都有较高的产率。如果每一步反应产率都是90% ，那么 30 次反应后总产率只有4.24%。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 21 页保护基必须在接肽时起保护作用，在接肽后容易除去，又不
37、引起肽键断裂。最常用的氨基保护基 Y是苄氧甲酰基，可用催化加氢或用金属钠在液氨中处理除去。其他还有三苯甲基、叔丁氧甲酰基等，可用稀盐酸或乙酸在室温下除去。羧基保护基Z 通常用烷基，如乙基，可在室温下皂化除去。如用苄基，可用催化加氢除去。肽键不能自发形成，常用缩合剂促进肽键形成。接肽用的缩合剂最有效的是N,N- 二环己基碳二亚胺 (DC CI) 。DCCI从两个氨基酸分子中夺取一分子水，自身变为不溶的N,N- 二环己基脲，从反应液中沉淀出来，可过滤除去。接肽反应除用缩合剂以外，还可用分别活化参加形成肽键的羧基和氨基的方法。羧基活化可用叠氮化物法和活化酯法对硝基苯酯等；氨基活化一般不需特殊手段，通
38、常在接肽时加入有机碱，如三乙胺，保证氨基在自由状态即可。近年来固相多肽合成迅速发展。在固相合成中，肽链的逐步延长是在不溶的聚苯乙烯树脂小圆珠上进行的。合成多肽的羧基端先和氯甲基聚苯乙烯树脂反应，形成苄酯。第二个氨基酸的氨基用叔丁氧甲酰基保护后，以 DCCI为缩合剂， 接在第一个氨基酸的氨基上。重复这个方法，可使肽链按一定顺序延长。最后把树脂悬浮在无水三氟乙酸中，通入干燥HBr，使多肽与树脂别离， 同时除去保护基。 整个合成过程现在已经可以在自动化固相多肽合成仪上进行。平均合成每个肽键只需三小时。此法可用于医药工业。人工合成的催产素没有混杂的加压素，比提取的天然药品好。已经成功合成含124 个残
39、基的蛋白。第四节蛋白质的高级结构蛋白质的多肽链并不是线形伸展的，而是按一定方式折叠盘绕成特有的空间结构。蛋白质的三维构象， 也称空间结构或高级结构，是指蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列、分布及肽链的走向。高级结构是蛋白质表现其生物功能或活性所必须的，包括二级、三级和四级结构。 Primary structure, secondary, tertiary, quaternary structure 一、有关概念1. 构型 configration与构象 conformation 构型指立体异构体中取代原子或基团在空间的取向，构型的改变必须通过共价键的断裂。构象是指这些取代基团当单键旋转时
40、可能形成的不同的立体结构，构象的改变不涉及共价键的改变。2. 二面角因为肽键不能自由旋转，所以肽键的四个原子和与之相连的两个碳原子共处一个平面，称肽平面。 肽平面内的C=O与 N H呈反式排列， 各原子间的键长和键角都是固定的。肽链可看作由一系列刚性的肽平面通过碳原子连接起来的长链，主链的构象就是由肽平面之间的角度决定的。主链上只有碳原子连接的两个键是单键，可自由旋转。绕C N1旋转的角称，而绕C C2旋转的角称。这两个角称为二面角。规定当旋转键两侧的肽链成顺式时为 0 度。取值范围是正负180 度，当二面角都是180 度时肽链完全伸展。由于空间位阻，实际的取值范围是很有限的。二、二级结构一二
41、级结构是肽链的空间走向蛋白质的二级结构是指肽链主链的空间走向折叠和盘绕方式 ，是有规则重复的构象。肽链主链具有重复结构，其中氨基是氢键供体，羰基是氢键受体。通过形成链内或链间氢键可以使肽链卷曲折叠形成各种二级结构单元。复杂的蛋白质分子结构，就由这些比较简单的二级结构单元进一步组合而成。二肽链卷曲折叠形成四种二级结构单元1. 螺旋 ( -helix) 螺旋模型是Pauling和 Corey 等研究 - 角蛋白时于1951 年提出的。角蛋白是动物的不溶性纤维状蛋白，是由动物的表皮衍生而来的。它包括皮肤的表皮以及毛发、鳞、羽、甲、蹄、角、丝等。角蛋白可分为两类，一类是角蛋白，胱氨酸含量丰富，精选学习
42、资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 21 页如角、甲、蹄的蛋白胱氨酸含量高达22；另一类是角蛋白，不含胱氨酸，但甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的含量很高，蚕丝丝心蛋白就属于这一类。角蛋白，如头发，暴露于湿热环境中几乎可以伸长一倍，冷却干燥后又收缩到原来长度。角蛋白则无此变化。角蛋白的X射线衍射图案极其相似，沿长轴方向都有一个大周期结构或重复单位，其长度为 5埃。Pauling等考虑到肽平面对多肽链构象的限制作用，设计了多肽链折叠的各种可能模型，发现其中一种螺旋模型能很好地说明角蛋白的X 射线衍射图案中的5埃重复单位。在这个模型中，每隔个氨基
43、酸残基螺旋上升一圈，相当于向上平移埃。螺旋的直径是11埃。螺旋上升时，每个氨基酸残基沿轴旋转100，向上平移埃，比完全伸展的构象压缩倍。这与衍射图案中的小周期完全一致。其二面角 =-57 度，=-48 度。在螺旋中氨基酸残基的侧链伸向外侧，相邻的螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向几乎与中心轴平行。氢键是由肽键中氮原子上的氢与其N端第四个羰基上的氧之间形成的。螺旋的结构允许所有的肽键都参与链内氢键的形成，因此相当稳定。 - 螺旋由氢键构成一个封闭环，其中包括三个残基，共 13 个原子，称为n=3螺旋。由 L 型氨基酸构成的多肽链可以卷曲成右手螺旋，也可卷曲成左手螺旋，但右手螺旋比较稳定。因为在左手
44、螺旋中碳与羰基过于接近，不稳定。在天然蛋白质中，几乎所有螺旋都是右手螺旋。只在嗜热菌蛋白酶中发现一圈左手螺旋。在角蛋白中，3 或 7 个螺旋可以互相拧在一起，形成三股或七股的螺旋索，彼此以二硫键交联在一起。螺旋不仅是角蛋白的主要构象，在其他纤维蛋白和球状蛋白中也广泛存在，是一种常见的二级结构。螺旋是一种不对称的分子结构，具有旋光能力。螺旋的比旋不等于其中氨基酸比旋的简单加和，因为它的旋光性是各个氨基酸的不对称因素和构象本身不对称因素的总反映。天然螺旋的不对称因素引起偏振面向右旋转。利用螺旋的旋光性，可以测定它的相对含量。一条肽链能否形成螺旋，以及螺旋的稳定性怎样，与其一级结构有极大关系。脯氨酸
45、由于其亚氨基少一个氢原子，无法形成氢键，而且C N键不能旋转，所以是螺旋的破坏者，肽链中出现脯氨酸就中断螺旋，形成一个结节 。此外，侧链带电荷及侧链基团过大的氨基酸不易形成螺旋，甘氨酸由于侧链太小，构象不稳定，也是螺旋的破坏者。根据各种残基的特性，可以预测蛋白质的二级结构。目前常见的预测方法有Chou-Fasman法、GOR 法、 Lim 法等，都是根据统计信息进行预测的。如果二级结构的预测成功率大于80，就可以用来预测高级结构，但目前只能到达70左右。 Chou-Fasman法比较直观，与二级结构形成的实际过程接近，但成功率不高。Chou-Fasman法根据各个氨基酸在一些已知结构的蛋白质中
46、的表现，按构象参数P( 表示形成螺旋的能力) 由大到小将他们分为六组，依次为：最强的形成者(H) ：Glu、Met、Ala、 Leu 中等的形成者(h) ：Lys、Phe、Gln、 Trp、Ile 、Val 很弱的形成者(I ) ：Asp、His 中立者 (i ) ： Cys、Ser、Thr 、Arg 较弱的破坏者(b) ：Asn、Tyr 最强的破坏者(B) ：Gly、Pro 如肽链中6 个连续的残基中有4 个 h即可形成核心，然后向两侧延伸，遇到四肽破坏者时中止。形成螺旋时有协同性，即一旦形成核心，其它残基就容易加入。2. - 折叠 -pleated sheet - 折叠也叫 - 片层，在
47、- 角蛋白如蚕丝丝心蛋白中含量丰富。 其 X射线衍射图案与- 角蛋白拉伸后的图案很相似。在此结构中， 肽链较为伸展，假设干条肽链或一条肽链的假设干肽段平行排列，相邻主链骨架之间靠氢键维系。氢键与链的长轴接近垂直。为形成最多的氢键，防止相邻侧链间的空间障碍，锯齿状的主链骨架必须作一定的折叠 ( =139, = 135) ，以形成一个折叠的片层。侧链交替位于片层的上方和精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共 21 页下方，与片层垂直。折叠有两种类型，一种是平行式，即所有肽链的氨基端在同一端；另一种是反平行式，即所有肽链的氨基端按正
48、反方向交替排列。从能量上看，反平行式更为稳定。丝心蛋白和多聚甘氨酸是反平行，拉伸角蛋白形成的角蛋白是平行式。反平行式的重复距离是埃两个残基 ，平行式是埃。在丝心蛋白中，每隔一个氨基酸就是甘氨酸，所有在片层的一面都是氢原子；在另一面，侧链主要是甲基，因为除甘氨酸外，丙氨酸是主要成分。如果肽链中侧链过大，并带有同种电荷，则不能形成折叠。拉伸后的角蛋白之所以不稳定，容易复原， 就是因为侧链体积大，电荷高。3. 转角转角使肽链形成约180的回转， 第一个氨基酸的羰基与第四个氨基酸的氨基形成氢键。这种结构在球状蛋白中广泛存在，可占全部残基的1/4 。多位于球状蛋白的外表，空间位阻较小处。又分为型、型与I
49、II型。4. 无规卷曲指没有一定规律的松散肽链结构。此结构看来杂乱无章，但对一种特定蛋白又是确定的，而不是随意的。在球状蛋白中含有大量无规卷曲，倾向于产生球状构象。这种结构有高度的特异性，与生物活性密切相关，对外界的理化因子极为敏感。酶的活性中心往往位于无规卷曲中。除以上常见二级结构单元外，还有其他新发现的结构，如环， 由 10 个残基组成， 象希腊字母。5. 超二级结构相邻的二级结构单元可组合在一起，相互作用，形成有规则，在空间上能识别的二级结构组合体，充当三级结构的构件，称为超二级结构。常见的有三种：由两股或三股右手螺旋彼此缠绕形成的左手超螺旋，重复距离约为140 埃。由于超螺旋，与独立的
50、螺旋略有偏差。：折叠之间由螺旋或无规卷曲连接。：由一级结构上连续的反平行折叠通过紧凑的转角连接而成。包括曲折和回形拓扑。三、蛋白质的三级结构三级结构是指多肽链中所有原子和基团的构象。它是在二级结构的基础上进一步盘曲折叠形成的，包括所有主链和侧链的结构。哺乳动物肌肉中的肌红蛋白整个分子由一条肽链盘绕成一个中空的球状结构，全链共有8 段螺旋，各段之间以无规卷曲相连。在螺旋肽段间的空穴中有一个血红素基团。所有具有高度生物学活性的蛋白质几乎都是球状蛋白。三级结构是蛋白质发挥生物活性所必须的。在三级结构中，多肽链的盘曲折叠是由分子中各氨基酸残基的侧链相互作用来维持的。二硫键是维持三级结构唯一的一种共价键
51、，能把肽链的不同区段牢固地连接在一起，而疏水性较强的氨基酸则借疏水力和范德华力聚集成紧密的疏水核，有极性的残基以氢键和盐键相结合。在水溶性蛋白中，极性基团分布在外侧，与水形成氢键，使蛋白溶于水。这些非共价键虽然较微弱，但数目庞大，因此仍然是维持三级结构的主要力量。较大蛋白的三级结构往往由几个相对独立的三维实体构成，这些三维实体称为结构域。结构域是在三级结构与超二级结构之间的一个组织层次。一条长的多肽链，可先折叠成几个相对独立的结构域，再缔合成三级结构。这在动力学上比直接折叠更为合理。结构域在功能上也有其意义。结构域常有相对独立的生理功能，如一些要分泌到细胞外的蛋白，其信号肽负责使蛋白通过细胞膜
52、就构成一个结构域。此外，还有与残基修饰有关的结构域、与酶原激活有关的结构域等。各结构域之间常常只有一段肽链相连，称为铰链区。铰链区柔性较强，使结构域之间容易发生相对运动，所以酶的活性中心常位于结构域之间。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 21 页小蛋白多由一个结构域构成，由多个结构域构成的蛋白一般分子量大，结构复杂。四、蛋白质的四级结构由两条或两条以上肽链通过非共价键构成的蛋白质称为寡聚蛋白。其中每一条多肽链称为亚基，每个亚基都有自己的一、二、三级结构。亚基单独存在时无生物活性，只有相互聚合成特定构象时才具有完整的生物活
53、性。四级结构就是各个亚基在寡聚蛋白的天然构象中空间上的排列方式。胰岛素可形成二、六聚体，但不是其功能单位，所以不是寡聚蛋白。判断标准是将发挥生物功能的最小单位作为一个分子。最简单的寡聚蛋白是血红蛋白。它是由两条链和两条链构成的四聚体，分子量65000。分子外形近似球状，每个亚基都和肌红蛋白类似。血红蛋白与氧结合时，和链都发生了转动，引起四个亚基间的接触点上的变化。两个亚基相互接近，两个亚基则离开。当酸、热或高浓度的尿素、胍等变性因子作用于寡聚蛋白时，后者会发生构象变化。这种变化可分为两步：首先是亚基彼此解离，然后分开的亚基伸展而成无规线团。如小心处理，可将寡聚蛋白的亚基拆开，而不破坏其三级结构
54、。如血红蛋白可用盐解离成两个半分子，即两个、亚基。当透析除去过量的盐后，分开的亚基又可重新结合而恢复活性。如果处理条件强烈，则亚基的多肽链完全展开。这样要恢复天然构象虽很困难，但有些寡聚蛋白仍可恢复。如醛缩酶经酸处理后，其 4 个亚基完全伸展成无规卷曲，当 pH恢复到 7 左右时， 又可恢复如初。这说明一级结构规定了亚基间的结合方式，四级结构的形成也遵从自我装配 的原则。五、结构举例一纤维状蛋白角蛋白角蛋白是动物的不溶性纤维状蛋白，是由动物的表皮衍生而来的。它包括皮肤的表皮以及毛发、鳞、羽、甲、蹄、角、丝等。角蛋白可分为两类，一类是角蛋白，胱氨酸含量丰富，如角、甲、蹄的蛋白胱氨酸含量高达22；
55、另一类是角蛋白，不含胱氨酸，但甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的含量很高，蚕丝丝心蛋白就属于这一类。角蛋白，如头发，暴露于湿热环境中几乎可以伸长一倍，冷却干燥后又收缩到原来长度。角蛋白则无此变化。头发主要是由角蛋白构成的。三股右手螺旋形成左手超螺旋，称为原纤维，直径2 纳米。原纤维再排列成9 2 的电缆式结构，称为微纤维，直径8 纳米。成百根微纤维结合成不规则的纤维束，称大纤维，直径200 纳米。头发周围是鳞状细胞，中间是皮层细胞。皮层细胞的直径是20 微米，是由许多大纤维沿轴向平行排列而成的。胶原胶原是动物体内含量最丰富的结构蛋白，构成皮肤、骨胳、软骨、肌腱、牙齿的主要纤维成分。胶原共有4 种，结构相
56、似，都由原胶原构成。其一级结构中甘氨酸占1/3 ，脯氨酸、羟脯氨酸和羟赖氨酸含量也较高。赖氨酸可用来结合糖基。原胶原是一个三股的螺旋杆，是由三股特殊的左手螺旋构成的右手超螺旋。这种螺旋的形成是由于大量的脯氨酸和甘氨酸造成的。羟脯氨酸和羟赖氨酸的羟基也参与形成氢键，起着稳定这种结构的作用。羟脯氨酸和羟赖氨酸都是蛋白合成后经羟化酶催化而羟化的。在胶原中每隔2 个残基有一个甘氨酸，只有处于甘氨酸氨基端的脯氨酸才能被羟化。羟化是在脯氨酰羟化酶的催化下进行的，这个酶需要维生素C使其活性中心的铁原子保持亚铁状态。缺少维生素C会使羟化不完全，胶原熔点低，不能正常形成纤维，造成皮肤损伤和血管脆裂，引起出血、溃
57、烂，即坏血病。所以维生素 C又叫抗坏血酸。成纤维细胞合成原胶原的前体，并分泌到结缔组织的细胞外空间，形成超螺旋结构，再经酶切，即成原胶原。原胶原之间平行排列，互相错开1/4 ，构成胶原的基本结构。一个原胶原的头和另一个原胶原的尾之间有40 纳米的空隙，其中填充磷酸钙，即骨的无机成分。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页，共 21 页胶原的特殊的结构和组成使它不受一般蛋白酶的水解，但可被胶原酶水解。在变态的蝌蚪的尾鳍中就含有这种酶。3. 弹性蛋白能伸长到原来长度的几倍，并可很快恢复原来长度。在韧带、血管壁等处含量较大。含 1/3
58、的甘氨酸，脯氨酸和赖氨酸也较多。羟脯氨酸和羟赖氨酸含量很少。弹性蛋白形成的螺旋由两种区段组成，一种是富含甘氨酸、脯氨酸和缬氨酸的左手螺旋，一种是富含丙氨酸和赖氨酸的右手螺旋。赖氨酸之间形成锁链素或赖氨酰正亮氨酸，使链间发生交联，具有很大的弹性。因为锁链素可连接二、三或四条肽链，形成网状结构，所以弹性蛋白可向各个方向作可逆伸展。4. 肌球蛋白和肌动蛋白两种可溶性纤维蛋白，构成肌肉的主要成分。前者构成粗丝，后者构成细丝。细丝沿粗丝的滑动导致肌肉的伸缩，引起肌体动作。这一过程需要其它物质的参与和ATP供能。二球状蛋白1. 肌红蛋白肌肉中用来储存氧。海洋哺乳动物的肌肉中含大量肌红蛋白，因而可长时间潜水
59、。抹香鲸每千克肌肉中含80 克肌红蛋白，比人高10 倍，所以其肌肉呈棕色。分子量 16700，单结构域。由8 段螺旋构成一个球状结构，亲水基团多在外层。血红素辅基位于一个疏水洞穴中，这样可防止其亚铁离子被氧化。亚铁离子与卟啉形成4 个配位键，第五个配位键与93 位组氨酸结合， 空余的一个配位键可与氧可逆结合。其氧合曲线为双曲线。2. 血红蛋白由 4 个亚基构成一个四面体构型，每个亚基的三级结构都与肌红蛋白相似，但一级结构相差较大。 成人主要是HbA ，由两个亚基和两个亚基构成，两个亚基之间有一个DPG 二磷酸甘油酸，它与亚基形成6 个盐键， 对血红蛋白的四级结构起着稳定的作用。因为其结构稳定，
60、所以不易与氧结合。当一个亚基与氧结合后，会引起四级结构的变化，使其它亚基对氧的亲和力增加，结合加快。反之，一个亚基与氧别离后，其它亚基也易于解离。所以血红蛋白是变构蛋白，其氧合曲线是S形曲线，只要氧分压有一个较小的变化即可引起氧饱和度的较大改变。这有利于运输氧，肺中的氧分压只需比组织中稍微高一些，血红蛋白就可以完成运氧工作。第五节蛋白质结构与功能的关系蛋白质多种多样的生物功能是以其化学组成和极其复杂的结构为基础的。这不仅需要一定的结构还需要一定的空间构象。蛋白质的空间构象取决于其一级结构和周围环境，因此研究一级结构与功能的关系是十分重要的。一、蛋白质一级结构与功能的关系一种属差异对不同机体中表
61、现同一功能的蛋白质的一级结构进行详细比较，发现种属差异十分明显。例如比较各种哺乳动物、 鸟类和鱼类等胰岛素的一级结构，发现它们都是由51 个氨基酸组成的，其排列顺序大体相同但有细微差异。不同种属的胰岛素其差异在A 链小环的8、9、10 和 B链 30 位氨基酸残基。 说明这四个氨基酸残基对生物活性并不起决定作用。起决定作用的是其一级结构中不变的部分。有 24 个氨基酸始终不变，为不同种属所共有。如两条链中的6 个半胱氨酸残基的位置始终不变，说明不同种属的胰岛素分子中AB链之间有共同的连接方式，三对二硫键对维持高级结构起着重要作用。其他一些不变的残基绝大多数是非极性氨基酸，对高级结构起着稳定作用
62、。对不同种属的细胞色素C的研究同样指出具有同种功能的蛋白质在结构上的相似性。细胞色素 C广泛存在于需氧生物细胞的线粒体中，是一种含血红素辅基的单链蛋白，由124个残基精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 13 页，共 21 页构成，在生物氧化反应中起重要作用。对100 个种属的细胞色素C的一级结构进行了分析，发现亲缘关系越近，其结构越相似。人与黑猩猩、猴、狗、金枪鱼、飞蛾和酵母的细胞色素C比较，其不同的氨基酸残基数依次为0、1、10、21、 31、44。细胞色素C的氨基酸顺序分析资料已经用来核对各个物种之间的分类学关系，以及绘制进化树。根
63、据进化树不仅可以研究从单细胞到多细胞的生物进化过程，还可以粗略估计各种生物的分化时间。二分子病蛋白质分子一级结构的改变有可能引起其生物功能的显著变化，甚至引起疾病。这种现象称为分子病。突出的例子是镰刀型贫血病。这种病是由于病人血红蛋白链第六位谷氨酸突变为缬氨酸， 这个氨基酸位于分子外表，在缺氧时引起血红蛋白线性凝集，使红细胞容易破裂，发生溶血。血红蛋白分子中共有574 个残基，其中2 个残基的变化导致严重后果，证明蛋白质结构与功能有密切关系。用氰酸钾处理突变的血红蛋白(HbS)，使其 N端缬氨酸的氨基酰胺化，可缓解病情。 因为这样可去掉一个正电荷，与和二氧化碳结合的血红蛋白相似，不会凝聚。现在
64、正寻找低毒试剂用以治疗。三共价修饰对蛋白质一级结构进行共价修饰，也可改变其功能。如在激素调节过程中，常发生可逆磷酸化，以改变酶的活性。四一级结构的断裂一级结构的断裂可引起蛋白质活性的巨大变化。如酶原的激活和凝血过程等。凝血是一个十分复杂的过程。首先是凝血因子XII 被血管内皮损伤处带较多负电荷的胶原激活，然后通过一系列连续反应，激活凝血酶原，产生有活性的凝血酶。凝血酶从纤维蛋白中切除 4个酸性肽段，减少分子中的负电荷，使其变成不溶性的纤维蛋白，纤维蛋白再彼此聚合成网状结构，最后形成血凝块，堵塞血管的破裂部位。根据激活凝血因子X的途径，可分为内源途径和外援途径。前者只有血浆因子参与，后者还有血浆
65、外的组织因子参与，一般是机体组织受损时释放的。内源途径中凝血因子XII 被血管内皮损伤处带较多负电荷的胶原纤维激活，也可被玻璃、陶土、棉纱等异物激活。凝血因子XIIa 激活凝血因子XI，此时接触活化阶段完成，反应转移到血小板外表进行，称为磷脂胶粒反应阶段，产生凝血因子Xa，最终激活凝血酶。最后一个阶段是凝胶生成阶段，产生凝块。二、蛋白质的变构现象高级结构变化对功能的影响有些小分子物质配基可专一地与蛋白质可逆结合，使蛋白质的结构和功能发生变化，这种现象称为变构现象。变构现象与蛋白质的生理功能有密切联系。如血红蛋白在运输氧气时，就有变构现象发生。血红蛋白是四聚体，每个亚基含一个血红素辅基。血红素中
66、的二价铁原子能与氧可逆结合，并保持铁的价数不变。影响血红蛋白氧的饱和百分数的主要因素是氧分压和血液pH值。饱和度与氧分压的关系呈S 形曲线，而单亚基的肌红蛋白则为简单的双曲线。S 形曲线说明，第一个亚基与氧结合后增加其余亚基对氧的亲和力，而第二、第三个亚基与氧结合同样增加剩下亚基对氧的亲和力。第四个亚基对氧的亲和力是第一个亚基的300 多倍。反之，当氧分压降低时，一个氧分子从完全氧和的血红蛋白中解离出来以后，将加快以后的氧分子的释放。血红蛋白在一定的氧分压下，氧的饱和百分数随pH升高而增加。 其原因是当血红蛋白与氧结合时，由于亚基的相互关系改变而发生解离，每结合一分子氧，释放一个质子。pH 对
67、氧 - 血红蛋白的平衡影响称为波尔(Bohr) 效应。由于波尔效应，血红蛋白除运输氧以外，还有缓冲血液 pH值的作用。HbO2+H+CO2=HbH+CO2+O2 氧合曲线也受到温度的影响。温度升高会使P50一半血红蛋白被氧饱和时的氧分压升高，精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 14 页，共 21 页即亲和力减弱。所以鱼类在温度升高时会缺氧，是由于水中氧分压的降低和血红蛋白对氧亲和力的减弱双重作用的结果。氧的 S型曲线结合和波尔效应使血红蛋白的输氧能力到达最高。血红蛋白可在较窄的氧分压范围内完成输氧功能，使机体内氧水平不会发生很大起伏。血
68、红蛋白的变构现象使它具有上述优越性。第六节蛋白质的性质一、蛋白质的分子量测定一根据化学组成测定最低分子量用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量，并假设分子中只有一个这种元素的原子，就可以计算出蛋白质的最低分子量。例如，肌红蛋白含铁0.335%，其最低分子量可依下式计算：最低分子量铁的原子量铁的百分含量100 计算结果为16700，与其他方法测定结果极为接近，可见肌红蛋白中只含一个铁原子。真实分子量是最低原子量的n 倍， n 是蛋白质中铁原子的数目，肌红蛋白n1。血红蛋白铁含量也是 0.335%，最低分子量也是16700，因为含 4 个铁原子，所以n4，因此其真实分子量为66800。有时蛋
69、白质分子中某种氨基酸含量很少，也可用这种方法计算最低分子量。如牛血清白蛋白含色氨酸0.58%，最低分子量为35200，用其他方法测得分子量为69000，所以其分子中含两个色氨酸。最低分子量只有与其他方法配合才能确定真实分子量。二渗透压法在理想溶液中，渗透压是浓度的线性函数，而与溶质的形状无关。所以可用渗透压计算蛋白质的分子量。但是实际的高分子溶液与理想溶液有较大偏差，当蛋白质浓度不大时，可用以下公式计算：M=RT/lim( /C) 其中 R是气体常数 (0.082) ，T 是绝对温度，是渗透压以大气压计，浓度单位是g/L 。测定时需测定几个不同浓度的渗透压，以 /C 对 C作图并外推求出C为零
70、时的 /C 值，带入公式求出分子量。此方法简单准确，与蛋白质的形状和水化程度无关，但要求样品均一，否则测定结果是样品中各种蛋白的平均分子量。三沉降分析法蛋白质在溶液中受到强大离心力作用时，如其密度大于溶液密度，就会沉降。用超速离心机每分钟6 8万转测定蛋白质的分子量有两种方法：沉降速度法和沉降平衡法。1. 沉降速度法离心时， 蛋白质移动， 产生界面， 界面的移动可用适当的光学系统观察和拍照。当离心力与溶剂的摩擦阻力平衡时，单位离心场强度的沉降速度为定值，称为沉降系数。蛋白质的沉降系数常用S20,w 表示介于1 10-13 到 20010-13 秒，110-13 秒称为一个漂浮单位或斯维德贝格单
71、位。蛋白质的沉降系数与分子形状有关，所以测定分子量时还要测定有关分子形状的参数，如扩散系数。可用以下公式计算：M=RTs D(1V ) 其中 D 是扩散系数， V 是蛋白质的偏微分比容，是溶剂的密度。偏微分比容的定义是：当加入 1克干物质于无限大体积的溶剂中时，溶液的体积增量。蛋白质溶于水的偏微分比容约为立方厘米每克。为获得准确结果，s 和 D 的值应外推到无限稀释。其中的R 是气体常数，在采用厘米 . 克 .秒制时，等于107 尔格 / 秒。沉降分析还可鉴定蛋白均一性。纯蛋白只有一个界面，在沉降分析图形上只有一个峰。2. 沉降平衡法在离心过程中， 外围高浓度区的蛋白质向中心扩散，如转速较低，
72、 二者可到达稳定平衡。此时测定离心管中不同区域的蛋白浓度，可按下式计算分子量：M=2RTln(C2/C1) 2(1 V )(x22 x12) 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 15 页，共 21 页其中 C2和 C1是离轴心距离为x2 和 x1 时的蛋白质浓度。沉降平衡法的优点是不需要扩散系数，且离心速度较低800020000 转每分。但要到达平衡常常需要几天时间。四分子排阻层析法层析柱中填充凝胶颗粒，凝胶的网格大小可通过交联剂含量控制。小分子物质可进入网格中，流出慢；大分子被排阻在颗粒外，流经距离短，流出快。此方法较简单，但与分子形
73、状有关。测分子量时，标准蛋白的分子形状应与待测蛋白相同。lgMK1K2 Ve 其中 Ve是洗脱体积，即从加样到出峰时流出的体积，K1和 K2是常数，随实验条件而定。五 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质电泳时的迁移率与其所带净电荷、分子大小和形状有关，加入SDS后，每克蛋白可结合克 SDS ，将原有电荷掩盖，而且使分子变成棒状。由于凝胶的分子筛效应，相对迁移率R与分子量有如下关系：lgM=K1 K2R 其中 K1和 K2 是与试验条件有关的常数。用已知分子量的标准蛋白作标准曲线，即可求出未知蛋白的分子量。有些蛋白不适宜采用这个方法，如带电荷较多的 组蛋白，带较大辅基的糖蛋白，结构特殊的胶原等。二、
74、蛋白质的酸碱性蛋白质是两性电解质，分子中的可解离基团主要是侧链基团，也包括末端氨基和羧基。蛋白质也有等电点， 即所带净电荷为零的pH值。多数蛋白等电点为中性偏酸，约 5 左右。 偏酸的如胃蛋白酶，等电点为1 左右；偏碱的如鱼精蛋白，约为12。蛋白质在等电点时净电荷为零，因此没有同种电荷的排斥，所以不稳定，溶解度最小，易聚集沉淀。同时其粘度、渗透性、膨胀性以及导电能力均为最小。天然球状蛋白的可解离基团大部分可被滴定，因为球状蛋白的极性侧链基团大都分布在分子外表。有些蛋白的部分可解离基团不能被滴定，可能是由于埋藏在分子内部或参与氢键形成。通过滴定发现可解离基团的pK 值与相应氨基酸中很接近，但不完
75、全相同，这是由于受到邻近带电基团的影响。蛋白质的滴定曲线形状和等电点在有中性盐存在的情况下，可以发生明显的变化。这是由于分子中的某些解离基团可以与中性盐中的阳离子如钙、镁或阴离子如氯、磷酸根等相结合，因此观察到的等电点在一定程度上决定于介质中的离子组成。没有其他盐类存在下，蛋白质质子供体解离出的质子与质子受体结合的质子数相等时的pH称为等离子点。 等离子点对每种蛋白质是一个常数。各种蛋白的等电点不同，在同一 pH时所带电荷不同， 在一电场作用下移动的方向和速度也不同，所以可用电泳来别离提纯蛋白质。三、蛋白质的胶体性质蛋白质是大分子，在水溶液中的颗粒直径在1 100 纳米之间， 是一种分子胶体，
76、具有胶体溶液的性质，如布朗运动、丁达尔现象、电泳、不能透过半透膜及吸附能力等。利用半透膜如玻璃纸、火胶棉、羊皮纸等可别离纯化蛋白质，称为透析。蛋白质有较大的外表积，对许多物质有吸附能力。多数球状蛋白外表分布有很多极性基团，亲水性强，易吸附水分子，形成水化层，使蛋白溶于水，又可隔离蛋白，使其不易沉淀。一般每克蛋白可吸附到克水。分子外表的可解离基团带相同电荷时，可与周围的反离子构成稳定的双电层，增加蛋白质的稳定性。蛋白质能形成稳定胶体的另一个原因是不在等电点时具有同种电荷，互相排斥。因此在等电点时易沉淀。四、蛋白质的变性(denaturation) 1. 定义：精选学习资料 - - - - - -
77、 - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 16 页，共 21 页天然蛋白因受物理或化学因素影响，高级结构遭到破坏，致使其理化性质和生物功能发生改变，但并不导致一级结构的改变，这种现象称为变性，变性后的蛋白称为变性蛋白。二硫键的改变引起的失活可看作变性。能使蛋白变性的因素很多，如强酸、强碱、重金属盐、尿素、胍、去污剂、三氯乙酸、有机溶剂、高温、射线、超声波、剧烈振荡或搅拌等。但不同蛋白对各种因素的敏感性不同。2. 表现：蛋白质变性后分子性质改变，粘度升高，溶解度降低，结晶能力丧失，旋光度和红外、紫外光谱均发生变化。变性蛋白易被水解，即消化率上升。同时包埋在分子内部的可反应基团暴露
78、出来，反应性增加。蛋白质变性后失去生物活性，抗原性也发生改变。这些变化的原因主要是高级结构的改变。氢键等次级键被破坏，肽链松散，变为无规卷曲。由于其一级结构不变，所以如果变性条件不是过于剧烈，在适当条件下还可以恢复功能。如胃蛋白酶加热至80 90时，失去活性，降温至37，又可恢复活力，称为复性renaturation 。但随着变性时间的增加，条件加剧、 变性程度也加深，就到达不可逆的变性。3. 影响因素1) 温度：多数酶在60以上开始变性，热变性通常是不可逆的，少数酶在pH6以下变性时不发生二硫键交换，仍可复性。多数酶在低温下稳定，但有些酶在低温下会钝化，其中有些酶的钝化是不可逆的。如固氮酶的
79、铁蛋白在01下 15 小时就会失活一个可能的原因是寡聚蛋白发生解聚如TMV的丙酮酸羧化酶。2)pH：酶一般在pH 410 范围较稳定。当pH超过 pK 几个单位时，一些蛋白内部基团可能会翻转到外表，造成变性。如血红蛋白中的组氨酸在低pH下会出现在外表。3) 有机溶剂：能破坏氢键，削弱疏水键，还能降低介电常数，使分子内斥力增加，造成肽链伸展、变性。4 胍、尿素等：破坏氢键和疏水键。硫氰酸胍比盐酸胍效果好。5) 某些盐类：盐溶效应强的盐类，如氯化钙、硫氰酸钾等，有变性作用，可能是与蛋白内部基团或溶剂相互作用的结果。6) 外表活性剂：如SDS-、CTAB+ 、triton等，triton因为不带电荷
80、，所以比较温和，经常用来破碎病毒。4. 变性蛋白的构象胍和尿素造成的变性一般生成无规卷曲，如果二硫键被破坏，就成为线性结构。胍的变性作用最彻底。热变性和酸、碱造成的变性经常保留部分紧密构象，可被胍破坏。高浓度有机溶剂变性时可能发生螺旋度上升，称为重构造变性。5. 复性根据蛋白质结构与变性程度和复性条件不同，复性会有不同结果。有时可以完全复性，恢复所有活力；有时大部分复性，但保留异常区；有些蛋白结构复杂，有多种折叠途径，假设无适当方法，会生成混合物。6. 变性的防止和利用研究蛋白质的变性，可采取某些措施防止变性，如添加明胶、树胶、酶的底物和抑制剂、辅基、金属离子、盐类、缓冲液、糖类等，可抑制变性
81、作用。但有些酶在有底物时会降低热稳定性。有时有机溶剂也可起稳定作用，如猪心苹果酸脱氢酶，在25下保温30 分钟，酶活为 50；加入70甘油后，经同样处理，活力为109。变性现象也可加以利用，如用酒精消毒，就是利用乙醇的变性作用来杀菌。在提纯蛋白时，精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 17 页，共 21 页可用变性剂除去一些易变性的杂蛋白。工业上将大豆蛋白变性，使它成为纤维状，就是人造肉。五、蛋白质的颜色反应蛋白质中的一些基团能与某些试剂反应，生成有色物质，可作为测定根据。常用反应如下：1. 双缩脲反应双缩脲是有两分子尿素缩合而成的化合物
82、。将尿素加热到180，则两分子尿素缩合，放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应生成红紫色络合物，称为双缩脲反应。蛋白质中的肽键与之类似，也能起双缩脲反应，形成红紫色络合物。此反应可用于定性鉴定，也可在540nm比色，定量测定蛋白含量。2. 黄色反应含有芳香族氨基酸特别是酪氨酸和色氨酸的蛋白质在溶液中遇到硝酸后，先产生白色沉淀，加热则变黄，再加碱颜色加深为橙黄色。这是因为苯环被硝化，产生硝基苯衍生物。皮肤、毛发、指甲遇浓硝酸都会变黄。3. 米伦反应米伦试剂是硝酸汞、亚硝酸汞硝酸和亚硝酸的混合物，蛋白质加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后变成红色。酚类化合物有此反应，酪氨酸及含酪氨酸的化合
83、物都有此反应。4. 乙醛酸反应在蛋白溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会出现紫色环，凡含有吲哚基的化合物都有此反应。不含色氨酸的白明胶就无此反应。5. 坂口反应精氨酸的胍基能与次氯酸钠或次溴酸钠 及萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色物质。此反应可用来鉴定含精氨酸的蛋白质，也可定量测定精氨酸含量。6. 费林反应 Folin-酚酪氨酸的酚基能复原费林试剂中的磷钼酸及磷钨酸，生成蓝色化合物。可用来定量测定蛋白含量。它是双缩脲反应的发展，灵敏度高。六、蛋白质的别离提纯一选材及预处理1. 选材主要原则是原料易得，蛋白含量高。蛋白质的主要来源包括动物、植物和微生物。由于种属差异及培养条件
84、和时间的差异，其蛋白含量可相差很大。植物细胞含纤维素，坚韧，不易破碎，且多含酚类物质，易氧化产生有色物质，难以除去。其液泡中常含有酸性代谢物，会改变溶液的pH。微生物因为容易培养而常用，但也需要破碎细胞壁。动物细胞易处理，但不经济。2. 细胞破碎如目的蛋白在细胞内，需要进行细胞破碎，使蛋白释放出来。动物细胞可用匀浆器、组织捣碎机、超声波、丙酮干粉等方法破碎。植物可用石英砂研磨或纤维素酶处理。微生物的细胞壁是一个大分子，破碎较难。有超声振荡、研磨、高压、溶菌酶、细胞自溶等方法。3. 抽提一般用缓冲液保持pH。可溶蛋白常用稀盐提取，如。脂蛋白可用稀SDS或有机溶剂抽提，不溶蛋白用稀碱处理。抽提的原
85、则是少量多次。要注意防止植物细胞液泡中的代谢物改变pH，可加入碱中和； 为防止酚类氧化可加5mMol/L 维生素 C 。加 DFP或碘乙酸可抑制蛋白酶活力，防止蛋白被水解。二粗提主要目的是除去糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白，并将蛋白浓缩。常用以下方法：1. 沉淀法核酸沉淀剂：MnCl2、硫酸鱼精蛋白、链霉素、核酸酶等蛋白沉淀剂：醋酸铅、单宁酸、SDS等，也可除多糖，沉淀后应迅速盐析除去沉淀剂，以免目的蛋白变性。选择变性：用加热、调节pH 或变性剂选择性地变性杂蛋白。如提取胰蛋白酶或细胞色素C精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 18 页，共
86、 21 页时，因其稳定性高，可用三氯乙酸处理，使杂蛋白变性沉淀。2. 分级法常用盐析或有机溶剂分级沉淀蛋白。3. 除盐和浓缩盐析后样品中含大量盐类，应透析除去。也可用分子筛，如Saphadex G25层析除盐。如样品过稀，可用反透析、冻干、超滤等方法浓缩。三精制以上方法得到的制剂可供工业应用。如需高纯样品，应精制。常用方法有各种层析、电泳、等电聚焦、结晶等。蛋白结晶不等于无杂质，但变性蛋白不能结晶，所以可说明其具有生物活性。本章考点本 章 名 词 解 释氨基酸 amino acid ：是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物，氨基一般连在- 碳上。必需氨基酸essential amino
87、acid ：指人或其它脊椎动物赖氨酸，苏氨酸等自己不能合成，需要从食物中获得的氨基酸。非必需氨基酸nonessential amino acid ：指人或其它脊椎动物自己能由简单的前体合成不需要从食物中获得的氨基酸。等电点 pI,isoelectric point ：使分子处于兼性分子状态，在电场中不迁移分子的静电荷为零的pH值。茚三酮反应 ninhydrin reaction ：在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色与脯氨酸反应生成黄色化合物的反应。肽键 peptide bond: 一个氨基酸的羧基与另一个的氨基的氨基缩合，除去一分子水形成的酰氨键。肽 peptide :两个或两个以上
88、氨基通过肽键共价连接形成的聚合物。蛋白质一级结构primary structure ：指蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序。层析 chromatography : 按照在移动相和固定相可以是气体或液体之间的分配比例将混合成分分开的技术。离子交换层析ion-exchange column使用带有固定的带电基团的聚合树脂或凝胶层析柱透析 dialysis ：通过小分子经过半透膜扩散到水或缓冲液的原理，将小分子与生物大分子分开的一种别离纯化技术。凝胶过滤层析gel filtration chromatography ：也叫做分子排阻层析。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小别离蛋白质或其它分子
89、混合物的层析技术。亲合层析 affinity chromatograph ：利用共价连接有特异配体的层析介质，别离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白质或其它分子的层析技术。高压液相层析 HPLC ：使用颗粒极细的介质，在高压下别离蛋白质或其他分子混合物的层析技术。凝胶电泳 gel electrophoresis ：以凝胶为介质，在电场作用下别离蛋白质或核酸的别离纯化技术。SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳 SDS-PAGE ：在去污剂十二烷基硫酸钠存在下的聚丙烯酰氨凝胶电泳。 SDS-PAGE 只是按照分子的大小，而不是根据分子所带的电荷大小别离的。等电聚胶电泳IFE ：利用一种特殊的缓冲液两性电
90、解质在聚丙烯酰氨凝胶制造一个pH精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 19 页，共 21 页梯度，电泳时，每种蛋白质迁移到它的等电点pI 处，即梯度足的某一pH时，就不再带有净的正或负电荷了。双向电泳 two-dimensional electrophorese ：等电聚胶电泳和SDS-PAGE 的组合，即先进行等电聚胶电泳按照pI 别离，然后再进行SDS-PAGE 按照分子大小别离 。经染色得到的电泳图是二维分布的蛋白质图。Edman降解 Edman degradation ：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。N末端氨基酸
91、残基被苯异硫氰酸酯修饰，然后从多肽链上切下修饰的残基，再经层析鉴定，余下的多肽链少了一个残基被回收再进行下一轮降解循环。同源蛋白质 homologous protein ：来自不同种类生物的序列和功能类似的蛋白质，例如血红蛋白。构形 configuration: 有机分子中各个原子特有的固定的空间排列。这种排列不经过共价键的断裂和重新形成是不会改变的。构形的改变往往使分子的光学活性发生变化。构象 conformation):指一个分子中，不改变共价键结构，仅单键周围的原子放置所产生的空间排布。一种构象改变为另一种构象时，不要求共价键的断裂和重新形成。构象改变不会改变分子的光学活性。肽单位 pe
92、ptide unit : 又称为肽基peptide group ，是肽键主链上的重复结构。是由参于肽链形成的氮原子，碳原子和它们的4 个取代成分：羰基氧原子，酰氨氢原子和两个相邻- 碳原子组成的一个平面单位。蛋白质二级结构protein在蛋白质分子中的局布区域内氨基酸残基的有规则的排列。常见的有二级结构有- 螺旋和 - 折叠。二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持的。蛋白质三级结构protein tertiary structure: 蛋白质分子处于它的天然折叠状态的三维构象。三级结构是在二级结构的基础上进一步盘绕，折叠形成的。三级结构主要是靠氨基酸侧链之间的疏水相互作用，氢键
93、，范德华力和盐键维持的。蛋白质四级结构protein quaternary structure: 多亚基蛋白质的三维结构。实际上是具有三级结构多肽亚基以适当方式聚合所呈现的三维结构。- 螺旋 -heliv: 蛋白质中常见的二级结构，肽链主链绕假想的中心轴盘绕成螺旋状，一般都是右手螺旋结构，螺旋是靠链内氢键维持的。每个氨基酸残基第n 个的羰基与多肽链 C端方向的第4 个残基第4+n 个的酰胺氮形成氢键。在古典的右手- 螺旋结构中，螺距为，每一圈含有个氨基酸残基，每个残基沿着螺旋的长轴上升0.15nm. - 折叠 -sheet : 蛋白质中常见的二级结构, 是由伸展的多肽链组成的。折叠片的构象是通
94、过一个肽键的羰基氧和位于同一个肽链的另一个酰氨氢之间形成的氢键维持的。氢键几乎都垂直伸展的肽链，这些肽链可以是平行排列由N到 C方向或者是反平行排列肽链反向排列。- 转角 -turn ：也是多肽链中常见的二级结构, 是连接蛋白质分子中的二级结构-螺旋和 - 折叠 ，使肽链走向改变的一种非重复多肽区，一般含有216 个氨基酸残基。含有 5 个以上的氨基酸残基的转角又常称为环loop 。 常见的转角含有4 个氨基酸残基有两种类型：转角I 的特点是：第一个氨基酸残基羰基氧与第四个残基的酰氨氮之间形成氢键；转角的第三个残基往往是甘氨酸。这两种转角中的第二个残侉大都是脯氨酸。超二级结构super-sec
95、ondary structure: 也称为基元 (motif).在蛋白质中，特别是球蛋白中，经常可以看到由假设干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能识别的二级结构组合体。结构域 domain: 在蛋白质的三级结构内的独立折叠单元。结构域通常都是几个超二级结构单元的组合。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 20 页，共 21 页纤维蛋白 fibrous protein :一类主要的不溶于水的蛋白质，通常都含有呈现相同二级结构的多肽链许多纤维蛋白结合紧密，并为单个细胞或整个生物体提供机械强度，起着保护或结构上
96、的作用。球蛋白 (globular protein):紧凑的，近似球形的，含有折叠紧密的多肽链的一类蛋白质，许多都溶于水。典形的球蛋白含有能特异的识别其它化合物的凹陷或裂隙部位。角蛋白 keratin: 由处于 - 螺旋或 - 折叠构象的平行的多肽链组成不溶于水的起着保护或结构作用蛋白质。胶原蛋白 collagen : 是动物结缔组织最丰富的一种蛋白质，它是由原胶原蛋白分子组成。原胶原蛋白是一种具有右手超螺旋结构的蛋白。每个原胶原分子都是由3 条特殊的左手螺旋螺距0.95nm, 每一圈含有个残基的多肽链右手旋转形成的。疏水相互作用(hydrophobic interaction):非极性分子之
97、间的一种弱的非共价的相互作用。这些非极性的分子在水相环境中具有避开水而相互聚集的倾向。伴娘蛋白 chaperone : 与一种新合成的多肽链形成复合物并协助它正确折叠成具有生物功能构向的蛋白质。伴娘蛋白可以防止不正确折叠中间体的形成和没有组装的蛋白亚基的不正确聚集，协助多肽链跨膜转运以及大的多亚基蛋白质的组装和解体。二硫键 disulfide bond: 通过两个半胱氨酸巯基的氧化形成的共价键。二硫键在稳定某些蛋白的三维结构上起着重要的作用。范德华力 van der Waals force: 中性原子之间通过瞬间静电相互作用产生的一弱的分子之间的力。当两个原子之间的距离为它们范德华力半径之和时
98、，范德华力最强。强的范德华力的排斥作用可防止原子相互靠近。蛋白质变性denaturation: 生物大分子的天然构象遭到破坏导致其生物活性丧失的现象。蛋白质在受到光照，热，有机溶济以及一些变性济的作用时，次级键受到破坏，导致天然构象的破坏，使蛋白质的生物活性丧失。肌红蛋白 myoglobin : 是由一条肽链和一个血红素辅基组成的结合蛋白，是肌肉内储存氧的蛋白质，它的氧饱和曲线为双曲线型。复性renaturation: 在一定的条件下，变性的生物大分子恢复成具有生物活性的天然构象的现象。波尔效应 Bohr effect:CO2 浓度的增加降低细胞内的pH，引起红细胞内血红蛋白氧亲和力下降的现象
99、。血红蛋白 hemoglobin : 是由含有血红素辅基的4 个亚基组成的结合蛋白。血红蛋白负责将氧由肺运输到外周组织，它的氧饱和曲线为S型。别构效应 allosteric effect: 又称为变构效应，是寡聚蛋白与配基结合改变蛋白质的构象，导致蛋白质生物活性丧失的现象。镰刀型细胞贫血病sickle-cell anemia: 血红蛋白分子遗传缺陷造成的一种疾病，病人的大部分红细胞呈镰刀状。其特点是病人的血红蛋白- 亚基 N端的第六个氨基酸残缺是缬氨酸 vol ，而不是下正常的谷氨酸残基(Ghe)。祝大家07 年生物考研取得优异成绩学子 272646652 xuezi003163 21 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 21 页，共 21 页
